基于TCGA在宮頸癌腫瘤微環(huán)境中挖掘免疫療效相關(guān)的預(yù)后基因

吳南昌 王靜 盧東林 韋云寶 盧海娉 何雪芬 陳升才

【摘要】 目的 結(jié)合生物信息學(xué)方法，使用腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中宮頸癌表達譜數(shù)據(jù)，通過ESTIMATE算法分析腫瘤微環(huán)境挖掘有價值的預(yù)測免疫治療療效相關(guān)的預(yù)后基因。

方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載宮頸癌數(shù)據(jù)，運用R軟件ESTIMATE包將宮頸癌基因表達譜數(shù)據(jù)分為高低免疫/高低基質(zhì)評分組，通過limma包計算各組差異基因，最終兩組的交集基因?qū)⒂糜谏娣治觥⒐δ芨患治黾暗鞍谆プ骶W(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。使用R Survival軟件包分析高低免疫/高低基質(zhì)評分組與預(yù)后的關(guān)系，同時使用Wilcox檢驗分析高低免疫/高低基質(zhì)評分組與臨床特征之間的關(guān)系。

結(jié)果 高免疫評分組與預(yù)后呈正相關(guān)（P=0.035）;高基質(zhì)評分組中位總生存期延長，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.391）。高免疫評分組、高基質(zhì)評分組與M分期呈正相關(guān)（P<0.05）。設(shè)定閾值為|log2（FC）|>2且FDR<0.05，共鑒定出485個交集差異基因（上調(diào)475個，下調(diào)10個）。差異基因生存分析顯示157個基因與預(yù)后有關(guān)?；虮倔w分析（GO）和京都基因與基因組百科全書途徑（KEGG）共富集788個基因本體術(shù)語和36條通路（FDR<0.05）。差異基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并利用Cytoscape提取3個關(guān)鍵核心網(wǎng)絡(luò)，共包括66個基因，其中12個也與預(yù)后相關(guān)。

結(jié)論 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析腫瘤微環(huán)境獲得的免疫預(yù)后相關(guān)基因可能是潛在的免疫治療療效預(yù)測的生物標(biāo)志物，值得深入研究。

【關(guān)鍵詞】 宮頸癌;腫瘤微環(huán)境;免疫基質(zhì)評分;ESTIMATE算法;癌癥基因組圖譜

中圖分類號：R737.33?? 文獻標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.01.002

Exploration on prognosis genes related to immunization efficacy based on TCGA in cervical cancer tumor microenvironment

WU Nanchang， WANG Jing， LU Donglin， WEI Yunbao， LU Haiping， HE Xuefen， CHEN Shengcai

（Department of Gynecology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To combine the bioinformatics method and use the Cancer Genome Atlas （TCGA） database cervical cancer expression profile data to analyze the tumor microenvironment by using the ESTIMATE algorithm to explore valuable prognostic genes related to the prediction of immunotherapy efficacy.

Methods Cervical cancer data were downloaded from the TCGA database. The cervical cancer gene expression profile data were divided into high and low immune/high and low matrix score groups by R software ESTIMATE package. The differential genes were calculated by limma package. And the final two sets of intersection genes would be used in survival analysis， functional enrichment analysis， and protein interaction network construction. R Survival package was used to analyze the relationship between the high and low immune/high and low matrix score groups and the prognosis， and the relationship between the high and low immune/high and low matrix score groups and clinical features was analyzed by Wilcox test.

Results The high immune score group was positively correlated with prognosis （P=0.035）; the median overall survival was prolonged in the high matrix score group， but difference was not statistically significant （P=0.391）. The high immune score group and the high matrix score group were positively correlated with M stage （P<0.05）. The threshold was set to |log2（FC）|>2 and FDR<0.05. A total of 485 intersection difference genes were identified （475 up-regulation and 10 down-regulation）. Differential gene survival analysis showed that 157 genes were associated with prognosis.The gene ontology （GO） analysis and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome Pathways （KEGG） enriched 788 gene ontology terms and 36 pathways （FDR<0.05）. The differential gene constructed PPI network and used Cytoscape to extract 3 key core networks， including 66 genes， 12 of which were also associated with prognosis.

