ADP-核糖基化調(diào)控精子形成的研究進展

段晨瑩，李 欣，趙俊金，李茹意，趙羚均，郭冠華,4，楊利國，滑國華*，王 棟*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118； 3.全國畜牧總站，北京 100125； 4.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801；5.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070)

人工授精技術的廣泛應用，使奶牛冷凍精液普及率已達95%以上，重點奶源區(qū)更是高達100%[1]，大大提升了優(yōu)良種公畜繁殖效率，提高了奶牛場經(jīng)濟效益。然而，隨著人工授精技術的普及，對優(yōu)良種公畜精液品質(zhì)和數(shù)量的要求也越來越高。研究表明，生產(chǎn)中每管凍精中活精子數(shù)約為1 500～2 000萬個，可獲得約53%的產(chǎn)犢率[2]，即約有47%的凍精產(chǎn)品不能產(chǎn)生后代，除了母牛和輸精技術原因外，精子發(fā)生與變形不充分等精液質(zhì)量問題也嚴重制約了種公畜繁殖力。另外，不孕不育已成為人類關注的焦點，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，大約10%～15%的育齡夫婦不孕不育[3]，其中，因男性因素導致的不育約占40%～50%[4-6]。由此可見，精子形成過程中導致的精液質(zhì)量問題已成為雄性繁殖障礙的主要因素。

精子發(fā)生和精子變形是精子形成中的兩個關鍵生物學過程，是影響雄性(或男性)生育力的關鍵。精原細胞經(jīng)歷了有絲分裂產(chǎn)生精母細胞、精母細胞減數(shù)分裂產(chǎn)生精細胞以及圓形精子細胞變形3個重要階段，最終形成有頭有尾的蝌蚪狀精子[7-9]。這個漫長而有序的過程受到多種因素的嚴格調(diào)控[9]，任何細微錯誤均會導致精子發(fā)生障礙，并產(chǎn)生畸形精子，造成不孕不育，影響家畜繁殖率。研究表明，幾乎90%的男性不育患者都具有不同程度的精子發(fā)生障礙[6,10]，如無精癥、少精癥等。畸形精子超過20%會影響公畜的繁殖力[11]；當正常精子百分率低于4%時，男性不育[12]。即便對于形態(tài)正常的精子，也檢測到了一定比例的不孕不育[5, 13]。深入探索精子形成的分子調(diào)控機制，將促進精子發(fā)生和精子變形調(diào)控技術的研發(fā)，為提高種公畜精液品質(zhì)及產(chǎn)量提供新思路，并為男性不育的診斷和治療提供重要參考。

ADP-核糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications，PTMs)的一個重要類型，在ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(ADP-ribosyl transferases，ARTs)催化下，使蛋白質(zhì)氨基酸殘基發(fā)生可逆性聚/單-ADP-核糖基化，調(diào)控蛋白質(zhì)功能[14]。多項研究表明，ADP-核糖基化可通過調(diào)節(jié)生精細胞蛋白質(zhì)表達，促進斷裂DNA修復、維持基因組穩(wěn)定和染色質(zhì)重塑，調(diào)控細胞增殖與分化和細胞周期等多個生物學事件[15-17]。然而，ADP-核糖基化直到五十多年前才被發(fā)現(xiàn)，Collier團隊和Mandel團隊在細菌毒素中先后鑒定出單-ADP-核糖基(mono-ADP-ribose，MAR)和聚-ADP-核糖基(poly-ADP-ribose，PAR)[18-19]。近年來，ADP-核糖基化對精子形成的作用逐漸被重視，并發(fā)現(xiàn)了聚-ADP-核糖基化和單-ADP-核糖基化兩種修飾類型[14]，本團隊前期研究也發(fā)現(xiàn)其在精子變形中發(fā)揮了重要作用[20]。進一步探索ADP-核糖基化修飾對精子形成的作用，將促進精子形成分子調(diào)控機制的深入研究。

1 ADP-核糖基化概述

ADP-核糖基化是以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)為底物，在ARTs催化下，將ADP-核糖基轉(zhuǎn)移至目標蛋白的ADP-核糖結合結構域。目前，已發(fā)現(xiàn)800多種蛋白含有該結構域，證明了ADP-核糖基化對生命的廣泛意義[21]。ADP-核糖基化可分別由ARTs亞家族聚-ADP-核糖基聚合酶(poly-ADP-ribose polymerases，PARPs)和ecto-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(ecto-ADP-ribosyl transferases，ecto-ARTs)催化，生成高負電荷的PAR或MAR，并將其轉(zhuǎn)移至靶蛋白氨基酸殘基上，完成對目標蛋白的聚/單-ADP-核糖基化修飾，調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白質(zhì)功能。然而，最新酶學證據(jù)表明，PARPs中只有PARP1、PARP2和PARP5a、PARP5b能催化生成PAR[22]，而大多數(shù)成員催化生成MAR，其他PARPs酶活性尚未得到證實[21,23-24]。為此，基于ARTs催化反應產(chǎn)物的不同及其與細菌毒素催化結構域的同源性，Hottiger等[14, 25]對其重新進行命名，PARPs均與白喉毒素同源，所以命名為白喉毒素樣-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(Diphtheria toxin-like ADP-ribosyl transferases，ARTDs)；ecto-ARTs均與霍亂毒素C2和C3同源，所以命名為霍亂毒素樣-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(Cholera toxin-like ADP-ribosyl transferases，ARTCs)。

