高分辨質(zhì)譜庫和特征組分診斷比值法快速鑒別食品中非法添加淫羊藿

吳婉琴，江豐，干國平，范小龍，劉國姣，王彬，高芳，朱松松，張啟恒，宋哲

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075）（2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075）（3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065）（4.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430065）

淫羊藿（Epimedium brevicornuMaxim.）又名短角淫羊藿、仙靈脾等，為小檗科植物淫羊藿屬淫羊藿的干燥葉，屬應(yīng)用歷史悠久的常用補(bǔ)益中藥，其具有益精氣、補(bǔ)腎陽、強(qiáng)心力、堅(jiān)筋骨等功效，可用于治療風(fēng)濕痹痛、筋骨萎軟、陽痿遺精[1，2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿還具有促進(jìn)缺血心肌血管新生、保護(hù)生殖系統(tǒng)、抗腫瘤、治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病等功能[3-9]。依據(jù)衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號）[10]和《食品安全法》第三十八條[11]，淫羊藿在藥品及保健食品中允許添加，但在食品中禁止添加。一些食品生產(chǎn)企業(yè)受利益的驅(qū)動，只顧中藥材功效而忽視其毒性和副作用，在所謂的“食療”、“養(yǎng)生”等食品中違法添加淫羊藿，如宣稱具有補(bǔ)益壯陽的配制酒、代用茶及飲料。在打擊向普通食品違法添加中藥材的行為過程中，監(jiān)管部門執(zhí)法人員只能通過查看產(chǎn)品配料表和到企業(yè)現(xiàn)場巡查等最傳統(tǒng)的方式來判斷食品中是否違法添加中藥材，但往往會因生產(chǎn)企業(yè)不如實(shí)標(biāo)注配料表或生產(chǎn)現(xiàn)場對非法添加的中藥材原料進(jìn)行隱藏等情況，形成監(jiān)管盲區(qū)。因此，食品中非法添加中藥材的鑒別工作在技術(shù)手段上面臨巨大的挑戰(zhàn)。

目前淫羊藿中藥材的鑒別手段，主要有性狀鑒別[12，13]、顯微鑒別[14]、薄層鑒別[15，16]、中藥材特征圖譜[17，18]或指紋圖譜鑒定[19，20]、DNA 條形碼分子鑒定[21-23]等方法，但以上方法均是對中藥材的真?zhèn)舞b別，而對食品中違法添加中藥材的識別和鑒別，從本質(zhì)上可追溯為鑒定其違法添加中藥材的化學(xué)成分，而由于食品原料的多樣性、食品基質(zhì)和加工工藝的復(fù)雜性、加入的中藥材品種未知性等原因，導(dǎo)致所添加的中藥材在食品中可能與中藥材原料中的特征圖譜或指紋圖譜發(fā)生了變化，因而以上幾種鑒別方法不適用于食品中違法添加中藥材的鑒別。

診斷比值（Diagnostic ratio，簡稱DR）是指樣品中某些特定組分之間的比值，它能夠表征不同樣品各自的化學(xué)組成，用于判別兩個樣品來源是否一致[24]。其具有獨(dú)特性和差異性，基本不受外界因素影響或受外界因素影響較小。目前主要運(yùn)用于環(huán)境中污染物溯源鑒別[25-28]、海上溢油的鑒定[24，29，30]、醫(yī)學(xué)疾病診斷[31-34]等領(lǐng)域，在食品領(lǐng)域用于中藥材鑒別暫未見報道。

為了建立一種簡單易行且可靠的鑒別食品中非法添加淫羊藿中藥材的方法，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀構(gòu)建淫羊藿特征組分高分辨質(zhì)譜庫進(jìn)行初步篩查，再選取淫羊藿的6種特征成分（淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I、寶藿苷II）為考察對象，選取常見易非法添加中藥材的食品配制酒、代用茶和飲料為研究對象，于高效液相色譜探索出基于特征組分的診斷比值法確證典型食品中違法添加淫羊藿中藥材的鑒定技術(shù)，構(gòu)建了食品中非法添加淫羊藿確證技術(shù)體系，為食品中淫羊藿非法添加的科學(xué)監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淫羊藿中藥材均購自電商平臺，經(jīng)干國平教授鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.的干燥葉，采用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理后過二號篩得淫羊藿粗粉，置于密封袋中，10批次淫羊藿中藥材編號為 Y1-Y10，待檢測；配制酒樣品、代用茶樣品、飲料樣品，電商平臺；淫羊藿對照藥材，中國食品藥品檢定研究院；淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I、寶藿苷II（純度≥98%），上海源葉生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純），德國Merck公司；甲醇（色譜純），德國Merck公司；甲酸（質(zhì)譜純），美國 Fisher Scientific公司；超純水（電阻率為 18.2 MΩ·cm，25 ℃），美國Millipore公司；其余試劑均為分析純。

Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國Thermo公司；AB Sciex TOF 5600+型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（配備Analyst 1.6工作站、Peak View定性篩查軟件、Library View數(shù)據(jù)庫軟件），美國SCIEX公司；Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2998光電二極管陣列檢測器，美國Waters公司；Allegra X-15R型離心機(jī)，美國Beckman公司；EDAA-2600T型超聲波清洗器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合器，美國TALBOYS公司；ME2002E分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司；0.22 μm有機(jī)系濾膜、水系濾膜，天津津騰公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I、寶藿苷II標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制成淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I濃度為1.0 mg/mL，寶藿苷II濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃環(huán)境中冷藏避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取上述6種標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋并定容，配制成濃度均為0.1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃環(huán)境中冷藏避光保存。

1.2.2 樣品的制備

模擬淫羊藿酒的制備及前處理：稱取淫羊藿中藥材2 g（精確至0.01 g）置于棕色廣口瓶中，準(zhǔn)確加入20 mL 50%乙醇-水溶液，超聲30 min，取出放至室溫，浸提24 h以上。取上清液過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測用。

模擬淫羊藿代用茶的制備及前處理：稱取淫羊藿中藥材2 g（精確至0.01 g）置于具塞離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL甲醇，超聲30 min，取出放至室溫，于4000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測用。

模擬淫羊藿飲料的制備及前處理：稱取淫羊藿中藥材2 g（精確至0.01 g）置于棕色廣口瓶中，加入20 mL 50%乙醇-水溶液，超聲30 min，取出放至室溫，浸提24 h以上。于4000 r/min離心5 min，取上清液于圓底燒瓶，于 40 ℃水浴中減壓濃縮至近干，準(zhǔn)確加入20 mL超純水，超聲10 min，取上清液過0.22 μm水系微孔濾膜，供高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測用。

配制酒：取適量樣品，于4000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測用。

代用茶：準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.01 g）樣品置于具塞離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL甲醇，超聲30 min，取出放至室溫，于4000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm 有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測用。

飲料：取適量樣品，于4000 r/min離心5 min，過0.22 μm水系微孔濾膜，供高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測用。

1.2.3 儀器分析條件

1.2.3.1 HPLC-TOF-MS分析條件

（1）高效液相色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore aQ 色譜柱（150×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，梯度見表1。

表1 流動相梯度程序Table 1 Mobile phase gradient program

（2）TOF/MS工作條件

離子源：電噴霧離子源；正離子掃描模式：電噴霧電壓：5500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：35 psi；霧化氣：55 psi；輔助氣：55 psi；去簇電壓：60 V；碰撞能量：35 V；掃描方式采用全掃描一級質(zhì)譜，質(zhì)量采集范圍100～1000 u；全掃描二級質(zhì)譜，質(zhì)量采集范圍50～1000 u。質(zhì)量數(shù)校正液為10 mmol/L甲酸鈉溶液。

（3）TOF/MS篩查高分辨質(zhì)譜庫篩查條件

鑒別參數(shù)設(shè)置：化合物提取離子流響應(yīng)強(qiáng)度＞100或信噪比S:N＞5，母離子精確分子量和二級碎片質(zhì)量數(shù)偏差設(shè)為±(10×10-6)，保留時間偏差±2.5%；數(shù)據(jù)庫綜合得分設(shè)置：質(zhì)量數(shù)偏差、保留時間偏差、同位素比值、分子式匹配、數(shù)據(jù)庫匹配占比均設(shè)為20%。

1.2.3.2 HPLC-PDA分析條件

色譜柱：Waters Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；檢測波長270 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動相A為甲醇；流動相B為純水，梯度見表2。乙酸銨溶液（0.1%乙酸）三種流動相體系分離效果。采用乙腈-純水作為流動相時，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C出峰較快導(dǎo)致分離度不理想；采用甲醇-20 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）時，6種化合物分離度較好，但是淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C有一定程度拖尾；采用甲醇-純水時，6種目標(biāo)化合物均有良好的分離度和峰形，如圖1所示。故選擇甲醇-純水流動相體系進(jìn)行分析。

表2 流動相梯度程序Table 2 Mobile phase gradient program

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用AB Sciex Library View數(shù)據(jù)庫軟件構(gòu)建目標(biāo)化合物高分辨質(zhì)譜庫，采用AB Sciex Peak View定性篩查軟件對樣品進(jìn)行篩查分析，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5完成繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 HPLC-TOF-MS