Conclusion Immune prognosis-related genes obtained from tumor microenvironment based on TCGA database may be a potential biomarker for predicting the efficacy of immunotherapy， which is worthy of further study.

【Key words】 cervical cancer; tumor microenvironment; immune matrix score; ESTIMATE algorithm; TCGA

宮頸癌是威脅我國女性健康最常見的婦科惡性腫瘤之一。全球每年有超過50萬新發(fā)的宮頸癌患者，約30萬例死于宮頸癌，其發(fā)病率及病死率均居女性惡性腫瘤第4位[1]。手術(shù)為主、放化療為輔的傳統(tǒng)治療對早期宮頸癌治療效果不錯，但對于晚期、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)宮頸癌5年生存率低于20%[2～3]。近年來，免疫治療是腫瘤治療的新手段，其機制是通過重新激活自身的抗腫瘤免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞強且持續(xù)性的殺傷，顯著提高生存時間。免疫治療目前研究最全面的是免疫檢查點抑制劑：其代表藥為程序性死亡蛋白1（PD-1）抑制劑（帕姆單抗），在多種癌癥中被證明有效，但總體客觀有效率僅為20%～30%[4]。目前用于指導(dǎo)免疫治療的分子靶標(biāo)主要局限于程序性死亡蛋白配體1（PD-L1）表達水平、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）[5]、錯配修復(fù)系統(tǒng)缺陷（dMMR）[6]、腫瘤突變負荷（TMB）[7～8]，雖然取得一些進展，但仍存在很大爭議，因此，通過全面分析腫瘤微環(huán)境篩選更合理的分子標(biāo)志物以指導(dǎo)免疫治療顯得尤為重要。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是致癌因素持續(xù)存在刺激基因突變與腫瘤細胞經(jīng)免疫逃逸后形成微環(huán)境的共同結(jié)局[9]。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細胞與腫瘤局部浸潤的免疫細胞、基質(zhì)細胞等共同構(gòu)成的局部病理環(huán)境。既往研究提示，腫瘤微環(huán)境中高免疫、基質(zhì)細胞浸潤水平往往伴隨良好預(yù)后。最近，YOSHIHARA等[10]開發(fā)了一種通過分析腫瘤內(nèi)部免疫和基質(zhì)細胞的特定基因表達特征來計算免疫和基質(zhì)評分進而預(yù)測腫瘤純度的算法。該算法在前列腺癌[11]、乳腺癌[12]和結(jié)腸癌[13]中得到應(yīng)用并被證實有效，然而在宮頸癌領(lǐng)域尚未見報道。本研究利用腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中宮頸癌隊列和ESTIMATE算法衍生的免疫評分[10]，探索了與宮頸癌腫瘤微環(huán)境免疫預(yù)后相關(guān)的基因，為挖掘有價值的預(yù)測免疫治療療效生物標(biāo)志物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 基因表達數(shù)據(jù)集

宮頸癌患者的3級基因表達譜數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)門戶網(wǎng)站（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）。另外，我們還下載了包括年齡、組織學(xué)類型、生存時間和分期等臨床特征信息。下載的數(shù)據(jù)使用ESTIMATE算法來計算免疫評分和基質(zhì)評分[10]。本研究嚴(yán)格遵循TCGA批準(zhǔn)的出版指南，因此不需要倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 差異表達基因分析

所有宮頸癌樣本根據(jù)中位值分為高、低免疫評分組和高、低基質(zhì)評分組后分別進行差異表達計算。將Log2|FC|>2且FDR<0.05設(shè)定為選擇閾值，通過limmar包篩選顯著差異基因，并使用R軟件的pheatmap包生成熱圖。使用Venn包選擇出高、低免疫評分組和高、低基質(zhì)評分組交集的基因。

1.3 生存分析

為表明免疫/基質(zhì)評分以及差異基因與患者預(yù)后之間的關(guān)系，根據(jù)Kaplan-Meier曲線法在R中運行Survival軟件包繪制Kaplan-Meier圖。

