序列變異對(duì)miR-378生物發(fā)生以及靶標(biāo)關(guān)系的影響

張廷煥 郭宗義 柴捷 潘紅梅 張亮 陳磊 龍熙

（1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 內(nèi)江豬研究所，內(nèi)江 641000；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460）

microRNA（miRNAs）是一類長(zhǎng)度約22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，它的主要功能是作為一種負(fù)調(diào)控因子控制基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)水平，所以miRNAs對(duì)幾乎所有的生物學(xué)過程都有廣泛的調(diào)節(jié)作用［1-2］。在動(dòng)物中，miRNAs具有非常典型的生物發(fā)生過程，首先是由RNA聚合酶II介導(dǎo)的miRNAs位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生miRNAs初級(jí)轉(zhuǎn)錄物（primiRNAs）［3］；其次，pri-miRNAs經(jīng) Drosha 和 DGCR8的復(fù)合酶剪切成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNAs前體轉(zhuǎn)錄本（pre-miRNAs）［4-5］；最后，pre-miRNAs被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中由Dicer酶處理成具有雙鏈結(jié)構(gòu)的成熟miRNAs，其中一條鏈與AGO蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）發(fā)揮生物學(xué)作用，而另一條鏈被快速釋放或降解［6-7］。

可見，miRNAs生物發(fā)生過程受到了多種酶類的精確控制，所以miRNA的任何序列變異都有可能影響其加工過程，進(jìn)而打破基因的調(diào)控平衡，造成機(jī)體生物學(xué)紊亂［8］。而事實(shí)上，已有大量研究報(bào)道了miRNAs的突變對(duì)其發(fā)生、功能等的影響，甚至一些突變直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生。例如，pre-miR-128b的+13位點(diǎn)發(fā)生了A＞G的突變（+13/A＞G），降低了pri-miR-128b的加工效率和成熟體miR-128b的表達(dá)［9］；成熟體miR-125a中一個(gè)單堿基突變影響了pri-miR-125a向pre-miR-125a的加工，降低了miR-125a表達(dá)水平，而且這個(gè)突變與多種癌癥相關(guān)［10］；pri-miR-126的+24/A＞G突變阻礙了pre-miR-126的生成，從而使miR-126的表達(dá)量下降［11］。而種子序列是miRNA與靶基因mRNA結(jié)合發(fā)揮作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，在物種間相對(duì)保守［12］，它的突變則可能引起miRNAs靶標(biāo)關(guān)系的變化，喪失對(duì)靶基因的調(diào)控作用。比如，miR-96種子序列存在G＞A和C＞A的變異，突變使得原本靶基因的表達(dá)水平提升，導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育異常而造成非綜合征型耳聾［13］。

miR-378在體內(nèi)廣泛表達(dá)，對(duì)多個(gè)組織的發(fā)育起著十分重要的作用。在脂肪組織中，miR-378能促進(jìn)脂肪分化［14］，影響脂質(zhì)沉積［15］，同時(shí)還能促進(jìn)棕色脂肪產(chǎn)熱［16］；在肌肉組織中，miR-378能控制骨骼肌分化［17］、心臟的重塑［18］以及心肌細(xì)胞的存活［19］；在肝臟組織中，miR-378能調(diào)控胰島素信號(hào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)［20］；此外，miR-378還在成骨分化、細(xì)胞色素調(diào)控、黃體細(xì)胞凋亡、卵巢雌激素產(chǎn)生以及不同癌細(xì)胞的發(fā)生等［21-22］過程都扮演著關(guān)鍵角色。目前miR-378已經(jīng)具有相當(dāng)程度的研究基礎(chǔ)，但對(duì)于miR-378序列變異研究較少。本文比對(duì)不同豬種miR-378-3p堿基序列，發(fā)現(xiàn)榮昌豬和內(nèi)江豬的群體中擁有2個(gè)相同的變異位點(diǎn)；利用結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件，確定這兩個(gè)位點(diǎn)的突變影響了miR-378的二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能；構(gòu)建miR-378表達(dá)載體驗(yàn)證了突變對(duì)miR-378表達(dá)水平影響；隨后解析了突變對(duì)miR-378靶標(biāo)關(guān)系的作用。本文明確了豬miR-378突變對(duì)其表達(dá)、生物加工過程以及靶基因選擇的影響，為miR-378多態(tài)性研究奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