目前，已發(fā)現(xiàn)哺乳動物的17個ARTDs亞家族成員，其中，PARP1是首個被發(fā)現(xiàn)且發(fā)揮ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性(約90%)最主要的亞型[22,26]。ARTCs亞家族是一組分子量相對較小、結構相關的細胞外單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，表達于細胞表面或分泌于細胞外[17]。目前，發(fā)現(xiàn)了6種哺乳動物ARTCs(ARTC1、ARTC2.1和ARTC2.2、ARTC3、ARTC4和ARTC5)，其中4種在人上被檢測到，在人ARTC2基因序列中檢測到3個終止密碼子，終止密碼子的過早出現(xiàn)，使其成為無功能的假基因[24,27]。ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶具有DNA損傷修復、染色體分離調(diào)控作用，其在精子發(fā)生中作用的發(fā)現(xiàn)，凸顯了對ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶研究的重要性，也為深入揭示精子發(fā)生機制，提高雄性生殖能力，提供了新思路。

2 ARTDs在精子形成中的作用

2.1 調(diào)節(jié)細胞分裂過程

有絲分裂和減數(shù)分裂是精子形成的兩個重要階段，受到了紡錘體、著絲粒和端粒等亞細胞結構的精細調(diào)節(jié)。紡錘體產(chǎn)生于細胞分裂前初期到末期，主要由微管(通常稱為紡錘絲)構成。紡錘絲通過著絲點(動粒)附著在著絲粒上，在細胞分裂過程中調(diào)控染色體的排列，并協(xié)助將同源染色體或姐妹染色單體分開，均等地分配到子細胞中。這些亞細胞結構功能的任何缺陷，都可能導致染色體分離異常，影響精子質(zhì)量，甚至引起雄性不育[28]。Bub3(budding uninhibited by benzimidazoles 3)是一種紡錘體組裝檢查點(spindle assembly checkpoint，SAC)蛋白，分裂后期開始前在著絲粒短暫積累[29-30]，與BUB1(budding uninhibited by benzimidazoles 1)、BubR1(budding uninhibited by benzimidazole-related 1)形成復合體，行使有絲分裂紡錘體檢查點功能，確保所有染色體都能與紡錘體正確連接，在正常情況下牽引染色體在赤道板正確對齊和準確分離[30]。CENPA、CENPB則是著絲粒的組成性蛋白，對于著絲點的正確組裝和功能十分重要[31-32]。研究表明，PARP1主要在有絲分裂中期和前中期定位于著絲粒，使CENPA、CENPB和Bub3發(fā)生聚-ADP-核糖基化[32-33]，PARP1/PARP2基因缺失小鼠，減數(shù)分裂Ⅰ期染色體分離異常，紡錘體與著絲點的連接也異常[34]。由此推測，ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶PARP1/PARP2直接促進了紡錘體和著絲點的連接，或通過影響CENPA、CENPB功能和Bub3與BUB1、BubR1的相互作用，調(diào)控紡錘體組裝檢查點的功能，確保將紡錘絲組裝到著絲點上，進而影響減數(shù)分裂(圖1)。

而ARTDs家族的PARP5a(tankyrase-1)和PARP5b(tankyrase-2)可能是通過將紡錘絲連接到中心體，并維持其穩(wěn)定性。William團隊發(fā)現(xiàn)，PARP5a/PARP5b與紡錘極蛋白NuMA(nuclear mitotic apparatus)共定位于紡錘極，并使NuMA發(fā)生聚-ADP-核糖基化[35-36]。小分子RNA干擾PARP5a后不影響NuMA定位，但未檢測到NuMA的ADP-核糖基化，很遺憾該試驗沒有進行NuMA功能檢測[35]。聚-ADP-核糖水解酶(poly-ADP-ribose glycohydrolase，PARG)的功能與PARP5a正好相反，可降解NuMA的PAR，研究表明，紡錘體組裝后添加PARG，可使紡錘體極從中心體脫落，并與染色體結合，而組裝前添加PARG則可使紡錘極直接與染色體結合[33,36]，紡錘體組裝異常。據(jù)此推測，PARP5a/PARP5b的聚-ADP-核糖基化與NuMA定位于紡錘極無關，但卻關系到其行使功能(圖1)。產(chǎn)生PAR的ARTDs家族成員對細胞分裂過程中紡錘體功能的調(diào)控至關重要，深入揭示紡錘體結構的ADP-核糖基化調(diào)控機制，將促進對精子發(fā)生機制的探索。

