工夫紅茶加工過程中類胡蘿卜素成分的動(dòng)態(tài)變化

劉 飛，葉 陽，李春華，汪 閔，唐曉波，張 廳，王小萍，王 云,*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，四川 成都 610066；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

香氣是茶葉品質(zhì)評(píng)定和影響消費(fèi)需求的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，已有研究表明成品茶中大部分香氣物質(zhì)主要由類胡蘿卜素、脂質(zhì)、糖苷類化合物、氨基酸/碳水化合物等香氣前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來[1-2]，其中由類胡蘿卜素類降解產(chǎn)生的香氣物質(zhì)占成品茶香氣總量的4.3%～46.5%[3]，是茶葉香氣的重要組成部分。

類胡蘿卜素是一類由植物和某些光合微生物合成的不溶于水的親脂性次生代謝產(chǎn)物，主要由8個(gè)異戊二烯單元形成的C40骨架構(gòu)成，其聚烯鏈由共軛雙鍵組成并呈現(xiàn)不同顏色（黃色、橙色和紅色），對(duì)藍(lán)綠光有較強(qiáng)吸收能力（最大吸收波長(zhǎng)400～500 nm）[4-5]。由于其含有3～15個(gè)共軛雙鍵而表現(xiàn)出高度不飽和性[6]，進(jìn)而具有較強(qiáng)抗氧化能力表現(xiàn)出細(xì)胞膜抗氧化保護(hù)劑[7-8]、光吸收和光保護(hù)[9]、降低心血管疾病發(fā)病率[10-11]、預(yù)防和治療糖尿病[12]、保護(hù)視力和抗癌[13-15]、抑制脂肪合成[16]及抗炎健腦[17-18]等生理功效。通常，茶葉中的類胡蘿卜素存于葉 綠體和有色體中[19]，其含量受品種[20-21]、栽培環(huán)境[22]、鮮葉嫩度[23]、采摘季節(jié)[24]、加工工藝[25]等因素影響。其中，加工是類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化形成茶葉香氣、葉底和外觀色澤的重要因素，而類胡蘿卜素雙加氧酶參與的酶促氧化[26]和光氧化、自氧化、熱裂解等構(gòu)成的非酶促氧化是茶葉中類胡蘿卜素介導(dǎo)的香氣形成的主要來源。紅茶屬于全發(fā)酵茶，較長(zhǎng)時(shí)間的萎凋及后續(xù)揉捻、發(fā)酵、干燥工序，使茶葉中類胡蘿卜素遭受酶促氧化和光氧化、熱裂解等反應(yīng)而發(fā)生降解，同時(shí)多酚氧化生成的黃烷醌協(xié)同催化類胡蘿卜素氧化，使得紅茶具有更高含量的二氫海葵內(nèi)酯、茶螺烯酮等香氣物質(zhì)[27-29]，進(jìn)而表現(xiàn)出更加豐富的香氣組成和呈味特征。因此，明確紅茶加工過程中類胡蘿卜素的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)紅茶香氣形成以及內(nèi)在變化機(jī)理研究顯得尤為重要，但之前的研究多集中在類胡蘿卜素形成的香氣產(chǎn)物上[30-31]，對(duì)其本身變化的研究鮮有報(bào)道。

鑒于此，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法分析工夫紅茶加工中各工序制品的類胡蘿卜素含量，旨在闡明類胡蘿卜素在工夫紅茶加工過程中的動(dòng)態(tài)變化，以期為紅茶香氣和色澤形成機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮葉于2020年8月購買于文君茶業(yè)有限公司邛崍茶場(chǎng)，品種為福鼎大白，鮮葉等級(jí)為一芽二葉。

甲醇、乙腈、乙醇（均為色譜純） 德國(guó)Merk公司；甲基叔丁基醚、正己烷（均為色譜純） 德國(guó)CNW科技公司；丙酮（色譜純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（色譜純）、類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于99%） Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司，用甲基叔丁基醚-甲醇（3∶1，V/V）混合溶液進(jìn)行配制，于-20 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