榮昌豬和內(nèi)江豬血液樣品來自重慶市種豬場(chǎng)；人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；DNA提取試劑盒、Q5超保真DNA聚合酶、T4連接酶和限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；試劑大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10購自博邁德生物公司；蛋白酶K、質(zhì)粒pSilencer 3.1-H1 neo、GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒、GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒均購自Promega公司；miScript II RT試劑盒、miScript SYBR Green PCR 試劑盒購自QIAGEN公司；質(zhì)粒提取試劑盒來自O(shè)mega公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；生物素（Bi）標(biāo)記的miRNA由銳博公司合成；瓊脂糖、DNA marker購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-378基因的擴(kuò)增 從Ensembl數(shù)據(jù)庫（http：//www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index）中下載豬pri-miR-378附近的基因組序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)正反向引物（表1）。以榮昌豬和內(nèi)江豬的DNA為模板，采用 Q5超保真DNA聚合酶對(duì)pri-miR-378進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共50 μL PCR反應(yīng)體系 ：5×reaction buffer 10 μL ；MgCl2（15 mmol）1.5 μL ；dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL ；forward primers（10 μmol/L）2.5 μL ；Reverse primers（10 μmol/L）2.5 μL ；Template DNA（50 ng/μL）2.0 μL ；Q5 highfidelity DNA polymerase 0.5 μL ；加水至 50 μL。采用凝膠電泳確定擴(kuò)增片段的單一性和大小的正確性，再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得pri-miR-378在榮昌豬和內(nèi)江豬中的堿基序列。

表1 pri-miR-378 PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers of pri-miR-378

1.2.2 miR-378二級(jí)結(jié)構(gòu)及其自由能預(yù)測(cè) 采用RNAfold軟件（http：//rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNA WebSuite/RNAfold.cgi）對(duì)pre-miR-378突變前后的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其自由能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 miR-378表達(dá)載體的構(gòu)建 利用1.2.1中擴(kuò)增得到的兩種不同基因型的pri-miR-378目的片段（primiR-378/AA和pri-miR-378/GG），通過膠回收、酶切、純化后，再利用T4連接酶分別與酶切線性化的質(zhì)粒pSilencer 3.1-H1 neo進(jìn)行連接，分別生成含有primiR-378/AA和pri-miR-378/GG的表達(dá)載體pS-miR-378/AA和pS-miR-378/GG，通過測(cè)序確定其序列的正確性。

1.2.4 miR-378、pri-miR-378、pre-miR-378表達(dá)水平驗(yàn)證 將上述1.2.3構(gòu)建的表達(dá)載體pS-miR-378/AA、pS-miR-378/GG以及陰性對(duì)照pSilencer 3.1-H1 neo（pS-Control）分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，每組設(shè)定3個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)染48 h后回收細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Primer 5.0設(shè)計(jì)的定量的引物（表2）分別對(duì)miR-378/AA、miR-378/GG及其對(duì)應(yīng)的初級(jí)前體與前體轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)量分析，Neomycin作為內(nèi)參基因。其中miR-378成熟體反應(yīng)體系：QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix（2×）5 μL，miScript Universal Primer（10×）1 μL，miScript Primer Assay（10×）1 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water 2 μL；反應(yīng) 程 序 ：95℃ 15 min，95℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃30 s，40個(gè)循環(huán)。Pri-miR-378和Pre-miR-378的反應(yīng)體系和程序參考1.2.6。

表2 miR-378 RT-PCR引物Table 2 RT-PCR primers of miR-378

1.2.5 miR-378靶基因預(yù)測(cè)以及功能富集分析 利用在線軟件TargetScan 5.1（http：//www.targetscan.org/vert_50/seedmatch.html） 和 TargetRank（http：//holly wood.mit.edu/targetrank/）分別對(duì)成熟體miR-378不同基因型（miR-378/A和miR-378/G）進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)；然后再利用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）軟件對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析。

