分散固相萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定乳制品中8種殺蟲劑

嚴(yán)婉盈 何敏恒 溫 恒 劉志鵬 余志聰

(1. 廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 511447；2. 廣州匯標(biāo)檢測(cè)技術(shù)中心，廣東 廣州 510700；3. 廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東 廣州 510316)

乳制品是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、均衡的食物，富含蛋白質(zhì)、脂肪、多種糖類及維生素等，是人類理想的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品。但有研究[1]發(fā)現(xiàn)，乳制品中存在不同程度的農(nóng)藥殘留，中國(guó)個(gè)別省份的牛奶中有機(jī)磷殺蟲劑檢出率達(dá)70.59%。殺蟲劑是畜牧業(yè)常用的農(nóng)藥類型之一，然而施用后殺蟲劑可能在牛羊體內(nèi)積累，導(dǎo)致乳制品中存在殺蟲劑殘留，危害食用者身體健康[2-3]。目前中國(guó)對(duì)于乳制品中殺蟲劑的限量要求和檢測(cè)方法并不完善，現(xiàn)行農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了生牛乳中54項(xiàng)殺蟲劑的最大殘留限量，其中有近50%的殺蟲劑無適用乳制品基質(zhì)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，為企業(yè)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)乳制品的安全檢測(cè)帶來困難，對(duì)政府的安全監(jiān)管造成阻礙。目前市場(chǎng)上常用的殺蟲劑按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分成有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、有機(jī)氯類、新煙酰類、發(fā)酵抗生素類、雙酰胺類等，其來源、作用機(jī)理、化學(xué)性質(zhì)均存在較大差異，而關(guān)于乳制品殺蟲劑檢測(cè)的報(bào)道集中在擬除蟲菊酯和有機(jī)氯類，且多為檢測(cè)某一類或兩類殺蟲劑[4]。乳制品作為高營(yíng)養(yǎng)食品，基質(zhì)復(fù)雜，準(zhǔn)確定性定量其中的目標(biāo)物有一定難度，建立一種適用多類型殺蟲劑同時(shí)測(cè)定的快速篩查方法將對(duì)乳制品生產(chǎn)和安全監(jiān)管具有重要意義。

目前殺蟲劑檢測(cè)的前處理技術(shù)主要包括固相萃取法[5]、分散固相萃取法[6]、液液萃取法[7]、凝膠滲透法[8]和低溫冷凍除脂法[9]等，其中分散固相萃取方法具有試劑消耗量少、快捷、高效的優(yōu)點(diǎn)，目前較多應(yīng)用在蔬菜水果基質(zhì)中[10-11]，在生乳基質(zhì)中的應(yīng)用相對(duì)較少。而殺蟲劑的檢測(cè)技術(shù)主要有液相色譜法[12]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[13]、氣相色譜法[14]、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[15]，其中液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法具有快速、高效、專一性好的特點(diǎn)，被廣泛用于農(nóng)藥殘留量檢測(cè)，能顯著提高農(nóng)藥痕量檢測(cè)的分析能力[16-17]。研究針對(duì)常見的乳制品基質(zhì)(純?nèi)?、發(fā)酵乳、乳粉)，擬選擇8種目前無適用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的殺蟲劑作為研究對(duì)象，包括有機(jī)磷類的苯線磷，氨基甲酸酯類的滅多威和殺線威，新型煙酰類的吡蟲啉、呋蟲胺和噻蟲啉，發(fā)酵抗生素類的多殺霉素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽，開發(fā)建立利用分散固相萃取凈化的超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法，以期為后續(xù)開展乳制品中殺蟲劑殘留的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

純?nèi)?、發(fā)酵乳、乳粉：市售；

苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉、殺線威標(biāo)準(zhǔn)品：100.0 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；

丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，德國(guó)默克公司；

氯化鈉(NaCl)、無水硫酸鎂(MgSO4)：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

弗羅里硅土(Florisil)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、十八烷基鍵合硅膠(C18)：分析純，廣州太瑋生物科技有限公司；

聚四氟乙烯(PTFE)微孔濾膜：0.22 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿聯(lián)用儀：LC-30AD/TRIPLE QUAD 4500型，美國(guó)AB SCIEX公司；