6CR-45型茶葉揉捻機(jī) 浙江上洋機(jī)械股份有限 公司；JY-6CHF-7型紅茶發(fā)酵機(jī)、JY-6CHZ-9B型茶葉烘焙提香機(jī) 福建佳友茶葉機(jī)械智能科技股份有限公司；QTRAP 6500+型LC-MS/MS儀 美國(guó)SCIEX公司；5424R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；AS 60/220.R2型電子 天平 波蘭Radwag公司；MM400型球磨儀 德國(guó)Retsch公司；CentriVap型離心濃縮儀 美國(guó)Labconco 公司；MIX-200型多管渦旋振蕩器 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；KQ5200E型超聲清洗儀 昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

工夫紅茶加工工藝如下所示：

萎凋：將鮮葉（70%～75%）薄攤（2～3 cm）在水篩上，后置于自建萎凋室內(nèi)，28～30 ℃萎凋至鮮葉含水量58%～60%，共耗時(shí)18 h。

揉捻：將20 kg萎凋葉填裝到揉捻機(jī)中，采用“空-輕-中-重-空”循環(huán)加壓原則進(jìn)行揉捻，揉捻轉(zhuǎn)速設(shè)置為38 r/min，共耗時(shí)1.5 h。

發(fā)酵：將揉捻葉攤放到發(fā)酵機(jī)不銹鋼篩中，每篩厚度20～25 cm，發(fā)酵參數(shù)設(shè)置為30 ℃、90%～95%相對(duì)濕度，發(fā)酵過程每30 min均勻翻拌一次，共耗時(shí)4 h。

干燥：將發(fā)酵葉薄攤（1～2 cm）至烘焙提香機(jī)不銹鋼篩中進(jìn)行熱風(fēng)干燥。干燥分2 次完成，分別為：第1次120 ℃（提前空機(jī)升溫至該設(shè)定溫度）烘至茶葉在制品20%～25%含水量，第2次80 ℃（提前空機(jī)升溫至該設(shè)定溫度）烘至足干（5%～6%含水量），兩次烘焙間冷卻回潮至室溫。

實(shí)驗(yàn)中每道工序結(jié)束時(shí)取樣1 次，每次取樣20 g并立即液氮保存。按照加工順序所取樣品分別標(biāo)記為FL（鮮葉）、WC（萎凋葉）、RL（揉捻葉）、FD（發(fā)酵葉）、DA（干燥葉），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，共獲得待測(cè)樣15 份。

1.3.2 樣品前處理

將待測(cè)樣品液氮預(yù)處理后真空冷凍干燥，然后研磨儀研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀；稱取50 mg茶樣粉末，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，用正己烷-丙酮-乙醇混合物提取液（1∶1∶2，V/V，含0.01g/mL BTH）進(jìn)行提取；室溫渦旋20 min，重復(fù)提取一次后離心，合并上清液；將得到的提取液濃縮后用甲醇-甲基叔丁基醚混合溶液復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后，保存于棕色進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.3.3 檢測(cè)方法

1.3.3.1 儀器檢測(cè)條件

色譜條件：進(jìn)樣量2 μL；色譜柱為YMC C30柱（100 mm×2.0 mm，3 μm）；流動(dòng)相：A為甲醇-乙腈（1∶3，V/V）加入0.01% BHT和0.1%甲酸，B為甲基叔丁基醚加入0.01% BHT；流速為0.8 mL/min；柱溫為28 ℃；流動(dòng)相線性梯度洗脫：0～3 min，100% A、0% B； 3～5 min，100%～30% A、0%～70% B；5～9 min，30%～5% A、70%～95% B；9～10 min，5%～100% A、95%～0% B；10～11 min，100% A、0% B。

質(zhì)譜條件：大氣壓化學(xué)離子源溫度350 ℃，氣簾氣壓力25 psi；去簇電壓20～100 V；碰撞電壓13～75 V進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.3.3.2 類胡蘿卜素的定性定量