1.2.6 miR-378靶標(biāo)關(guān)系驗(yàn)證 采用microRNA pulldown技術(shù)對(duì)候選靶基因（GDF6、Runx1t1、Galnt3和RAB10）進(jìn)行驗(yàn)證。首先合成了3種不同的生物素（Bi）標(biāo)記的miRNA，即實(shí)驗(yàn)組Bi-miR-378/A、Bi-miR-378/G以及陰性對(duì)照Bi-Control。將3種BimiRNA分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，miRNA能與靶基因mRNA結(jié)合，培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞裂解加入磁珠，充分混勻使磁珠與Bi-miRNA相結(jié)合，最終形成磁珠miRNA-mRNA的復(fù)合物，再利用磁力架將復(fù)合物捕獲，再對(duì)其進(jìn)行清洗、洗脫釋放mRNA，隨后利用反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR檢測(cè)GDF6、Runx1t1、Galnt3和RAB10 4個(gè)靶基因的mRNA富集程度，10 μL 反應(yīng)體系 ：GoTaq@qPCR Master Mix（2×）5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 0.2 μL，CXR 0.1 μL，cDNA 1 μL，ddH20 3.5 μL。反應(yīng)程序 ：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)，采用 2-△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)量。RT-PCR所用引物如表3。

表3 miR-378靶基因RT-PCR擴(kuò)增引物Table 3 RT-PCR primers of miR-378 targets

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用Excel 2013進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，用SPSS軟件中的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著分析，使用Publisher2013作圖。

2 結(jié)果

2.1 miR-378序列變異分析

為了探索不同豬種miR-378序列的差異性，我們分別擴(kuò)增出8頭榮昌豬和8頭內(nèi)江豬的miR-378片段（圖1-A），通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在榮昌豬和內(nèi)江豬群體內(nèi)miR-378前體（pre-miR-378）同時(shí)存在兩個(gè)相同位點(diǎn)的A＞G單堿基突變，分別位于其+49和+68位，定義為miR-378/AA型和miR-378/GG型（圖1-B）。

圖1 豬miR-378的擴(kuò)增和測(cè)序Fig.1 Amplification and sequencing of porcine miR-378

隨后利用RNAfold對(duì)miR-378/AA和miR-378/GG的前體結(jié)構(gòu)和自由能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變直接改變了pre-miR-378的二級(jí)結(jié)構(gòu)，+49/A＞G突變使得莖結(jié)構(gòu)上的凸環(huán)顯著變小，而+68/A＞G突變使得A與U連接的氫鍵斷裂，堿基懸掛在末端（圖2-A）；同時(shí)突變還改變了pre-miR-378A的自由能分布，特別是第20位和第50位堿基附近的熵值GG型明顯高于AA型（圖2-B）。

圖2 miR-378結(jié)構(gòu)和能量預(yù)測(cè)Fig.2 Structure and energy prediction of miR-378

2.2 序列變異對(duì)miR-378表達(dá)水平的影響

由于上述突變導(dǎo)致了miR-378的自由能和結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，為了確定它們是否會(huì)影響miR-378的表達(dá)水平，在榮昌豬群體中擴(kuò)增得到pri-miR-378/AA和pri-miR-378/GG片段（圖3-A），分別插入pSilencer 3.1質(zhì)粒中（圖3-B），構(gòu)建兩種初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的過表達(dá)載體（pS-miR-378/AA和pS-miR-378/GG），同時(shí)通過測(cè)序驗(yàn)證了插入片段的序列正確性（圖3-C）。

圖3 miR-378過表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.3 Construction of miR-378 overexpression vector

