鰻魚肉粉中氨基甲苯咪唑基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

羅春連

(福建省工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)許可證審查技術(shù)中心，福建 福州 350003)

中國是全球最大鰻魚養(yǎng)殖國，鰻魚產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的80%以上[1]。鰻魚在生長過程中易受寄生蟲感染[2]，這些寄生蟲會影響鰻魚的生理學(xué)和生活史許多特征，甚至導(dǎo)致種群崩潰[3]。甲苯咪唑(Mebendazole，MBZ)是一種苯并咪唑類廣譜抗寄生蟲的合成藥物，通過對蟲體腸細(xì)胞漿微管的摧毀進(jìn)而阻斷細(xì)胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運和吸收[4]，對鉤蟲[5]、蛔蟲[6]、蟯蟲[7]、鞭蟲[8]、線蟲[9]等多種寄生蟲具有良好的驅(qū)除效果，是鰻魚養(yǎng)殖中寄生蟲感染的主要治療藥物[10-11]。但MBZ及其主要代謝產(chǎn)物羥基甲苯咪唑(Hydroxy-mebendazole，MBZ-OH)和氨基甲苯咪唑(Amino-mebendazole，MBZ-NH2)會在動物體內(nèi)殘留且具有生物毒性[12-15]，因此MBZ是動物源性食品獸藥殘留的重要監(jiān)控對象。目前國外多數(shù)國家規(guī)定水產(chǎn)品中MBZ的最大殘留限量為0.1 mg/kg[16]，日本肯定列表對其限量為0.02 mg/kg[17]，美國和加拿大執(zhí)行的最新規(guī)定為0.05 mg/kg。因為中國GB 31650—2019未規(guī)定該獸藥在水產(chǎn)品中的最大殘留限量，據(jù)美國食品藥品管理局(FDA)消息，近年來因烤鰻中頻繁檢出MBZ-NH2，美國對中國多家出口企業(yè)相關(guān)產(chǎn)品實施自動扣留，導(dǎo)致中國鰻魚出口損失較大。

目前，對MBZ的測定只使用純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測[11-12]，難以有效避免樣品基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的干擾[18]。基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種新型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它將目標(biāo)分析物與樣品基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，具有實際樣品特性以及足夠均勻性和穩(wěn)定性特征值，由于其目標(biāo)化合物比基體更接近真實檢測樣品，能夠有效降低檢測過程中的基質(zhì)效應(yīng)，保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，被廣泛用于實驗室質(zhì)量控制工作[19-20]。中國食品類基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究正值起步發(fā)展階段，研制出的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要涉及谷物[21]、水產(chǎn)品[22]、乳制品[23]、茶葉[24]、畜禽肉[25]等，食品類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)覆蓋面窄，與實際需求仍有巨大缺口[26]，且國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺中未發(fā)現(xiàn)鰻魚肉中MBZ及其代謝物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。研究擬以鰻魚肉組織對MBZ及其代謝產(chǎn)物MBZ-OH和MBZ-NH2的代謝規(guī)律為基礎(chǔ)，通過真空冷凍干燥均勻化技術(shù)，制備鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以期為鰻魚制品中MBZ-NH2的量值溯源、分析檢測、質(zhì)量控制、實驗室能力驗證、分析方法的準(zhǔn)確性評估和驗證等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰻魚(Anguillidae)：長樂聚泉食品股份有限公司；

包裝材料：采用雙層平口袋包裝，其中外包裝袋材質(zhì)為鋁箔復(fù)合材料，內(nèi)包裝袋材質(zhì)為聚乙烯；

MBZ、MBZ-OH、MBZ-NH2標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，德國 Dr.Ehremstorfer公司；

乙腈、甲酸、冰乙酸：色譜純，德國Merck公司；

超純水：符合GB 6682—2008 Ⅲ級水標(biāo)準(zhǔn)，實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：Xevo TQ-S型，配有電噴霧離子源，美國Waters公司；

高速冷凍離心機：Allegra V-15R型，美國Beckman Coulter公司；

電動肉丸機：YQ-6型，中國佛山俊凌廚具電器廠；

拍擊均質(zhì)器：stomacher350型，英國Seward公司；

電子分析天平：BSA124S型，德國Sartorius公司；

渦旋振蕩器：VORTEX1型，德國IKA公司；

MCX固相萃取柱：60 mg/3 mL，美國Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 候選物的制備 取適量的獸藥MBZ水劑，用水稀釋后均勻潑灑入池，使魚池中MBZ質(zhì)量濃度約為1 mg/L，靜置過夜；取70條重量約為250 g的鰻魚，暫養(yǎng)在裝有循環(huán)充氣的水箱中，每天換1次水，用藥3 d后停藥，休藥第9天撈出宰殺，去皮、去骨、去內(nèi)臟，取肉部分，混合攪碎，混勻制成鰻魚肉糜。

