基于SSR標(biāo)記技術(shù)對3種國產(chǎn)綿羊肉的品種鑒別分析

宋亞倩，楊 波，羅瑞明，馬小梅

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

綿羊品種的遺傳資源是人類生存的寶貴基因庫之一，也是綿羊繁殖不可或缺的重要遺傳物質(zhì)[1]。中國有42種以上的地方綿羊品種，地方綿羊品種是長期進(jìn)化和勞動人民精心選育的結(jié)果，具有適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，它們是中國現(xiàn)在和未來不可缺少的寶貴遺傳資源[2]。藏綿羊性喜冷涼干旱，耐高寒、耐干旱性能好[3]，飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)效益高，因此飼養(yǎng)數(shù)量大、分布廣，以藏西北、藏東南干旱、半干旱地區(qū)為集中，是具有青藏高原特色的品種資源[4]。新疆細(xì)毛羊是伊犁草原上的明珠，是新中國成立后命名的第1個(gè)細(xì)毛羊新品種[5]。它的育成，不僅填補(bǔ)了我國養(yǎng)羊業(yè)的一個(gè)空白，而且對推進(jìn)細(xì)毛羊的品種改良具有重要影響。寧夏灘羊是中國寧夏優(yōu)勢特色畜種[6]，灘羊肉質(zhì)細(xì)嫩多汁，不膻不腥，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)羊肉，灘羊在寧夏養(yǎng)殖比例較高，經(jīng)濟(jì)效益顯著，素有“寧夏五寶之一”的美稱[7]。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）又稱微衛(wèi)星DNA、短串聯(lián)重復(fù)序列，由1～6個(gè)堿基串聯(lián)重復(fù)序列形成，是一種基于DNA長度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)[8-9]。SSR位點(diǎn)廣泛分布于所有原核生物和真核生物基因組中，具有分布豐富性、遺傳共顯性和技術(shù)簡單性等特點(diǎn)[10]?；贒NA序列側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，可以對SSR位點(diǎn)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增鑒定，形成富有極高進(jìn)化信息的分子標(biāo)記。微衛(wèi)星DNA以多拷貝方式廣泛分布在各類真核生物的基因組中，通過對SSR位點(diǎn)進(jìn)行開發(fā)并設(shè)計(jì)特異性引物，分析目的片段多態(tài)性，能夠建立綿羊品種特異性檢測方法[11]。趙杰[12]根據(jù)性狀相關(guān)基因挑選了等位基因頻率在普通肉牛群體中為0.546～0.833、在牦牛群體中為0.009～0.075的10個(gè)SSR位點(diǎn)，樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增，毛細(xì)管電泳分離后，根據(jù)出峰數(shù)目進(jìn)行肉源判定。岳遠(yuǎn)瑞等[13]分析新疆北疆地區(qū)主要綿羊品種的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，利用SSR Hunter軟件尋找5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，采用PCR擴(kuò)增、1%瓊脂糖凝膠電泳，對新疆7個(gè)品種綿羊群體遺傳多樣性進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，新疆7個(gè)綿羊群體共發(fā)現(xiàn)28個(gè)等位基因，實(shí)驗(yàn)證明在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量為0.556 9～0.733 5，均屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)。隋宥珍等[14]分析柔魚、阿根廷滑柔魚、莖柔魚3種柔魚類多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記在種間的通用性，結(jié)果表明，莖柔魚類多態(tài)性SSR標(biāo)記在柔魚中具有較高的通用性。Yin等[15]根據(jù)線粒體12S rRNA基因序列，提出了一種基于多重PCR的方法，利用設(shè)計(jì)的3個(gè)引物對牦牛肉和牛肉進(jìn)行快速鑒定，通過3個(gè)引物與單一反應(yīng)集的組合使用，從牛肉DNA中擴(kuò)增出290 bp和159 bp的2個(gè)片段，用該方法為牦牛肉及肉制品的質(zhì)量控制提供了有效手段。