1.4 功能分析

為了解差異基因的潛在功能，免疫基質(zhì)組交叉DEG的功能富集分析采用基因本體分析（GO）和京都基因與基因組百科全書途徑（KEGG）。FDR<0.05作為截止值。

1.5 免疫、基質(zhì)評分與臨床特征的關(guān)系

使用Wilcox檢驗分析免疫、基質(zhì)評分與臨床特征之間的關(guān)系，包括T期[（T3 + T4） vs （Tis + T1 + T2）]、N期（N1 vs N0）、M期（M1 vs M0）、FIGO臨床期（ⅠA～ⅡA2 vs ⅡB～ⅣB）、年齡、淋巴血管侵犯（YES vs NO）和腫瘤組織學(xué)分級（G1～2 vs G3～4）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

進一步尋找基因之間的相互作用，利用STRING數(shù)據(jù)庫[14]構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并借助Cytoscape[15]平臺重建，只有包含超過10個節(jié)點的單個網(wǎng)絡(luò)用于進一步分析。計算網(wǎng)絡(luò)的每個節(jié)點的連接程度，然后使用MCODE插件基于拓撲找到簇以定位密集連接的區(qū)域。

2 結(jié)? 果

2.1 差異表達的免疫相關(guān)基因分析

將TCGA數(shù)據(jù)庫307例宮頸癌樣本的表達譜數(shù)據(jù)分成高、低免疫評分組和高、低基質(zhì)評分組，并比較選擇差異表達的免疫相關(guān)基因。高免疫評分組有735個上調(diào)基因，412個下調(diào)基因;高基質(zhì)評分組有1156個上調(diào)基因和20個下調(diào)基因（圖1A、1B）。此外，為提高結(jié)果的可靠程度，韋恩圖顯示，免疫與基質(zhì)變化方向一致的交集差異基因共485個（475個上調(diào)，10個下調(diào)）。見圖1C、1D。

2.2 免疫基質(zhì)評分與臨床特征的關(guān)系

當(dāng)設(shè)定P<0.05時，結(jié)果提示免疫、基質(zhì)評分與M分期有統(tǒng)計學(xué)意義。低免疫、低基質(zhì)腫瘤細胞與轉(zhuǎn)移相關(guān)，高免疫、高基質(zhì)腫瘤細胞不易發(fā)生轉(zhuǎn)移（圖2A、2B）。

2.3 免疫和基質(zhì)評分與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

為了解免疫/基質(zhì)評分是否與患者預(yù)后相關(guān)，根據(jù)307例宮頸癌患者的免疫/基質(zhì)評分分別納入高分組和低分組并構(gòu)建Kaplan-Meier生存曲線。結(jié)果提示，高免疫評分組病例的中位總生存期（overall survival，OS）高于低免疫評分組，免疫評分與OS呈正相關(guān)（P=0.035）;高基質(zhì)評分組較低基質(zhì)評分組中位生存期更長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.391）。見圖2C、2D。

2.4 交叉基因生存分析

485個交叉基因在通過R的Survival進行Kaplan-Meier曲線分析，結(jié)果157個基因與總生存率相關(guān)（P<0.05），其中參與構(gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)的有12個（P<0.05，圖3）被認為是潛在的免疫相關(guān)的預(yù)后基因。

2.5 功能富集分析

GO通路和KEGG共富集788個GO術(shù)語和36條通路（FDR<0.05，如補充S1、S2）。結(jié)果顯示前5條KEGG通路為：細胞因子-細胞因子-受體相互作用、趨化因子信號通路、造血細胞系、原發(fā)性免疫缺陷、細胞黏附分子（圖4A）。前五個GO術(shù)語為：T細胞激活、淋巴細胞活化的調(diào)節(jié)、白細胞-細胞黏附、T細胞活化的調(diào)節(jié)、白細胞-細胞黏附的調(diào)節(jié)（圖4B）。