首先，發(fā)現(xiàn)成熟體miR-378的表達(dá)量在pS-miR-378/AA和pS-miR-378/GG兩組間出現(xiàn)了顯著差異且GG型高于AA型（約2.3倍，P＜0.01），同時(shí)二者均高于pS-Control組（圖4-A），說明序列變異的確改變了miR-378的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變對(duì)miR-378生物發(fā)生過程中哪一步產(chǎn)生影響，設(shè)計(jì)了特殊的引物對(duì)pri-miR-378和pre-miR-378的表達(dá)進(jìn)行了鑒定（圖4-B，表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA型和GG型的pri-miR-378表達(dá)水平?jīng)]有差異（P＞0.05）（圖4-C），但是在pri-miR-378和pre-miR-378兩者的表達(dá)總量上AA型要顯著降低，約占GG型的64%（P＜0.01）（圖4-D），而這兩種轉(zhuǎn)錄本在pS-Control組幾乎不表達(dá)。數(shù)據(jù)表明序列變異并沒有改變pri-miR-378的轉(zhuǎn)錄，然而卻改變了pri-miR-378到pre-miR-378的加工過程。

圖4 miR-378各級(jí)產(chǎn)物表達(dá)量分析Fig.4 Analysis of miR-378 products in expressions

2.3 序列變異對(duì)miR-378靶標(biāo)關(guān)系的影響

其中，上述發(fā)現(xiàn)的+49位A＞G的突變剛好位于豬miR-378成熟體種子序列+5位（圖1-B），屬于miRNAs與靶基因結(jié)合發(fā)揮作用的功能位點(diǎn)（種子序列2-8位）。miR-378成熟體序列以及其種子序列在多個(gè)物種中（豬、人、大鼠、小鼠、牛和羊等）具有高度保守，但人和豬miR-378種子序列+5位都發(fā)生了A＞G突變（圖5-A）。為了探索該變異對(duì)miR-378靶標(biāo)關(guān)系的影響，利用TargetScan和TargetRank兩款軟件分別對(duì)miR-378/A（+5/A）和miR-378/G（+5/G）進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，其中TargetScan分別得到120個(gè)和184個(gè)靶基因，而TargetRank分別得到355個(gè)和726個(gè)靶基因，可見不同軟件得到的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果相差較大。為了得到可信度較高的靶標(biāo)關(guān)系，將這4組靶基因進(jìn)行了多重比對(duì)，如圖5-B、5-C所示，+5/A＞G突變失去的靶基因（Lost_targets）38個(gè)，主要顯著富集在組織組織形態(tài)、RNA剪切調(diào)控、Wnt信號(hào)通路上；因突變獲得的靶基因108個(gè)（Gained_targets），顯著富集在與組織組織形態(tài)、RNA剪切調(diào)控、BMP反應(yīng)、細(xì)胞分化、大腦發(fā)育、肌肉發(fā)育等相關(guān)的通路上；此外突變前后共有的靶基因（Shared_targets）4個(gè)（表4）。

圖5 miR-378靶標(biāo)關(guān)系和功能預(yù)測(cè)Fig.5 Target relationship and function prediction of miR-378

為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變對(duì)于miR-378靶標(biāo)關(guān)系的影響，從表4中挑選了4個(gè)候選靶基因：Runx1t1、Galnt3、GDF6和 RAB10，運(yùn)用 microRNA pull-down技術(shù)對(duì)miR-378靶標(biāo)關(guān)系進(jìn)行了檢驗(yàn)。將帶生物素標(biāo)記（Bi）的miR-378/A、miR-378/G成熟體以及陰性對(duì)照（Bi-Control）分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞48 h后，運(yùn)用磁珠捕獲、清洗miRNA與靶基因mRNA形成的復(fù)合物，隨后洗脫、反轉(zhuǎn)錄，再利用RT-PCR對(duì)上述4個(gè)候選靶基因進(jìn)行富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDF6的富集程度在Bi-miR-378/A和Bi-Control 沒有差異，在Bi-miR-378/G組顯著上升（P＜0.01），說明GDF6的確是+5/A＞G突變后獲得的靶基因（圖6-A）；只有Bi-miR-378/A組的RAB10的富集程度顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），Bi-miR-378/G并沒有出現(xiàn)差異現(xiàn)象，證實(shí)了RAB10是突變后失去的靶基因（圖6-B）；而Runx1t1和Galnt3在Bi-miR-378/A和Bi-miR-378/G組中的富集程度均顯著高于Bi-Control（P＜0.01），證明了突變并未改變Runx1t1和Galnt3與miR-378的靶標(biāo)關(guān)系（圖6-C、D）。上述結(jié)果表明miR-378種子序列的+5/A＞G序列變異的確會(huì)改變靶標(biāo)關(guān)系，但也存在一些靶基因不會(huì)受此突變的影響。