哺乳動物端粒長度具有物種特異性，并能穩(wěn)定遺傳給后代[37]，在生命過程中，染色體端粒會逐漸變短，其對染色體末端的保護能力也將逐漸減弱，縮短到一定程度后將導致染色體降解。端粒DNA結合蛋白TRF1(telomeric repeat binding factor1，TRF1)可抑制端粒酶使端粒變長的作用，從而使其維持在正常長度[38]。PARP1和PARP5a/PARP5b使TRF1發(fā)生聚-ADP-核糖基化[39-40]，過多負電荷的引入使TRF1與端粒DNA靜電互斥增強，減弱了對端粒酶活性的抑制，使端粒長度變長[35]。PARP5a過表達使端粒DNA釋放TRF1，端粒與端粒酶的緊密結合，促進了端粒延長[41]。PARP1和PARP5a/PARP5b通過聚-ADP-核糖基化調(diào)節(jié)端粒長度，維持了染色體穩(wěn)定性。但PARP5a/PARP5b缺乏PARP1所具有的可被DNA損傷激活的DNA結合結構域[39]，其是否能對斷裂DNA鏈進行修復還需進行深入研究。由此推測，聚-ADP-核糖基化的端粒長度調(diào)控作用，可能影響精子發(fā)生，從而影響精液品質(zhì)(圖1)。因此，深入分析精細胞中端粒結構的ADP-核糖基化作用，將為揭示精子發(fā)生機制提供新思路。

2.2 ARTDs對 DNA損傷修復的兩面性

近年來，精子DNA損傷與雄性不育的關系逐漸受到關注，也開拓了通過探索損傷修復機制進行育性恢復的研究思路。研究表明，當DNA片段損傷指數(shù)超過15%時，精液質(zhì)量顯著降低，且DNA損傷指數(shù)越高，精液質(zhì)量越低[42]，甚至造成雄性不育。

圖1 PARPs調(diào)控細胞分裂機制的模式圖Fig.1 Pattern diagram of the mechanism by which PARPs regulate cell division

DNA損傷包括DNA單鏈斷裂(single-stranded break，SSB)和DNA雙鏈斷裂(double-stranded break，DSB)兩種形式。已經(jīng)證明，精子形成過程中可借助PARP途徑通過聚-ADP-核糖基化修復DNA損傷，并且以SSB修復為主[43]。其中，PARP1參與了該途徑80%～90%的DNA損傷修復[43-44]。PARP1是由1 014個氨基酸殘基組成的有催化活性和自修飾活性的蛋白質(zhì)，包含3個重要的結構功能域：N端為含核定位信號(nuclear localisation sequence，NLS)和兩個鋅指結構的DNA結合域(DNA-binding domain，DBD)，C端為自動化修飾結構域(auto-modification domain，AMD)和催化結構域(catalytic domains，CD)[26,45]。正常生理條件下，PARP1的活性較低，DNA損傷時，PARP1借助于NLS靶向細胞核，通過本身的鋅指結構識別斷裂的DNA結構并與之結合[23]，激活C端CD使其與底物NAD+結合，依次將多個NAD+的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移至受體蛋白及PARP1本身的氨基酸殘基，然后PARP1與DNA修復蛋白XRCC1和其他互作蛋白在DNA 斷裂處積累，完成對SSB修復[44-48]。ARTDs中PARP2的催化結構域與PARP1最為相似(相似性69%)，也可被DNA鏈斷裂激活，兩者在DNA損傷修復中的作用也可能相似[45]。然而，PARP1/PARP2對DSB損傷的修復仍不清晰。目前，有兩種關于PARP1/PARP2修復DSB損傷機制的猜測：一種是PARP1/PARP2通過C-NHEJ通路或A-NHEJ通路，調(diào)節(jié)NHEJ因子(non-homologous end joining)參與DSB修復[40]；另一種是PARP1/PARP2通過調(diào)節(jié)SSB修復途徑間接影響DSB修復[15]。這些發(fā)現(xiàn)表明，ARTDs通過調(diào)控DNA損傷修復維持了基因組穩(wěn)定性(圖2)。