電子分析天平：ME2002E型，瑞士梅特勒公司；

渦旋振蕩器：MS 3數(shù)顯型，德國(guó)IKA公司；

超聲波提取儀：KQ-118型，昆山舒美超聲儀器有限公司；

高速離心機(jī)：3K15型，德國(guó)Sigma公司；

自動(dòng)氮吹濃縮儀：MV64型，美國(guó)LabTech公司；

超純水儀：Direct-Pure UP10型，上海樂楓生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 稱取樣品(純?nèi)?0 g，發(fā)酵乳5 g，乳粉2 g)于50 mL離心管中，加入約45 ℃的超純水溶解混勻(純?nèi)椴恍杓?，發(fā)酵乳中加5 mL，乳粉中加8 mL)，加入10 mL乙腈—丙酮溶液(V乙腈∶V丙酮=80∶20)、4 g無水MgSO4和1 g NaCl，超聲5 min后在5 500 r/min條件下離心5 min，吸取約5 mL上清液于15 mL離心管中，加入50 mg Florisil、100 mg PSA和400 mg無水MgSO4分散固相萃取凈化劑，渦旋混勻2 min，在5 500 r/min條件下離心5 min，吸取上清液過0.22 μm PTFE微孔濾膜，使用UPLC-MS/MS測(cè)定。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置 分別準(zhǔn)確移取1.00 mL苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉、殺線威的100.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，得到10.0 mg/L 8種殺蟲劑的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。采用不含目標(biāo)殺蟲劑殘留的陰性乳制品樣品，按1.2.1步驟處理，所得溶液為空白基質(zhì)提取液。分別移取2.00，10.00，40.0，50.0，100.0 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液至5個(gè)10 mL容量瓶中，用上述空白基質(zhì)提取液定容，得2.00，10.0，40.0，50.0，100 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為Phenomenex Kinetex Biphenyl(100 mm×3.0 mm，2.6 μm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈溶液；梯度洗脫(洗脫程序：0 min，90% A，10% B；3.00 min，40% A，60% B；7.00 min，5% A，95% B；7.10 min，90% A，10% B；10.00 min，90% A，10% B)；流速0.25 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離方式為電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度350 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)采集，8種農(nóng)藥的保留時(shí)間、離子對(duì)等參數(shù)見表1。

表1 8種殺蟲劑的質(zhì)譜參數(shù)?

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的選擇 殺蟲劑的極性大多為中等極性或弱極性，利用有機(jī)物極性相似相溶的原理選擇合適的提取試劑。試驗(yàn)比較了提取試劑乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯對(duì)生乳中8種殺蟲劑的提取效果，結(jié)果如圖1所示。乙腈作為提取溶劑時(shí)，回收率為78.1%～86.5%，符合試驗(yàn)回收率要求；丙酮作為提取劑時(shí)，目標(biāo)物易溶于溶劑中，回收率更高，但乳制品中脂肪含量較高，脂肪在丙酮中溶解度高，導(dǎo)致提取液顏色偏黃，色譜圖雜峰偏多；二氯甲烷作為提取劑時(shí)，乳化情況嚴(yán)重，試驗(yàn)的重現(xiàn)性差；乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，8種殺蟲劑回收率整體較低，均低于50%。而且乙腈適用于非極性或中等極性農(nóng)藥的提取，適合的農(nóng)藥極性范圍比其他溶劑廣，且提取出的脂類雜質(zhì)較少，同時(shí)可快速沉淀蛋白[18]。綜合上述結(jié)果，試驗(yàn)繼續(xù)嘗試在乙腈中加入小比例的丙酮，進(jìn)一步增強(qiáng)目標(biāo)物在試劑中的回收率，比較V乙腈∶V丙酮分別為90∶10，80∶20，70∶30時(shí)的提取情況，發(fā)現(xiàn)乙腈—丙酮溶液(V乙腈∶V丙酮=80∶20)可獲得最佳回收率，且樣品提取液顏色接近無色，色譜圖雜峰少，8種殺蟲劑的平均回收率為82.3%～93.1%(見圖1)。最終選擇乙腈—丙酮溶液(V乙腈∶V丙酮=80∶20)作為提取試劑。

圖1 提取劑對(duì)8種殺蟲劑回收率的影響

2.1.2 提取時(shí)間的優(yōu)化 試驗(yàn)采用超聲方式提高提取目標(biāo)物的效率，相比于機(jī)械振蕩或高速勻漿，超聲方式更易操作、耗時(shí)短、適合大批樣品同時(shí)處理。在以10 mL乙腈—丙酮溶液(V乙腈∶V丙酮=80∶20)為提取試劑的條件下，考察超聲時(shí)間(2，5，10，20 min)對(duì)8種殺蟲劑回收率的影響，結(jié)果(見圖2)表明，殺蟲劑在超聲處理5～10 min時(shí)回收率基本穩(wěn)定，均在80%以上，當(dāng)超聲處理超過10 min后，個(gè)別殺蟲劑回收率有降低趨勢(shì)，分析是過長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理對(duì)殺蟲劑有降解作用[19-20]。因此，5 min為適宜的超聲時(shí)間。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)8種殺蟲劑回收率的影響