表4 miR-378的靶基因列表Table 4 Target list of miR-378

圖6 miR-378靶基因的富集程度驗(yàn)證Fig.6 Verification of enrichment degree of miR-378 targets

3 討論

序列變異是基因組DNA水平發(fā)生的可遺傳突變，是生物多樣性的基礎(chǔ)，是物種進(jìn)化、分子育種、優(yōu)良性狀選育、人類疾病等研究最為寶貴的遺傳資源。本文在內(nèi)江豬和榮昌豬pre-miR-378序列中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)突變，分別是+49/A＞G和+68/A＞G。其中+68/A＞G的突變是第一次被發(fā)現(xiàn)，且僅存在于內(nèi)江豬和榮昌豬群體中。+49/A＞G的突變已在多個(gè)研究中被報(bào)道［18，23］，在不同豬種進(jìn)化過程中該位點(diǎn)受到了不同程度的人工選擇，本文還發(fā)現(xiàn)人在相同位點(diǎn)也出現(xiàn)了A＞G的突變，進(jìn)一步說明了該位點(diǎn)的重要性。突變往往會(huì)導(dǎo)致miRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能的變化，然而本文中的兩個(gè)位點(diǎn)的變化卻大不相同。+49/A＞G位于pre-miR-378的莖環(huán)上，與pre-miR-126［11］和 pre-miR-15b［24］莖環(huán)上的突變改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能一樣，+49/A＞G突變使得堿基通過氫鍵重新配對(duì)，莖環(huán)變小，結(jié)構(gòu)更緊密，自由能下降，特別是莖環(huán)上+20和+50位附近堿基的熵值明顯降低；而+68/A＞G是首次被發(fā)現(xiàn)位于premiRNAs末端的突變，是pri-miR-378到pre- miR-378加工過程中的剪切位點(diǎn)，雖然未改變?cè)撐稽c(diǎn)的自由能，但它使得pre-miR-378末端氫鍵斷裂，堿基游離，結(jié)構(gòu)變得疏松。

此外，序列變異還能引起miRNAs表達(dá)量的變化，本文發(fā)現(xiàn)+49/A＞G和+68/A＞G改變了premiR-378和成熟體miR-378的表達(dá)水平，而GG型均顯著高于AA型，這與突變?cè)黾恿薽iR-10a［25］、miR-510［8］和 miR-34a［26］等表達(dá)量一致，但也有大量研究報(bào)道突變降低miRNA表達(dá)，比如miR-128b［9］、miR-15b［24］和 miR-890［27］等，暗示 miRNA不同位點(diǎn)的突變對(duì)其表達(dá)變化的影響不盡相同；但pri-miR-378的表達(dá)水平并未發(fā)生改變，說明本文中的兩個(gè)突變不影響miR-378初級(jí)本的正常轉(zhuǎn)錄，只是改變了它到pre-miR-378的生物發(fā)生過程。同時(shí)與miR-125a的 G＞T突變影響與DGCR8的結(jié)合一樣［10］，本文中pre-miR-378的+49突變位點(diǎn)正好位于DGCR8與pri-miRNA結(jié)合區(qū)域，+49/A＞G突變后引起的自由能下降使得其二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，更加有利于DGCR8的結(jié)合效率；同時(shí)+68位點(diǎn)位于premiR-378的末端，屬于Drosha /DGCR8復(fù)合酶的剪切位點(diǎn)，而該位點(diǎn)A＞G突變后雖然自由能未改變，但氫鍵斷裂結(jié)構(gòu)疏松更加有利于復(fù)合酶的剪切效率。所以本文+49和+68的 A＞G突變后對(duì)pri-miR-378到pre-miR-378的加工過程中酶類的結(jié)合和剪切效率都有促進(jìn)作用，從而上調(diào)了pre-miR-378的總量，提升了成熟體miR-378的表達(dá)水平。除此之外，本文還發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組（pS-Control），pri-miR-378、pre-miR-378的相對(duì)表達(dá)量與miR-378之間呈現(xiàn)數(shù)量級(jí)的差異，這是因?yàn)镠EK293細(xì)胞本身具有成熟體miR-378的表達(dá)，而并沒有pri-miR-378、premiR-378的轉(zhuǎn)錄本。