基于標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建MWDB（Metware Database）數(shù)據(jù)庫，對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。利用三重四極桿質(zhì)譜-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對(duì)所有目標(biāo)物的色譜峰進(jìn)行積分，進(jìn)而完成定量分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制質(zhì)量濃度0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、40 μg/mL的類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取各個(gè)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)應(yīng)定量信號(hào)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)，外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將檢測(cè)到的樣本積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算，實(shí)際樣本中該物質(zhì)的絕對(duì)含量計(jì)算公式如下：

式中：c為樣本中積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為復(fù)溶時(shí)所用溶液的體 積/μL；m為稱取的樣本質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析；采用Excel 2013、KingDraw軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 在制品類胡蘿卜素組成

采用LC-MS/MS方法檢測(cè)工夫紅茶各工序茶葉制品中類胡蘿卜素組成和絕對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)15 份茶葉樣品中共檢測(cè)出類胡蘿卜素24種（其中鮮葉、發(fā)酵葉20種，萎凋葉、揉捻葉21種，干燥葉19種），共包含胡蘿卜素類3種，即α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、八氫番茄紅素；葉黃素類10種，包含葉黃素、紫黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、新黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、海膽烯酮、角黃素、α-隱黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、β-阿樸胡蘿卜素醛等；類胡蘿卜素酯類11種，包含葉黃素酯7種（葉黃素二肉豆蔻酸酯、葉黃素肉豆蔻酸酯、葉黃素月桂酸酯、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素棕櫚酸酯、葉黃素癸酸酯、葉黃素油酸酯）、玉米黃質(zhì)酯2種（玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯、玉米黃質(zhì)二肉豆蔻酸酯）、紫黃質(zhì)酯2種（紫黃質(zhì)二丁酸酯、紫黃質(zhì)棕櫚酸酯）。檢出類胡蘿卜素組分絕對(duì)定量對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，以此為基礎(chǔ)測(cè)定的各工序茶葉類胡蘿卜素絕對(duì)含量見表2。

表1 類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves for carotenoids

如圖1、表2所示，不同種類的類胡蘿卜素在茶葉中含量差異較大，其中含量最高的類胡蘿卜素組分為葉黃素（126±3.605 6）～（317.666 7±12.662 3）μg/g，占鮮葉檢出類胡蘿卜素總量的67.51%；其次是β-胡蘿卜素（31.533 3±1.365 0）～（70.166 7±1.650 3）μg/g、紫黃質(zhì)（2.156 7±0.025 2）～（20.033 3±1.721 4）μg/g、 八氫番茄紅素（7.673 3±0.362 3）～（12.166 7±1.159 0）μg/g； 同一物質(zhì)在加工過程中的變化也存在較大差異，除僅存在萎凋葉的葉黃素油酸酯、玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯、僅存在揉捻葉的玉米黃質(zhì)二肉豆蔻酸酯和僅存在萎凋和揉捻葉中的紫黃質(zhì)二丁酸酯外，其余參與代謝的類胡蘿卜素變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）最大組分為葉黃素棕櫚酸酯（130.852%），其次為玉米黃質(zhì)（72.397%）、花藥黃質(zhì)（71.948%）。同時(shí)數(shù)據(jù)表明，作為吸光發(fā)色團(tuán)（本身顯橘紅色）且將光能傳遞給無環(huán)番茄紅素（深紅色）的角黃素[32]以及葉黃素癸酸酯、紫黃質(zhì)二丁酸酯均在萎凋工序后檢出，這可能因該類物質(zhì)在鮮葉中含量較低或萎凋階段鮮葉失水、細(xì)胞內(nèi)滲透壓改變引起區(qū)隔化作用減弱導(dǎo)致酶與底物接觸反應(yīng)所制；葉黃素油酸酯、玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯經(jīng)萎凋工序后均未檢出，可能是由于萎凋階段細(xì)胞內(nèi)酶促氧化引起的合成速率低于降解速率和緩慢熱降解所制；紫黃質(zhì)二丁酸酯、玉米黃質(zhì)二肉豆蔻酸酯經(jīng)歷揉捻工序后均未檢出，這可能是由于揉捻階段鮮葉組織破損和細(xì)胞破碎引起的激烈酶促氧化所制。該類物質(zhì)的形成與降解均為紅茶色澤（包括在制品色澤及干茶和葉底）及香氣的形成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)將按照類胡蘿卜分類和酶促氧化主要代謝途徑（圖2A）對(duì)工夫紅茶加工過程中類胡蘿卜素組分進(jìn)行詳細(xì)分析。

