姜 侃 張 慧 曹 慧 王 瑾 周學(xué)軍 厲小燕
(1. 浙江省產(chǎn)品質(zhì)量安全科學(xué)研究院,浙江 杭州 310018;2. 浙江科技學(xué)院,浙江 杭州 310023)
雙酚類物質(zhì)如雙酚A(BPA)、雙酚B(BPB)等和烷基酚類物質(zhì)如壬基酚(NP)等化合物,通常被用于聚碳酸酯環(huán)氧樹脂等的塑料容器生產(chǎn)中以提高材料的透明度、阻燃性和耐用性[1-2]。由于其具有類似雌激素的特性可干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)[3-4],使人體出現(xiàn)生殖系統(tǒng)異常、性早熟[5],甚至癌變[6],2011年衛(wèi)生部等6部門發(fā)布了禁止在嬰幼兒奶瓶中使用雙酚A的公告,一些塑料制品開始貼上“不含雙酚A”的標簽。但雙酚A的替代物雙酚S(BPS)、BPB等,烷基酚及阻燃劑四溴雙酚A(TBBPA)等酚類物質(zhì)的使用,仍然存在諸多安全風(fēng)險。
目前,常見的乳制品中酚類化合物的檢測方法有液相色譜法[7-8]、液相色譜—質(zhì)譜法[9-11]、氣相色譜—質(zhì)譜法[12]、高分辨質(zhì)譜法[13]、電化學(xué)法[14]、生物傳感器法[15]、酶聯(lián)免疫法[16]等。王力等[7]采用液相色譜法測定了嬰幼兒配方奶粉中的雙酚A;公丕學(xué)等[10]建立了嬰幼兒配方乳粉中雙酚 A 和壬基酚的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定性定量方法;劉蕓等[13]采用高分辨率質(zhì)譜法檢測確證了乳粉及乳制品中的壬基酚和雙酚A含量。上述研究多是針對乳制品中雙酚A或壬基酚等某幾個酚類化合物的研究,而乳制品中酚類物質(zhì)的高通量檢測方法研究尚未見報道。研究擬采用鹽析輔助液液萃取,建立液態(tài)乳中13種酚類物質(zhì)同時測定的HPLC-MS/MS檢測方法,旨在為食品安全監(jiān)管和風(fēng)險評估提供依據(jù)。
牛奶、酸奶樣品:市售;
BPA標準品(CAS 80-05-7):純度98%,上海安譜實驗科技股份有限公司;
BPB(CAS 77-40-7)、雙酚AP(BPAP,CAS 1571-75-1)標準品:純度98%,美國TRC公司;
BPS(CAS 80-09-1)、雙酚E(BPE,CAS 2081-08-5)、雙酚F(BPF,CAS 620-92-8)、4-正辛基酚(4-n-OP,CAS 1806-26-4)、4-正壬基酚(4-n-NP,CAS 104-40-5)、4-壬基酚(4-NP,CAS 84852-15-3)標準品:純度99%,北京Bepure公司;
雙酚Z(BPZ,CAS 843-55-0)標準品:純度99%,德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;
辛基酚(OP,CAS 27193-28-8)、四氯雙酚A(TCBPA,CAS 79-95-8)標準品:純度99%,美國Accu Standard公司;
TBBPA(CAS 79-94-7):純度99%,美國Chem Service公司;
乙腈、正己烷、甲醇:色譜純,德國Merck公司;
試驗用水為超純水。
高效液相色譜儀:LC 20AD型,日本Shimadzu公司;
三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀:5500QTRAP型,美國AB SCIEX公司;
超純水儀:Milli-Q型,美國Millipore公司;
電子天平:FA2004型,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;
旋渦混合器:VORTEX2型,德國IKA公司;
離心機:2-16P型,德國SIGMR公司。
1.3.1 標準溶液的配制