1.3.2 樣品制備 將鰻魚肉糜進(jìn)行真空冷凍干燥制得凍干鰻魚肉粉，水分含量<5%。凍干粉粉碎、過35目篩，得鰻魚肉粉樣品，用聚乙烯內(nèi)袋及鋁箔復(fù)合袋進(jìn)行真空包裝，最小包裝總單元數(shù)約432袋，每袋8～10 g，貼標(biāo)簽并編號；輻照滅菌(60Co-γ，12 kGy)；于-18 ℃保存。

1.3.3 樣品均勻性與穩(wěn)定性試驗

(1) 均勻性檢驗：按JJF 1343—2012執(zhí)行。

(2) 穩(wěn)定性檢驗：按JJF 1343—2012執(zhí)行。

1.3.4 定值及朔源性 采用郵政網(wǎng)絡(luò)協(xié)同定值[27]，選擇8家具備MBZ及其代謝產(chǎn)物檢測能力的資質(zhì)檢驗機構(gòu)作為協(xié)作定值實驗室，分別用編號L001～L008表示，每個機構(gòu)測定3個樣品，每個樣品獨立重復(fù)測定2次。檢測數(shù)據(jù)的定值與離散性檢驗、不確定度評估方法參照文獻(xiàn)[28]。

1.3.5 MBZ及其代謝產(chǎn)物檢測 準(zhǔn)確稱取1.250 0 g樣品于離心管中，加入3.75 mL超純水充分混勻使其復(fù)原為魚糜，浸泡30 min，參照SN/T 2624—2010對MBZ及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取和凈化，上機檢測。色譜條件為：waters Acquity UPLC C18(1.6 μm, 3 mm×100 mm)；流動相A為5 mmol/L乙酸銨溶液-0.2%甲酸溶液；流動相 B為100%乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～2 min，10%～80% B；2.0～4.5 min，80% B；4.5～6.0 min，80%～10% B；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件為：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式；電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；脫溶劑氣溫度650 ℃，流速800 L/h；毛細(xì)管電壓3.0 kV。其他MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MBZ及其代謝物的主要質(zhì)譜參數(shù)?

2 結(jié)果與分析

2.1 MBZ及其代謝物在鰻魚肉中的代謝規(guī)律及標(biāo)樣的選擇

由圖1可知，鰻魚肉中MBZ及其代謝物含量隨休藥時間的延長先降低后趨于穩(wěn)定；鰻魚肉組織對MBZ和MBZ-OH的降解能力強，自休藥的第4天起已降至極低水平；而MBZ-NH2至休藥的第8天才降至較低水平，且難以被鰻魚肉組織完全降解，從而形成穩(wěn)定的獸藥殘留，因此MBZ-NH2適合被制備為鰻魚肉中的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。為使鰻魚肉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來源穩(wěn)定且不受MBZ和MBZ-OH的干擾，確定休藥后第9天為最佳取樣點。

圖1 鰻魚肉組織中MBZ及其代謝物在休藥后隨時間的變化趨勢

2.2 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

基于MBZ-NH2的代謝規(guī)律，在休藥后第9天進(jìn)行樣品采集和標(biāo)品制備。為保證樣品的均勻性，使用電動肉丸機將鰻魚肉進(jìn)行粉碎，再將粉碎后的魚糜邊攪拌邊進(jìn)行拍擊均質(zhì)。鰻魚含油脂較多，直接以糜樣的形式保存很容易析出油脂而影響目標(biāo)化合物含量，研究采用真空冷凍干燥技術(shù)能夠克服上述缺陷，凍干魚糜粉末復(fù)水性好，且復(fù)溶后的魚漿能極大程度地還原其基體特性。該凍干產(chǎn)品易于水分控制且方便貯藏和運輸。對凍干后的樣品進(jìn)行粉碎，過35目篩，研制好的樣品經(jīng)雙層真空包裝后再進(jìn)行輻照滅菌，所制備的MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能在1年內(nèi)保持無菌狀態(tài)，以滿足長期穩(wěn)定性的考察需求及實際貯藏應(yīng)用需求。

2.3 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的復(fù)水條件優(yōu)化

根據(jù)樣品凍干前后的水分含量，確定復(fù)水質(zhì)量比為1∶3，同時考察了不同稱樣量(0.50，1.00，1.25，1.50 g)、復(fù)水時間(10，20，30，40 min)對MBZ-NH2檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明，1.25 g為最佳稱樣量，30 min為最佳復(fù)水時間，其分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性最好。因此，確定該標(biāo)準(zhǔn)樣品的最小取樣量為1.25 g，復(fù)水比例為1∶3。