圖1 類胡蘿卜素含量分布 Fig. 1 Distribution of carotenoid contents in fresh tea leaves and intermediate products of Congou black tea manufacturing

圖2 類胡蘿卜素生物合成途徑[26]（A）及對(duì)應(yīng)物質(zhì)含量（B）Fig. 2 Biosynthetic pathway of carotenoids (A) and contents of intermediate and final products in fresh tea leaves and intermediate products of Congou black tea processing (B)

表2 工夫紅茶各工序茶葉類胡蘿卜素含量 Table 2 Contents of carotenoids in fresh tea leaves and intermediate products of Congou black tea processing μg/g

2.2 類胡蘿卜素變化分析

2.2.1 胡蘿卜素類

如圖2B1所示，八氫番茄紅素經(jīng)萎凋后出現(xiàn)小幅增加（約1.100 0 μg/g），然后隨著紅茶加工進(jìn)行逐漸降低，尤其在發(fā)酵工序降低最為明顯（分別較鮮葉、揉捻葉降低了21.18%、25.86%），待干燥結(jié)束成品茶中八氫番茄紅素含量為（7.673 3±0.362 3）μg/g，較鮮葉降低了30.66%，可見發(fā)酵階段劇烈酶促氧化和干燥強(qiáng)烈濕熱作用促進(jìn)了八氫番茄紅素的酶促降解和熱裂解。已有研究表明，幾乎所有光合植物（除裸藻外）八氫番茄紅素上游產(chǎn)物來源于4-磷酸甲基赤蘚糖醇途徑形成的C5異戊烯基二磷酸/烯丙基二磷酸構(gòu)建，而后經(jīng)牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶、八氫番茄紅素合成酶調(diào)控合成八氫番茄紅素，然后經(jīng)八氫番茄紅素脫氫酶和ζ-胡蘿卜素脫氫酶等酶多步催化脫氫形成番茄紅素，再經(jīng)ε-番茄紅素環(huán)化酶、β-番茄紅素環(huán)化酶形成δ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素，進(jìn)而完成后續(xù)物質(zhì)代謝[33-34]， 同時(shí)ε-番茄紅素環(huán)化酶/β-番茄紅素環(huán)化酶蛋白的比例也一直被認(rèn)為是控制植物β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)等的生物合成及其含量比例的基礎(chǔ)[35]。