(1) 標準儲備液:分別準確稱量各標準品10 mg,用甲醇定容,配成質(zhì)量濃度為1 g/L的單標儲備液,-18 ℃貯存。
(2) 標準工作液:準確吸取1 g/L的單標儲備液于同一容量瓶中,配成質(zhì)量濃度為1 mg/L(BPS和TCBPA為0.2 mg/L)的混合標準溶液,4 ℃貯存。
1.3.2 提取溶劑和鹽析試劑的選擇 以牛奶為基質(zhì),分別采用乙腈、甲醇、乙醇、乙腈/甲醇(V乙腈∶V甲醇為1∶1)各5 mL,乙腈/正己烷(V乙腈∶V正己烷為1∶1)10 mL進行提取,選擇適合的提取溶劑。并分別取0.2,0.4,0.6,0.8 g 氯化鈉(NaCl)進行鹽用量優(yōu)化選擇。
1.3.3 樣品處理 準確稱取2 g液態(tài)乳制品于15 mL具塞離心管中,加入5 mL乙腈渦旋振蕩2 min,加入0.4 g氯化鈉,渦旋2 min至其溶解,8 000 r/min離心5 min,取乙腈溶液層待測。
1.3.4 儀器參數(shù)條件
(1) 色譜條件:Waters AtlantisTMT3色譜柱為2.1 mm×150 mm×3 μm;柱溫40 ℃;進樣量5.0 μL;流速0.4 mL/min;流動相A為乙腈—甲醇(V乙腈∶V甲醇為1∶1)溶液,流動相B為水;梯度洗脫程序:0~1 min,20% A;1~4 min,20%~95% A,維持4 min;8~8.2 min,95%~20% A;8.2~10 min,20% A,總運行時間10 min。
(2) 質(zhì)譜條件:電噴霧離子源負離子(ESI-)模式;噴霧電壓-4 500 V;離子源溫度550 ℃;氣簾氣241 kPa;霧化氣壓力345 kPa;輔助加熱氣379 kPa;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。具體條件見表1。
表1 13種酚類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)
1.3.5 方法學(xué)驗證 以牛奶為基質(zhì)進行加標試驗,分別以3倍信噪比為檢出限,10倍信噪比為定量限。
1.3.6 加標回收率與精密度測定 選取牛奶和酸奶樣品,分別添加高、中、低3個水平的13種混標溶液,計算加標回收率和相對標準偏差。
1.3.7 數(shù)據(jù)處理 使用Analyst Software軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù),Multi Quant 3.0.2軟件分析數(shù)據(jù), Excel軟件處理數(shù)據(jù)。
選取乙腈、乙腈/正己烷、乙腈/甲醇、乙醇、甲醇作為提取溶劑,對牛奶加標樣品進行提取,發(fā)現(xiàn)13種酚類物質(zhì)均有檢出,但是由于牛奶中水分含量較高,而提取溶劑乙腈、乙醇和甲醇均與水互溶,水性溶劑使得溶劑體積增大,降低了酚類物質(zhì)的回收率。因此,采用鹽析液液萃取法以使有機提取溶劑與水相分層,從而提高酚類物質(zhì)的提取效率。13種酚類物質(zhì)的總離子流色譜圖見圖1。
1. BPS 2. BPF 3. BPE 4. BPA 5. BPB 6. BPAP 7. BPZ 8. TCBPA 9. TBBPA 10. OP 11. 4-NP 12. 4-n-OP 13. 4-n-NP
在不同提取溶劑萃取后的溶液中加入足量的氯化鈉進行鹽析處理,只有含有乙腈的提取溶劑與水相出現(xiàn)了分層,經(jīng)測定目標物回收率,乙腈、乙腈/正己烷均表現(xiàn)出較好的提取效率。牛奶成分復(fù)雜,含有的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)會對檢測產(chǎn)生干擾,乙腈既可以沉淀蛋白質(zhì)又可以提取目標物質(zhì),而正己烷可以減少脂肪的影響。由圖2可知,采用乙腈、乙腈/正己烷提取后的各目標物回收率無明顯變化,為減少有機溶劑用量、簡化試驗步驟,選取乙腈作為乳制品中酚類化合物的提取溶劑。
圖2 提取溶劑的影響