正離子掃描模式下，比較考察了乙腈-5 mmol/L乙酸銨和乙腈-0.1%甲酸兩種流動相體系，部分化合物在乙腈-5 mmol/L乙酸銨流動相體系下峰形不佳出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，且峰響應(yīng)較差，故選擇乙腈-0.1%甲酸流動相體系進(jìn)行分析。

為得到更全面的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，設(shè)定全掃描一級質(zhì)譜，質(zhì)量采集范圍100～1000 u，全掃描二級質(zhì)譜，質(zhì)量采集范圍50～1000 u。

2.1.2 HPLC-PDA

比較了甲醇-純水、乙腈-純水和甲醇-20 mmol/L

2.2 淫羊藿特征組分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

自建高分辨質(zhì)譜庫中淫羊藿包括6種特征成分一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級碎片離子譜庫，具體信息見表3。

表3 淫羊藿特征組分信息表Table 3 Information of characteristic components of epimedium

2.3 診斷比值的選取

結(jié)合上述配制酒、代用茶和飲料食品基質(zhì)模擬過程，選用淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I、寶藿苷II 6種特征組分作為研究對象，通過各特征組分兩兩間峰面積的比值作為淫羊藿中藥材特征組分的診斷比值，共計(jì) 15組診斷比值分別為DR1-DR15，如表4所示。

表4 淫羊藿中藥材特征組分的診斷比值編號及描述Table 4 Diagnostic ratio number and description of characteristic components of epimedium

表6 10批次淫羊藿中藥材模擬代用茶的特征組分診斷比值Table 6 Diagnostic ratio of characteristic components in 10 batches of substitutional tea of epimedium

對網(wǎng)購的10批次淫羊藿中藥材樣品按1.2.2過程處理后，各組分的診斷比值如表5～表7所示，在配制酒模擬過程中，朝藿定A與朝藿定B峰面積比值DR1數(shù)值集中在 0.63～0.94區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為12.49%；朝藿定A與淫羊藿苷峰面積比值DR3數(shù)值集中在0.27～0.64區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為29.30%；朝藿定B與淫羊藿苷峰面積比值DR7數(shù)值集中在0.37～0.87區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為35.00%。在代用茶模擬過程中，朝藿定A與朝藿定B峰面積比值DR1數(shù)值集中在 0.60～0.96區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為13.83%；朝藿定A與淫羊藿苷峰面積比值DR3數(shù)值集中在0.26～0.54區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為24.47%；朝藿定B與淫羊藿苷峰面積比值DR7數(shù)值集中在0.35～0.84區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為29.75%。在飲料模擬過程中，朝藿定A與朝藿定B峰面積比值DR1數(shù)值集中在0.61～0.86區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為10.53%；朝藿定A與淫羊藿苷峰面積比值DR3數(shù)值集中在 0.35～0.58區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為18.63%；朝藿定B與淫羊藿苷峰面積比值DR7數(shù)值集中在0.41～0.91區(qū)間，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為26.49%。通過各組診斷比值比較發(fā)現(xiàn)，在配制酒、代用茶和飲料三種模擬體系中，10批次樣品的DR1，DR3，DR7數(shù)值波動相對較小，各樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不高于35.00%，其它12組診斷比值波動區(qū)間較大，可能是由于受淫羊藿藥材產(chǎn)地或采收季節(jié)的不同而造成了診斷比值的波動較大，故初步選擇診斷比值DR1，DR3，DR7作為淫羊藿中藥材鑒別的依據(jù)。

表5 10批次淫羊藿中藥材模擬配制酒的特征組分診斷比值Table 5 Diagnostic ratio of characteristic components in 10 batches of prepared wine of epimedium

表7 10批次淫羊藿中藥材模擬飲料的特征組分診斷比值Table 7 Diagnostic ratio of characteristic components of 10 batches of drink of epimedium

2.4 不同食品基質(zhì)間診斷比值顯著性差異分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對選定的模擬配制酒、代用茶及飲料食品的3組診斷比值DR1、DR3、DR7進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果顯示（見表8）：3種食品基質(zhì)間各組診斷比值均無顯著性差異（p＞0.05），表明所選的3組診斷比值具有一定的穩(wěn)定性，不受樣品基質(zhì)、加工工藝和提取溶劑的干擾，可用于不同食品基質(zhì)中淫羊藿中藥材的鑒別。

表8 配制酒、茶葉和飲料食品的診斷比值方差分析Table 8 Analysis of variance of the diagnostic ratios of prepared wine， substitutional tea and drink