2.1.3 凈化材料的確定 乳制品基質(zhì)較復(fù)雜，需要凈化其中大量的蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂等干擾物，試驗(yàn)采用分散固相萃取凈化。分散固相萃取常用的吸附劑主要有Florisil、PSA、GCB、C18與無水MgSO4等。Florisil能較好地吸附脂肪等雜質(zhì)，是乳制品中使用最廣泛的凈化劑[21]；PSA主要吸附極性物質(zhì)，包括糖、有機(jī)酸、脂肪酸、色素等；GCB能吸附色素和類固醇雜質(zhì)，但對(duì)平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥有吸附作用，一般乳制品無明顯色素干擾；C18可以去除提取液中的脂類、糖類等親脂型雜質(zhì)，在乳制品基質(zhì)中作用與Florisil相近；無水MgSO4的吸水能力強(qiáng)，能保證其他吸附劑的凈化效果?；诖耍芯窟x擇三因素四水平正交試驗(yàn)來優(yōu)化確定Florisil、PSA與無水MgSO4的最優(yōu)水平。正交試驗(yàn)因素水平取值見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。由表3可知，PSA的極差最大，其對(duì)凈化效果影響最大；3種吸附劑的最佳水平為Florisil 50 mg、PSA 100 mg、無水MgSO4400 mg。按照正交試驗(yàn)所得最優(yōu)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其回收率分別為89.5%，92.3%，91.2%，平均值為91.0%，大于正交試驗(yàn)中任意一組的殺蟲劑回收率，因此認(rèn)為正交試驗(yàn)結(jié)果為凈化材料的最優(yōu)條件。

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 取8種殺蟲劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以20 μL/min的流速注入電噴霧離子源中，在正離子模式進(jìn)行全掃描，選擇豐度比最強(qiáng)的離子作為檢測(cè)離子，8種目標(biāo)物均能獲得穩(wěn)定高響應(yīng)的[M+H]+作為母離子，對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高的兩個(gè)碎片離子為定性、定量離子，并對(duì)各個(gè)離子對(duì)的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使儀器的靈敏度、穩(wěn)定性處于最佳狀態(tài)，優(yōu)化后參數(shù)見表1。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 色譜條件優(yōu)化 流動(dòng)相的選擇方面，乙腈體系洗脫能力中等，對(duì)殺蟲劑的分離度好，流動(dòng)相中加入酸有利于目標(biāo)化合物形成穩(wěn)定的[M+H]+，響應(yīng)更穩(wěn)定，因此選擇乙腈/0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫程序及流速(如“1.2.3 ”所述)，在100 mm的Biphenyl色譜柱上實(shí)現(xiàn)了8種殺蟲劑的良好分離，峰形對(duì)稱尖銳，信噪比高。圖3為空白純牛乳樣品中添加8種殺蟲劑的MRM色譜圖。

1. 呋蟲胺 2. 殺線威 3. 滅多威 4. 吡蟲啉 5. 噻蟲啉 6. 苯線磷 7. 多殺霉素 8. 甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性方程、相關(guān)系數(shù)與方法檢出限 在2.00～200 μg/L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)作苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉、殺線威的標(biāo)準(zhǔn)曲線。最佳條件下，目標(biāo)物峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。根據(jù)儀器信噪比及前處理過程相關(guān)參數(shù)可得出該方法測(cè)得各組分的檢出限，見表4。

表4 8種殺蟲劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.3.2 回收率和精密度 在10 g純?nèi)椤? g發(fā)酵乳、2 g乳粉中準(zhǔn)確加入一定量10.0 mg/L 8種殺蟲劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得3個(gè)添加水平的陽(yáng)性樣品(10，50，100 μg/kg)，在4 ℃冰箱冷藏放置12 h，按1.2.1步驟進(jìn)行前處理，在最優(yōu)條件下測(cè)定8種組分在3種基質(zhì)中的平均回收率，測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 8種殺蟲劑的加標(biāo)回收率和精密度值

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià) 在優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件下對(duì)陰性樣品進(jìn)行處理，按1.2.2配制基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線，同時(shí)用純?cè)噭┡渲仆瑵舛鹊募冊(cè)噭┗旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線，依次進(jìn)入HPLC-MS/MS檢測(cè)?；|(zhì)效應(yīng)(ME)主要通過計(jì)算分析物在同濃度的加標(biāo)空白基質(zhì)提取液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)比值進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算公式如式(1) 所示。當(dāng)ME>50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)；20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)；0～20%為弱基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，在試驗(yàn)條件下，8種殺蟲劑的基質(zhì)效應(yīng)在8%～17%，基質(zhì)效應(yīng)較弱，影響較小。

ME=(B/A-1)×100%，

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應(yīng)，%；

B——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；

A——純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用研究建立的方法對(duì)市售的10份純牛乳、10份酸牛乳、5份羊乳粉、5份牛乳粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，各樣品中均未檢出苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉和殺線威8種殺蟲劑殘留。

3 結(jié)論

研究建立了分散固相萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)測(cè)定乳制品(純?nèi)椤l(fā)酵乳、乳粉)中苯線磷、吡蟲啉、多殺霉素、呋蟲胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、滅多威、噻蟲啉和殺線威8種殺蟲劑殘留量的方法，該方法具有經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)勢(shì)，準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，適用于乳制品中殺蟲劑農(nóng)藥殘留的快速確認(rèn)和準(zhǔn)確定量分析。