在目標物提取過程中分別加入0.8 g的硫酸銨和氯化鈉,考察溶液的分層情況和酚類物質(zhì)的回收率。結(jié)果顯示,加入硫酸銨和氯化鈉的溶液均出現(xiàn)了有機相和水相的分層,但13種酚類物質(zhì)的回收率有所不同(見圖3),當以硫酸銨作為鹽析試劑時,雙酚類物質(zhì)的回收率較好,均達到80%以上;而烷基酚類物質(zhì)4-NP、4-n-NP、OP、4-n-OP的回收率偏低,均在80%以下。當以氯化鈉為鹽析試劑時,各類物質(zhì)的回收率均較好。因此,選擇氯化鈉作為鹽析試劑。
圖3 無機鹽類型的影響
由圖4可知,當氯化鈉用量為0.2~0.8 g時,樣品提取液均有分層,當用量為0.4 g時,各物質(zhì)回收率明顯增加,當用量為0.4~0.8 g時,各物質(zhì)回收率變化不大,說明0.4 g氯化鈉即可滿足鹽析要求,此時乙腈分層且萃取效率較佳,目標物回收率為82.4%~110.3%。因此,選擇氯化鈉用量為0.4 g。
圖4 NaCl用量的影響
基質(zhì)效應(yīng)通常采用基質(zhì)標準曲線斜率與流動相標準曲線斜率的比值進行評價,一般以斜率比值在0.8~1.2范圍內(nèi)作為衡量標準[17]。試驗以牛乳和酸奶為基質(zhì)時13種酚類物質(zhì)的斜率比值分別為0.38~1.09,0.39~1.22,說明不同類型的液態(tài)乳均具有一定的基質(zhì)效應(yīng)。為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響,采用乳制品基質(zhì)標準曲線對化合物進行定量分析。
以空白基質(zhì)樣液中加入混標溶液配置系列標準混合溶液,以物質(zhì)濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線并考察13種化合物的線性。由表2可知,13種酚類化合物在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.992 5~0.999 1。
表2 酚類物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
由表3可知,牛奶中13種酚類物質(zhì)的回收率為81.5%~118.1%,相對標準偏差為1.89%~12.30%(n=3);酸奶中酚類物質(zhì)的回收率為80.8%~107.6%,相對標準偏差為1.12%~11.90%(n=3),說明試驗方法適合液態(tài)乳制品樣品中雙酚類和烷基酚類化合物的分析測定。
表3 酚類物質(zhì)的回收率與精密度
采用所建方法對市售的15個純牛奶和酸奶樣品進行檢測,僅1個樣品檢出4-NP,含量為9.28 μg/kg;其他樣品均未檢出雙酚類和烷基酚類化合物。4-NP是一種典型的內(nèi)分泌干擾物,試驗檢出的樣品盡管數(shù)量少、含量低,但其檢出提醒了人們應(yīng)關(guān)注食品中烷基酚類物質(zhì)的污染風(fēng)險。
建立了鹽析輔助液液萃取、HPLC-MS/MS法同時檢測液態(tài)乳中13種雙酚類和烷基酚類物質(zhì)的檢測方法。結(jié)果表明,樣品采用乙腈提取,氯化鈉為鹽析助劑使乙腈分層,前處理過程簡單、提取效率高。13種酚類物質(zhì)在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均>0.99;在牛奶和酸奶中的加標回收率分別為81.5%~118.1%,80.8%~107.6%,相對標準偏差分別為1.89%~12.30%,1.12%~11.90%;方法檢出限為0.15~0.75 μg/kg,定量限為0.5~2.5 μg/kg。采用該法對市售15批次液態(tài)乳樣品中的酚類物質(zhì)進行檢測,1個樣品中檢出含有4-NP,含量為9.28 μg/kg。后續(xù)可研究包裝材料中酚類化合物向乳制品中的遷移規(guī)律,并可加強對不同貯藏或應(yīng)用條件下乳制品中酚類化合物的風(fēng)險監(jiān)測。