如圖2B5所示，鮮葉中β-胡蘿卜素經(jīng)長(zhǎng)時(shí)萎凋和揉捻處理后其含量約有增加（較鮮葉增加2.233 4 μg/g），但后期發(fā)酵階段劇烈的酶促氧化加快了β-胡蘿卜素的降解（分別較鮮葉、揉捻葉降低了13.1%、15.9%），最后經(jīng)2 次干燥處理后成品茶中β-胡蘿卜素含量為（31.533 3±1.365 0）μg/g，較鮮葉和發(fā)酵葉分別減少53.58%、46.58%，呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05）。而鮮葉、萎凋葉、揉捻葉中α-胡蘿卜素含量均無顯著差異（P＞0.05），但在發(fā)酵和干燥工序經(jīng)酶促氧化和濕熱降解后顯著降低（P＜0.05），分別較鮮葉降低17.78%、55.87%，較鮮葉成分保存率為44.13%（圖2B2）。由此推斷，發(fā)酵和干燥是β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素降解的主要階段，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素低溫自氧化產(chǎn)物β-阿樸胡蘿卜素醛、海膽烯酮、角黃素（鮮葉中未檢出）在紅茶加工整個(gè)過程中含量變化差異不大。已有研究證實(shí)，β-胡蘿卜素可經(jīng)類胡蘿卜素裂解雙加氧酶家族氧化裂解后經(jīng)轉(zhuǎn)移酶形成香氣物質(zhì)或其前體物質(zhì)，根據(jù)β-胡蘿卜素雙鍵斷裂部位可生成β-紫羅酮、β-環(huán)檸檬醛、茶香螺酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等降異戊二烯香氣物質(zhì)及其衍 生物[38-39]，β-胡蘿卜素酶促降解產(chǎn)物[40-41]見圖3。同時(shí)，干燥過程中相對(duì)較長(zhǎng)的高溫濕熱作用可促進(jìn)β-胡蘿卜素的高溫氧化降解等非酶促降解，較之于較短濕熱作用時(shí)間能獲得更多的熱裂解產(chǎn)物[42]，而α-胡蘿卜素作為體內(nèi)維生素重要合成來源而受到廣泛關(guān)注[43]。

圖3 β-胡蘿卜素酶促降解[40-41]Fig. 3 Enzymatic degradation of β-carotene

2.2.2 葉黃素類

已有研究證實(shí)，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素分別經(jīng)β-胡蘿卜素羥化酶催化形成α-隱黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)，且β-隱黃質(zhì)生物利用率被證實(shí)明顯優(yōu)于β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素[44]。如圖2B2、B5所示，β-隱黃質(zhì)含量明顯高于α-隱黃質(zhì)且兩者含量隨加工進(jìn)程變化趨于一致，均是經(jīng)萎凋處理后降低至最小值然后在揉捻和發(fā)酵階段逐漸增加至最大值（分別較萎凋葉增加91.32%、214.03%）最后經(jīng)干燥階段濕熱作用迅速分解，可見揉捻和發(fā)酵階段對(duì)隱黃質(zhì)的酶促合成作用大于催化降解，且溫度（高溫）對(duì)隱黃質(zhì)的熱降解作用影響較大。

如圖2B6所示，茶葉中葉黃素含量經(jīng)萎凋工序后呈現(xiàn)小幅降低（約11.02%）而后經(jīng)發(fā)酵階段顯著提升 （P＜0.05），待干燥完成后葉黃素含量劇烈減少（約占發(fā)酵葉的34.87%），整個(gè)加工過程葉黃素保存率僅為39.66%。前期研究發(fā)現(xiàn)，α-胡蘿卜素經(jīng)β-胡蘿卜素羥化酶和ε-胡蘿卜素羥化酶催化形成葉黃素，而葉黃素在熱脅迫下裂解同時(shí)可能伴有異構(gòu)化、芳構(gòu)化、環(huán)化和聚合等反應(yīng)，總結(jié)推測(cè)出葉黃素形成重要香氣物質(zhì)途徑主要包括：1）在C6—C7位間發(fā)生碳鏈斷裂，生成氧化異佛爾酮；2）在C9—C10位間發(fā)生斷裂生成3-羥基-α-紫羅蘭醇，再經(jīng)氧化還原生成3-氧代-α-紫羅蘭醇，最后在弱酸環(huán)境下脫水形成巨豆三烯酮（煙草的主要呈香物質(zhì)）；3）在C21—C22位間發(fā)生斷裂生成3-羥基-β-紫羅蘭酮，后者進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成β-大馬酮；4）在C22位環(huán)化側(cè)鏈斷裂并失水形成紫羅蘭烯；5）在C23—C24位間氧化斷裂形成藏花醛環(huán)檸檬醛[45-47]（圖4）。

圖4 葉黃素?zé)崃呀鈾C(jī)理推測(cè)[43]Fig. 4 Deduced thermal decomposition mechanism of lutein