2.4 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的上機檢驗

取3份樣本復(fù)水后按SN/T 2624—2010進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)只有MBZ-NH2的檢出值大于其方法定量限，而MBZ和MBZ-OH均未檢出。

由圖2可知，基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的圖譜與標(biāo)品溶液的圖譜高度相似，各離子對的峰形尖銳且無拖尾現(xiàn)象，目標(biāo)峰附近無雜峰干擾，說明基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中MBZ-NH2的定性檢驗并不受鰻魚肉粉中其他物質(zhì)的干擾，進(jìn)一步驗證了取樣點及復(fù)水條件的合理性。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)樣品的選擇離子監(jiān)測色譜圖

2.5 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本屬性

2.5.1 均勻性 隨機抽取12份所制備的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，鰻魚肉粉中MBZ-NH2含量測定結(jié)果以及方差分析結(jié)果見表2。查表得F0.05(12,36)=2.216 3，鰻魚肉粉中MBZ-NH2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的F計算值為2.119 7，F(xiàn)MBZ-NH2

表2 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性方差分析?

2.5.2 穩(wěn)定性 由表3可知，所有樣品均未出現(xiàn)脹袋、霉變、形態(tài)、質(zhì)構(gòu)等方面的異常變化，說明2.2中樣品的制備和包裝方式符合短期貯藏需求；對MBZ-NH2進(jìn)行含量檢測，樣品在暴曬環(huán)境中MBZ-NH2含量下降明顯，F(xiàn)-檢驗表明：在α=0.05顯著水平條件下，F(xiàn)MBZ-NH2=1.300 7

表3 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性檢測結(jié)果?

長期穩(wěn)定性檢驗參照GB 15000.3—2008，即-18 ℃低溫貯藏1年，并在多個時間點跟蹤監(jiān)測MBZ-NH2的含量變化情況，測定結(jié)果見表4。由表4可知，在95%置信區(qū)間內(nèi)，F(xiàn)=0.148 8>0.05，不顯著，說明貯藏時間不影響MBZ-NH2的含量變化，因此認(rèn)為該基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能夠在12個月保持穩(wěn)定。

2.5.3 定值與離群值檢驗 將同批次未拆封的樣品送至8家資質(zhì)檢驗機構(gòu)(8組)進(jìn)行MBZ-NH2含量檢測，結(jié)果見表5。由表5可知，8組數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)異常值，說明8家資質(zhì)檢驗機構(gòu)的檢測結(jié)果數(shù)據(jù)穩(wěn)定；以夏皮洛—威爾克(Shapiro-wilk)檢驗法對8組數(shù)據(jù)的均值進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，計算得W=0.970>W(48，0.95)=0.947，說明檢測數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布；繼續(xù)采用科克倫法檢驗8組數(shù)據(jù)的平均值是否等精度，計算得出C=0.330，滿足CG2(5%，8)=0.110 1，說明8家資質(zhì)檢驗機構(gòu)對鰻魚肉基體中MBZ-NH2檢測結(jié)果無離群值，因此所有單元的數(shù)據(jù)均可參與定值。

表4 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.5.4 不確定度評估 不確定度表征被測量值的分散性，其值大小與測定結(jié)果可信賴程度相關(guān)聯(lián)[29-30]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)統(tǒng)計方法指南規(guī)定，評估合作定制方法得到定值結(jié)果的不確定度，通過測定值標(biāo)準(zhǔn)不確定度、瓶間標(biāo)準(zhǔn)不確定度、長期穩(wěn)定性不確定度的合成并擴展來評定，最終確定MBZ-NH2特性值為(35.3±6.4) μg/kg (k=2)。

表5 協(xié)同定值

3 結(jié)論

對甲苯咪唑休藥第9天時制得的含氨基甲苯咪唑鰻魚肉糜，采用聯(lián)合冷凍干燥、真空包裝和輻射滅菌技術(shù)，研制得鰻魚肉粉中氨基甲苯咪唑自然基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。結(jié)果表明，復(fù)水后該基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)上機檢測效果良好，能夠滿足鰻魚中氨基甲苯咪唑質(zhì)量控制和方法驗證需求，可保證測定結(jié)果的可靠性、可比性和溯源性。根據(jù)鰻魚肌肉組織對甲苯咪唑的代謝特征，未來在甲苯咪唑喂藥過程中使用其代謝抑制劑以及單獨喂藥羥基甲苯咪唑有望分別獲得甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。