適當?shù)腜AR核積累可促進DNA損傷修復，而PAR過度累積則不利于細胞存活。因為DNA大量損傷將使PARP過度激活，造成細胞內(nèi)NAD+過度消耗，ATP的耗竭導致了細胞死亡[49-51]。然而，Andrabi等[52]在檢測過度DNA損傷細胞的PAR水平時發(fā)現(xiàn)，細胞死亡不僅僅是因為PARPs過度激活導致ATP耗竭，很大程度上還取決于PAR的大小和濃度，因為過量的PAR可能造成細胞毒性，而PARG預處理則可大大減少細胞死亡。鑒于PARP產(chǎn)物PAR的兩面性，深入研究過度DNA損傷引起的PAR積累調(diào)控機制，將為促進DNA損傷修復及提高細胞生存能力提供理論指導。

2.3 參與精子細胞核染色質(zhì)重塑

為確保精子順利通過漫長的雌性生殖道到達受精部位，將父本基因組遺傳信息成功傳遞給下一代[53]，DNA結構在TOP2B (DNA topoisomerase II beta，TOP2B)作用下，從超螺旋結構變?yōu)榉浅菪沙趹B(tài)[54]。TOP2B引起短暫的DNA鏈斷裂，瞬間激活PARP1，產(chǎn)生的PAR可幫助修復受損DNA，并因其攜帶負電荷與DNA競爭性結合核心組蛋白和組蛋白H1，使組蛋白從染色體中釋放出來，促使過渡蛋白和魚精蛋白依次取代組蛋白，完成染色質(zhì)重塑，并修復斷裂DNA，然后啟動PARG降解機制，降解PAR[16,54-58]。與PARP1一樣，PARP2也可作用于組蛋白H2，參與染色質(zhì)重塑[45,57](圖3)。如果染色體重塑異常引發(fā)了較高比例的DNA損傷、魚精蛋白交換不足，將會導致雄性生育能力降低[59]。研究表明，哺乳動物精子染色體核蛋白以魚精蛋白為主，組蛋白不足5%[16]。而人類精子組蛋白可達10%～15%，但組蛋白超過25%則會導致不育[60]。通過ADP-核糖基化的嚴格調(diào)控，確保了精子染色質(zhì)重塑準確有序。深入揭示精子染色質(zhì)重塑調(diào)控機理，將有助于改善精液質(zhì)量，提升家畜繁殖效率。

A. PARP1蛋白結構圖；B. 生理及病理條件下PARPs調(diào)控DNA損傷修復機制模式圖A. The protein structure of PARP1; B. Pattern diagram of the PARPs regulating DNA damage repair under physiological and pathological conditions圖2 PARP1蛋白結構及其調(diào)控DNA損傷修復兩面性機制的模式圖Fig.2 Pattern diagram of the PARP1 protein structure and its dual mechanism of regulating DNA damage repair

3 ARTCs在精子形成中的作用

除了ARTD亞家族外，ARTC亞家族也逐漸被發(fā)現(xiàn)，其中，研究較為廣泛的是具有單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的ARTC1和ARTC2，可使α7β1、αLβ2、CD8、CD44等許多細胞表面蛋白和細胞外靶蛋白發(fā)生單-ADP-核糖基化[61]。ARTC1主要在骨骼肌細胞中表達，參與骨骼肌分化和中性粒細胞遷移調(diào)節(jié)[17]，ARTC2主要表達于T細胞，參與免疫調(diào)節(jié)[62]。ARTC3和ARTC4則因缺乏精氨酸特異性催化結構域R-S-EXE，可能不具有單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性[63]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，ARTC3在小鼠圓形精細胞和長形精細胞表達，還在牛的初級精母細胞表達，可能在精子形成過程中發(fā)揮重要作用[20]。ARTC3在人睪丸中表達[61]，與人非梗塞性無精癥[64]和精子減少[65]相關，該基因缺失，可能導致雄性不育[66]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ARTC3在人精母細胞中表達，可能與精母細胞分裂過程和精子發(fā)生有關[66-67]。相對于ARTDs在精子形成過程中的廣泛研究，對ARTCs家族成員功能的研究只是冰山一角，但其在精子形成中的作用不可忽視。對ARTCs在精子發(fā)生中生物學功能的研究任重而道遠，將為解決家畜繁殖障礙和人類雄性不育問題提供新思路。

4 結 語

綜上所述，ARTs家族成員，尤其是ARTDs參與了精子形成多個生物學過程的調(diào)控，可作為治療雄性不育的重要靶點。同時，因為它與雄性生育力的較強相關關系，ARTs有望成為評估雄性生育力的重要指標。但目前關于ARTs參與精子形成的調(diào)控機制只是局部性的、階段性的、碎片化的，對該家族在精子形成過程中調(diào)控機制的深入研究，將有助于提升精子質(zhì)量和生產(chǎn)效率，并為治療雄性不育提供新思路。