如圖2B7所示，玉米黃質(zhì)含量在整個(gè)加工過程中呈逐漸降低趨勢(shì)，其中萎凋階段降低最為激烈，由鮮葉（24.800 0±1.126 9）μg/g降低至萎凋葉（7.896 7±0.331 3）μg/g，減少率為68.16%，至干燥結(jié)束茶葉玉米黃質(zhì)含量為（6.080 0±0.167 0）μg/g，較鮮葉保存率為24.52%，可見玉米黃質(zhì)對(duì)萎凋長(zhǎng)時(shí)中溫作用響應(yīng)高于后期細(xì)胞破損引起的酶促氧化及干燥階段的高溫濕熱作用。研究發(fā)現(xiàn)，玉米黃質(zhì)經(jīng)玉米黃素環(huán)氧化酶催化形成花藥黃質(zhì)，而花藥黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)可作為外周集光色素復(fù)合體II能量猝滅劑和聚集增強(qiáng)劑發(fā)揮光保護(hù)作用[48]，同時(shí)花藥黃質(zhì)經(jīng)玉米黃素環(huán)氧化酶催化形成紫黃質(zhì)。本研究中，花藥黃質(zhì)經(jīng)萎凋工序后迅速降低63.83%，為（2.353 3±0.145 0）μg/g，而后經(jīng)揉捻和發(fā)酵工序逐漸增加至（4.01 3 3±0.168 6）μg/g，最后在干燥階段發(fā)生劇烈分解（本研究中未檢出）（圖2B8）； 而紫黃質(zhì)含量經(jīng)萎凋后降至（9.710 0±0.266 3）μg/g （較鮮葉降低23.34%）后，經(jīng)揉捻工序迅速增加至（20.033 3±1.721 4）μg/g，待干燥完成后其含量快速降低至（2.156 7±0.025 2）μg/g，較發(fā)酵葉降低率和鮮葉保留率分別為87.72%、13.03%（圖2B9），可見紫黃質(zhì)在紅茶加工階段對(duì)酶和溫度的響應(yīng)與花藥黃質(zhì)較為相似。

紫黃質(zhì)經(jīng)新黃質(zhì)合成酶催化形成新黃質(zhì)，新黃質(zhì)在雙加氧酶的作用下先斷裂C9＝C10雙鍵生成蚱蜢酮，然后降解形成丙二烯三醇，最后在酸性條件下水解生成β-大馬士酮[49]，而這種紅茶茶湯重要香氣物質(zhì)亦可在酸性條件下由新黃質(zhì)熱裂解直接獲得[50]。本研究中，新黃質(zhì)隨紅茶加工進(jìn)程呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)揉捻和發(fā)酵是新黃質(zhì)累積的重要階段，較之于鮮葉分別增加了40.79%、59.63%，而隨后干燥階段新黃質(zhì)含量顯著降低（P＜0.05），僅為發(fā)酵葉含量的14.49%，且較鮮葉的保存率為23.13%（圖2B10），由此可推斷干燥可能為β-大馬烯酮形成的重要工序。

2.2.3 類胡蘿卜素酯類

由于葉黃素類等在光、熱和氧氣條件下的不穩(wěn)定性，使得這類物質(zhì)存在多種結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定的酯化物[51]，本研究中共檢出葉黃素酯類、玉米黃質(zhì)酯類、紫黃質(zhì)酯類等脂肪酸化類胡蘿卜素酯共計(jì)11種，但其整體含量偏低（0～（0.708 0±0.078 3）μg/g）。其中，葉黃素脂肪酸酯7種，包含葉黃素肉豆蔻酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、葉黃素月桂酸酯、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素棕櫚酸酯、葉黃素油酸酯、葉黃素癸酸酯，其中以葉黃素棕櫚酸酯含量最高，為（0.045 1±0.006 9）～（0.708 0± 0.078 3）μg/g；玉米黃質(zhì)酯化物包含玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯、玉米黃質(zhì)二肉豆蔻酸酯，且僅在鮮葉和揉捻葉中分別檢出，可見其在后期酶促氧化過程合成小于分解；紫黃質(zhì)酯化物共檢出2種，即紫黃質(zhì)棕櫚酸酯和紫黃質(zhì)二丁酸酯，其中前者由鮮葉（0.123 7±0.021 2）μg/g經(jīng)萎凋、揉捻緩慢降至（0.082 2±0.007 5）μg/g，而后在發(fā)酵酶促作用下恢復(fù)到鮮葉含量水平，最后在干燥階段劇烈濕熱作用下迅速分解或轉(zhuǎn)化（較發(fā)酵葉降低約68.56%），而紫黃質(zhì)二丁酸酯僅在萎凋葉和揉捻葉中檢出。