2.6 PPI核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將485個基因?qū)隨tring并結(jié)合Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，揭示不同基因之間可能存在功能上的互作，包括239個節(jié)點和1267個邊緣。包含15個節(jié)點以上的三個模塊核心網(wǎng)絡(luò)被選出進一步分析（圖5A～C）。模塊A（圖5A）由33個節(jié)點及528個邊緣構(gòu)成，C3AR1、GNG8、GNGT2和FPR2與其他基因緊密關(guān)聯(lián)。模塊B（圖5B）具有18個節(jié)點和141個邊緣，ITGB2、FCER1G和GPR84具有更高的連通度值。模塊C有15個節(jié)點和70個邊緣（圖5C），重要節(jié)點包括CD3E、CD3D和CD3G。3個模塊共包含66個基因，其中12個與預(yù)后密切相關(guān)，提示可以作為免疫相關(guān)的預(yù)后基因。

3 討? 論

除貝伐單抗聯(lián)合化療一線治療外，缺乏有效的二線治療方案是晚期、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者死亡的主要原因。目前，新興的免疫治療在多種實體瘤中取得良好療效，尤其是免疫檢查點（PD-1/PD-L1）抑制劑，包括宮頸癌。KEYNOTE 028（第一階段研究）[16]和KEYNOTE 158（第二階段研究）[17]分別以10 mg/（kg·2W）和200 mg/3W劑量的帕姆單抗評估了復(fù)發(fā)性、轉(zhuǎn)移性宮頸癌，結(jié)果提示帕姆單抗具有持久的抗腫瘤活性和可控制的安全性，F(xiàn)DA于2018年加速批準(zhǔn)帕姆單抗用于化療期間或之后疾病進展且PD-L1陽性的晚期宮頸癌患者。隨后NCCN婦瘤指南指出MSI-H/dMMR/PD-L1陽性的晚期/復(fù)發(fā)和耐藥宮頸癌患者二線用藥推薦使用帕姆單抗。雖然免疫治療在個別晚期宮頸癌收到奇效，但總體有效率僅為10%，尋找更加合適的標(biāo)志物篩選受益人群是急需解決的難題。因此，我們試圖通過研究宮頸癌腫瘤微環(huán)境鑒定可以預(yù)測宮頸癌免疫治療療效的分子靶標(biāo)。本研究下載TCGA數(shù)據(jù)庫宮頸癌307例樣本的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，經(jīng)ESTIMATE算法計算，人為將它們分為高、低免疫評分組和高、低基質(zhì)評分組進行差異表達分析。我們的研究結(jié)果再次證明了腫瘤微環(huán)境免疫及基質(zhì)占比高低與患者預(yù)后相關(guān)，并且最終鑒定了485個基因與宮頸癌腫瘤微環(huán)境免疫顯著相關(guān)。

近年，在直腸癌中建立的免疫評分研究提示，免疫評分高，生存時間長，預(yù)后較好，可作為預(yù)后的獨立影響因素[18]。本研究分析每個樣本免疫和基質(zhì)的評分分別與個體預(yù)后及臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境高免疫、高基質(zhì)評分與良好預(yù)后及腫瘤病理M分期呈正相關(guān)，然而基質(zhì)細胞與預(yù)后無統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果與既往結(jié)論基本一致，進一步說明腫瘤微環(huán)境對腫瘤的惡性增殖、免疫逃逸及逃避凋亡等有促進作用。

將樣本分為高、低免疫評分和高、低基質(zhì)評分的差異基因交集結(jié)果作為最終的免疫相關(guān)基因，通過GO、KEGG分析，結(jié)果顯示大部分基因參與腫瘤微環(huán)境的眾多關(guān)鍵環(huán)節(jié)（圖4），如GO中的T細胞激活、淋巴細胞活化的調(diào)節(jié)、T細胞活化的調(diào)節(jié)及KEGG中細胞因子-細胞因子-受體相互作用、趨化因子信號通路、細胞黏附分子。這與先前的報道一致，即免疫細胞與細胞外基質(zhì)細胞的分子功能在構(gòu)建宮頸癌腫瘤微環(huán)境中有重要作用[19]。