2.5 診斷比值非異常范圍的確定

顯著性差異分析顯示3組診斷比值于不同基質(zhì)間均無顯著性差異，為更全面統(tǒng)一地對不同食品中淫羊藿進(jìn)行鑒別，使方法具有一定的通用性，考慮將3種不同基質(zhì)的各診斷比值進(jìn)行合并，進(jìn)行箱圖繪制如圖2，確定各比值非異常值范圍，診斷比值DR1范圍為0.60～0.96，診斷比值DR3范圍為0.26～0.64，診斷比值DR7范圍為0.35～0.91。

2.6 基于高分辨質(zhì)譜庫和特征診斷比值法對實(shí)際樣品的檢測

對購買的10批次淫羊藿中藥材以及10批次配制酒、10批次代用茶和10批次飲料樣品進(jìn)行篩查分析，10批次淫羊藿中藥材高分辨數(shù)據(jù)均與自建質(zhì)譜庫6種特征組分匹配一致，說明所建立的方法可有效篩查鑒別淫羊藿特征組分，1批次配制酒樣品高分辨數(shù)據(jù)與自建質(zhì)譜庫6種特征組分匹配，推斷該樣品中可能含有淫羊藿。該配制酒樣品靶向篩查結(jié)果如表9所示，配制酒樣品中朝藿定A與標(biāo)準(zhǔn)品朝藿定A碎片離子鏡像圖如圖3所示（圖中上半部分為配制酒樣品中朝藿定A的碎片離子圖，下半部分為標(biāo)準(zhǔn)品朝藿定A的碎片離子圖）。

為進(jìn)一步確證樣品中是否添加淫羊藿，采用特征組分峰面積診斷比值法對樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析。于高效液相色譜采用診斷比值法對該樣品進(jìn)行鑒別確證，檢測出 6種特征組分，其中診斷比值 DR1（朝藿定A/朝藿定B）為0.73，診斷比值DR3（朝藿定A/淫羊藿苷）為0.28，診斷比值DR7（朝藿定B/淫羊藿苷）為0.38，3組診斷比值均在選定的診斷比值非異常值范圍內(nèi)，進(jìn)一步表明該配制酒樣品可能加入淫羊藿中藥材。

目前淫羊藿中藥材的鑒別手段，主要有性狀鑒別、顯微鑒別、薄層鑒別、中藥材特征圖譜或指紋圖譜鑒定、DNA條形碼分子鑒定等方法，研究對象多為單味藥材飲片及復(fù)方制劑，對于食品中淫羊藿的鑒別鮮有報道，由于食品基質(zhì)復(fù)雜且多樣，成分組成繁多，對樣品進(jìn)行分析時相應(yīng)的雜質(zhì)干擾也多，單純的性狀鑒別、顯微鑒別、薄層鑒別、DNA條形碼分子鑒定對于復(fù)雜的食品基質(zhì)中淫羊藿藥材的鑒別已不適用，而中藥材特征圖譜或指紋圖譜由于食品基質(zhì)的干擾，在不同食品基質(zhì)中會發(fā)生一定的變化，定性鑒別存在一定的偏差。對于食品中的淫羊藿的鑒別，要開發(fā)出一種不受不同基質(zhì)影響且定性準(zhǔn)確的方法，高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀通過測定母離子和碎片離子的精密質(zhì)量數(shù)，定性準(zhǔn)確度高，且分析速度快，用于多個化合物的初步篩查具有一定的優(yōu)勢，基于化合物定性準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上，依據(jù)某種中藥材自身特征組分之間不受其他因素影響具有的穩(wěn)定比值即特征組分診斷比值法進(jìn)一步定性，最終構(gòu)建食品中淫羊藿藥材的鑒別方法，所構(gòu)建的方法較其它方法前處理簡便，特征成分和診斷比值不受食品基質(zhì)干擾和影響，可以準(zhǔn)確地用于食品中淫羊藿的定性鑒別。

3 結(jié)論

本研究開發(fā)出一種基于高分辨質(zhì)譜庫和特征組分診斷比值法快速篩查鑒別食品中非法添加淫羊藿中藥材的方法，選取6種特征組分構(gòu)建高分辨質(zhì)譜庫進(jìn)行初步篩查，最終確定穩(wěn)定性較好的朝藿定A與朝藿定B峰面積比值（DR1）、朝藿定A與淫羊藿苷峰面積比值（DR3）、朝藿定B與淫羊藿苷峰面積比值（DR7）3組診斷比值作為鑒別依據(jù)，并考察了特征比值在配制酒、飲料、茶葉普通食品中的顯著性差異，確定了3組診斷比值的非異常范圍，構(gòu)建了食品中淫羊藿中藥材確證技術(shù)體系。該方法簡便快捷、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可以有效地防止食品中淫羊藿中藥材的非法使用，為打擊食品中非法添加淫羊藿違法行為提供技術(shù)方法和依據(jù)。