3 討 論

類胡蘿卜素的降解（酶促或非酶促）不僅會(huì)導(dǎo)致食品色澤變化，而且影響其香氣組成和呈味特征，如Ravichandran[52]發(fā)現(xiàn)添加類胡蘿卜素的紅茶在加工過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)比不添加的多1 倍，且成品茶風(fēng)味品質(zhì)得到極大改善；肖亞冬等[53]發(fā)現(xiàn)熱處理后的甜玉米汁中的β-紫羅蘭酮、甲基庚辛酮、檸檬烯、苯甲醛、仲辛酮、p-傘花烴、甲苯、連三甲苯等香味物質(zhì)與反式類胡蘿卜素變化呈顯著負(fù)相關(guān)，其中葉黃素和β-胡蘿卜素貢獻(xiàn)最大；Zepka等[54]加熱腰果梨模擬汁中的類胡蘿卜素發(fā)現(xiàn)大量連三甲苯、對(duì)二甲苯、p-傘花烴、苯乙烯等芳香烴類、烷烴類揮發(fā)性化合物生成。紅茶加工過程中，酶促氧化和熱裂解是類胡蘿卜素降解的主導(dǎo)因素，基于類胡蘿卜素對(duì)不同光質(zhì)吸收特性和降解、衍生產(chǎn)物呈味特征，結(jié)合不同光質(zhì)萎凋?qū)t茶綜合品質(zhì)調(diào)控研究基礎(chǔ)（如紫外燈照射攤青葉能顯著提升其芳樟醇、反式氧化芳樟醇、橙花叔醇、β-紫羅酮、棕櫚酸甲酯、檸檬醛等成分含量[55]；黃光在前期促進(jìn)紅茶萎凋葉β-葡萄糖苷酶基因（CsBG1、CsBG2）、β-櫻草糖苷酶基因（CsBP）上調(diào)，后期調(diào)控β-葡萄糖苷酶活性提高，并促進(jìn)工夫紅茶甜花香顯現(xiàn)[56]；綠、紫、藍(lán)光促進(jìn)苯乙醇（玫瑰花香，紅茶重要香氣物質(zhì)）釋放，黃、橙、紅光萎凋能顯著改善紅茶的香氣和口感使茶具有甘甜、鮮醇的 口感[57]；紫外光促進(jìn)萎凋葉α-法尼烯、香葉醇、茉莉酮合成及反式-芳樟醇、橙花叔醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、順式-羅勒烯等萜類香氣物質(zhì)含量[58]，開展不同組合光質(zhì)和階段單一光質(zhì)萎凋或發(fā)酵以此調(diào)控紅茶品質(zhì)具有潛在的重要研究意義。同時(shí)類胡蘿卜素?zé)峤到猱a(chǎn)生的降異戊二烯類化合物及其衍生物所表現(xiàn)出的清香、花香或果香豐富了紅茶香氣濃度、香型和層次，是紅茶特征香氣的重要來源，然而受降解速率和鍵位斷裂處影響，對(duì)其不同熱裂解產(chǎn)物所需最適溫度、濕度、氧氣濃度仍缺乏較為系統(tǒng)和深入的研究。