為了進一步確定預(yù)后免疫相關(guān)基因，我們對485個差異基因進行總體生存分析，其中168個與宮頸癌患者的預(yù)后有關(guān)。此外，我們選取了包含節(jié)點大于15個基因的3個PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進一步分析，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中12個核心基因同時具備預(yù)后特征，因此，我們對它們特別感興趣。6個核心基因已經(jīng)被報道（CCL5、CXCL9、CD3D、CD3E、CD8A、IL2RB）參與腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建，甚至影響免疫治療的效果，這表明我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析腫瘤微環(huán)境相關(guān)免疫基因具有重大意義。其余6個基因在腫瘤微環(huán)境領(lǐng)域尚未見報道，包括CD3G、CLEC4C、GNG8、GNGT2、P2RX1、P2RY13，可作為宮頸癌免疫治療潛在的療效評價生物標(biāo)志物。研究表明在b16-f10腫瘤中靶向大自噬/自噬基因becn1/beclin1激活mapk8/jnk-jun/c-jun信號通路并釋放CCL5細胞因子誘導(dǎo)NK細胞浸潤抑制腫瘤生長[20]。ALLEN等[21]在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)Th17細胞可通過IL-17與干擾素γ的協(xié)同作用，刺激CXCL9和CXCL10趨化因子產(chǎn)生，使腫瘤浸潤效應(yīng)T細胞向腫瘤微環(huán)境中募集，進而提高抗腫瘤免疫能力。SHI等[22]通過分析4個肌肉浸潤性膀胱癌（MIBC）公共數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)CD3D/CD4比值在MIBC中是一個穩(wěn)定的獨立預(yù)后因子，高CD3D/CD4比值有較好的生存率，CD4表達明顯高于CD3D提示細胞具有免疫抑制作用，可用于免疫治療療效評估的潛在指標(biāo)。CHEN等[23]基于腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫對軟組織肉瘤（STS）分析，發(fā)現(xiàn)IL-33和ST2的表達水平與CD3E、CD8A和趨化因子的表達水平呈正相關(guān)，提示IL-33/ST2軸可能在1型極化CD8+T細胞的免疫應(yīng)答中起重要作用，提示這些分子可作為免疫治療的預(yù)后標(biāo)志物。ZHU等[24]分析了92例ICC組織中PD-L1表達與CD8+T細胞浸潤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤IFN-γ與PD-L1和CD8A基因表達顯著相關(guān)，此外，用CD8+T細胞分泌的重組IFN-γ刺激HCCC9810和RBE細胞可在體外快速誘導(dǎo)PD-L1的上調(diào)，表明高表達CD8A可能是選擇抗PD-L1/PD-1治療的潛在標(biāo)志物。人類IL-2rβ鏈（IL2RB）基因缺陷是致命的免疫失調(diào)的原因，CAMPBELL等[25]研究采用野生型IL2RB干細胞移植改善了1例患者T淋巴細胞的IL-2反應(yīng)性，為使用IL-2療法治療免疫性疾病和癌癥提供了新觀點。

總之，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫的宮頸癌表達譜數(shù)據(jù)通過ESTIMATE算法得到高低免疫、基質(zhì)評分組，將兩者的交集差異基因進行生存分析、GO及KEGG富集，同時利用String構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，最終提取了一份宮頸癌腫瘤微環(huán)境免疫相關(guān)的預(yù)后基因。腫瘤微環(huán)境由多種因素相互作用，極其復(fù)雜，目前對于免疫治療療效預(yù)測和評估的生物標(biāo)志物有限，準(zhǔn)確篩選獲益人群仍是難題，我們的研究通過分析宮頸癌TME中主要成分免疫、基質(zhì)細胞免疫評分進而獲得免疫相關(guān)的基因列表，它們可能是先前被忽略的潛在有力的免疫治療療效預(yù)測及預(yù)后評估的生物標(biāo)志物，值得進一步全面深入研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-08-03 修回日期：2021-11-16）

（編輯：潘明志）