miRNAs最主要的作用方式是通過其5′的2-8位核苷酸序列（種子序列）與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)序列相結(jié)合，但當(dāng)種子序列發(fā)生突變時(shí)，會(huì)造成miRNAs靶基因出現(xiàn)缺失或獲得的情況，比如種子序列突變后使miR-4293失去了90%以上的靶基因，同時(shí)使miR-518d-3p、miR-3622a-5p獲得了大量的靶基因［27］。本文發(fā)現(xiàn) miR-378的 +49/A＞G 正好位于其種子序列第5位（+5/A＞G），其中失去的靶基因38個(gè)而獲得的靶基因108個(gè)。然種子序列的突變所引起的靶標(biāo)關(guān)系變化，必然會(huì)導(dǎo)致機(jī)體生物學(xué)過程的失衡，甚至引起疾病的發(fā)生。miR-184種子序列的突變影響了與INPPL1、ITGB4的靶標(biāo)關(guān)系，從而造成了白內(nèi)障相關(guān)疾病［28］。miR-499種子序列改變了與靶基因Pdcd4的識(shí)別，造成了某些心臟疾病的發(fā)生［29］。而本文發(fā)現(xiàn)+5/A＞G突變后miR-378獲得的和失去的靶基因所富集的生物學(xué)通路也發(fā)生了變化，都單獨(dú)富集在了一些非常重要的通路上。例如，獲得的靶基因在BMP應(yīng)答通路上顯著富集，該通路具有一類結(jié)構(gòu)相似且高度保守的功能蛋白BMPs，它們?cè)趧?dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)，不僅能促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞定向分化成成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育，還能對(duì)脂肪、肝臟、腎臟以及神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)育起重要作用［30-31］。本文通過microRNA pull-down實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了BMPs的成員GDF6（也叫作BMP13）［32］的確是miR-378突變后獲得的靶標(biāo)關(guān)系。而失去的靶基因顯著富集在WNT信號(hào)通路上，此通路在物種進(jìn)化過程中高度保守，在動(dòng)物胚胎早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其他生物過程都具有至關(guān)重要的作用［33-34］，該通路上的關(guān)鍵基因RAB10也被證實(shí)是miR-378突變后失去的靶標(biāo)關(guān)系。除此之外，也存在一些靶基因并不會(huì)受到種子序列突變的影響，本文驗(yàn)證得到了兩個(gè)未發(fā)生變化的靶標(biāo)關(guān)系-Runx1t1和Galnt3，這可能與miRNAs種子序列和mRNA的3′UTR區(qū)完全配對(duì)和部分配對(duì)的結(jié)合方式相關(guān)，這兩種方式miRNAs負(fù)責(zé)的調(diào)控機(jī)制不同，前者miRNAs誘導(dǎo)mRNA降解，而后者則是抑制mRNA的翻譯［35-36］。

4 結(jié)論

本文發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)序列變異改變了miR-378的結(jié)構(gòu)和自由能，影響了miR-378生物發(fā)生過程，提升了miR-378的表達(dá)，同時(shí)造成了靶標(biāo)關(guān)系以及生物學(xué)功能的變化。