品種是茶葉品質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，不同茶樹品種鮮葉內(nèi)含成分的差異決定了其茶類適制性和成品茶感官品質(zhì)，如陳麗等[21]比較37個(gè)茶樹品種發(fā)現(xiàn)烏龍茶品種類胡蘿卜素總量最高，紅茶品種的環(huán)氧玉米黃素和玉米黃質(zhì)高于其他品種；楊培迪等[59]比較不同茶樹品種綠茶干燥茶色澤，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素和葉綠素b含量的增加會(huì)導(dǎo)致綠茶葉片紅、藍(lán)色調(diào)及整體彩度升高而明度和綠、黃色調(diào)降低；劉關(guān)華等[60]揭示番茄紅素-β-環(huán)化酶基因（CsLCYb）在黃化茶樹葉片的胡蘿卜素合成和葉色變化過程中十分重要，由此表明類胡蘿卜素具有潛在的品種選育和茶葉等級(jí)判別能力。同時(shí)，結(jié)合茶樹品種類胡蘿卜素含量分布差異，根據(jù)其吸光、代謝差異開展茶葉離體采摘前光照處理以此積累香氣呈味和前體物質(zhì)具有重要意義，如藍(lán)光和紅光照射采摘前茶樹新梢可能會(huì)通過上調(diào)苯丙氨酸解氨酶、苯乙醛合成酶及苯乙醛還原酶I、II表達(dá)水平，進(jìn)而顯著增加采前鮮葉中內(nèi)源揮發(fā)性苯丙烷類/苯環(huán)型化合物（可來源于胡蘿卜素降解）如苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛含量[61]；藍(lán)光和紅光照射采前茶樹鮮葉可以激活9/13-LOX，促進(jìn)揮發(fā)性脂肪酸衍生物如揮發(fā)性短鏈脂肪醇、醛、酮等的合成和釋放[62]。因此，基于茶葉加工對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)定向調(diào)控需求，結(jié)合本研究結(jié)果，在后期的研究中有必要系統(tǒng)、深入開展不同光源、不同溫濕度對(duì)類胡蘿卜素酶促氧化或熱裂解反應(yīng)代謝研究。同時(shí)，基于本研究類胡蘿卜素在常規(guī)工藝下成分的動(dòng)態(tài)變化，可結(jié)合鮮葉采前處理（如施肥、光源照射）、組合萎凋（如做青、光源照射）、干燥（產(chǎn)熱、導(dǎo)熱方式）及外源添加類胡蘿卜素等處理，開發(fā)特征香氣突出的天然或調(diào)味型茶葉新產(chǎn)品，以期滿足茶產(chǎn)品多元化市場(chǎng)需求。

4 結(jié) 論

本研究采用LC-MS/MS法測(cè)定工夫紅茶加工各工序茶葉在制品類胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)各工序茶葉共檢出類胡蘿卜素24種，其中胡蘿卜素類3種、葉黃素類10種、類胡蘿卜素酯類11種；不同種類的類胡蘿卜素在茶葉中的含量差異較大，其中葉黃素（126.000 0±3.605 6）～（317.666 7±12.662 3）μg/g、β-胡蘿卜素（31.533 3± 1.365 0）～（70.166 7±1.650 3）μg/g 含量較高；同一類胡蘿卜素在加工過程中的變化也存在較大差異，其中以葉黃素棕櫚酸酯CV值最大為130.852%。對(duì)比不同類胡蘿卜素組分在加工過程中的含量變化，發(fā)現(xiàn)所檢出物質(zhì)含量變化總體呈現(xiàn)3種趨勢(shì)，即先增后減、持續(xù)降低和先降低后增加再降低，其中以發(fā)酵、干燥階段葉黃素變化速率最大，分別為10.25、58.33 μg/（g·h）。此外，研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)中溫（萎凋）、酶促氧化（揉捻、發(fā)酵）和劇烈濕熱作用（干燥）是引起類胡蘿卜素變化的主要誘因，但所檢出類胡蘿卜素對(duì)其響應(yīng)程度存在較大差異。