本研究提取純種寧夏灘羊、藏綿羊與新疆細(xì)毛羊的肝臟DNA并進(jìn)行文庫構(gòu)建，根據(jù)文庫測序結(jié)果，從3種綿羊肉基因組SSR標(biāo)記入手，確定不同的候選特異DNA序列，據(jù)此設(shè)計(jì)SSR引物，采用PCR技術(shù)，用特異性SSR引物對寧夏灘羊肉、藏綿羊肉和新疆細(xì)毛羊肉進(jìn)行物種鑒別。從基因水平研究寧夏灘羊、藏綿羊與新疆細(xì)毛羊之間科學(xué)準(zhǔn)確的鑒定方法是西部地區(qū)綿羊肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟需解決的技術(shù)問題。這不僅能保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，而且對于綿羊肉產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定、健康發(fā)展以及科學(xué)開發(fā)利用均具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用純種寧夏灘羊的肝臟來自大夏牧場（寧夏鹽池縣），純種藏綿羊和純種新疆細(xì)毛羊的肝臟來自天祝藏族自治縣鑫榮盛生態(tài)養(yǎng)殖有限公司（甘肅省武威市）。

TaqPlus DNA聚合酶、10×PCR Buffer（含Mg2+）、dNTP（10 mmol/L）、引物、Rapid Animal Genomic DNA Isolation Kit、QubitTMdsDNA HS Assay Kit、NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒 生工生物工程（上海）有限公司；6×DNA Loading Dye、DNA Ladder Mix（100～3 000 bp）、POP-7TMPolymer、Applied BiosystemsTMHiDiFormamide 美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀、測序儀 美國ABI公司；凝膠成像儀 上海復(fù)日科技有限公司；臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；BP系列精密單道可調(diào)移液器 加拿大BBI公司；紫外-可見分光光度計(jì) 美林恒通（北京）儀器有限公司；Qubit 4.0熒光定量儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

寧夏灘羊、藏綿羊和新疆細(xì)毛羊各20 只，分別多點(diǎn)取其肝臟不同部分，每只綿羊肝臟樣本25 g，采樣完成后將每只綿羊肝臟分裝，共計(jì)60個(gè)樣本。采樣過程中注意避免外源性污染。

1.3.2 DNA提取

參照DNA提取試劑盒說明書提取3個(gè)品種綿羊的肝臟DNA[16]，通過1%瓊脂糖凝膠（電壓200 V、電泳時(shí)間30 min）檢測DNA完整性，DNA提取后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 基因組文庫構(gòu)建、擴(kuò)增、純化和質(zhì)控

利用dsDNA HS Assay Kit對基因組濃度精確定量確定文庫構(gòu)建所加入的DNA總量[17]。以NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建。于無菌PCR管中（200 μL）配制反應(yīng)體系，對純化后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定，得到均勻的長簇效果和高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。

1.3.4 SSR位點(diǎn)開發(fā)

在獲取拼接基因組序列后，使用MISA軟件對序列中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行檢測，SSR最小間距為200 bp，SSR選取標(biāo)準(zhǔn)分別為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和復(fù)合重復(fù)序列[18]。最小數(shù)量分別為10、6、5、5、5、5和5。在獲得SSR序列信息后，使用Primer 3.0對SSR序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得綿羊引物庫。隨機(jī)挑選100 對引物，此100 對引物擴(kuò)增完成時(shí)片段長度處于100～280 bp之間，平均片段大小為172 bp。用篩選出的100 條SSR引物對分別對3種樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.5 SSR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測

PCR體系：引物F：10 μmol/L（20～50 ng/μL），1 μL；引物R：10 μmol/L（20～50 ng/μL），1 μL；dNTP（mix）：10 μmol/L（20～50 ng/μL），1 μL；TaqBuffer（含MgCl2）：10×（20～50 ng/μL），0.2 μL；Taq酶：5 U/μL（20～50 ng/μL），0.5 μL；加入ddH2O 25 μL。

PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)以上步驟10 次。94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)以上步驟35 次。72 ℃修復(fù)延伸5～8 min。

通過6-羧基熒光素和6-羧基四甲基羅丹明熒光標(biāo)記獲得的SSR引物并通過PCR擴(kuò)增后，使用毛細(xì)管電泳檢測SSR分型，最后使用Genemapper軟件整理并分析SSR數(shù)據(jù)，導(dǎo)出每對引物的pdf峰圖文件，篩選并保留具有多態(tài)性且能夠產(chǎn)生高度特異性擴(kuò)增片段的微衛(wèi)星標(biāo)記引物。

1.3.6 多態(tài)性檢測和數(shù)據(jù)處理

從預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中挑出具有多態(tài)性的引物，對寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊（共計(jì)60個(gè)樣本）進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測。通過GenAIEx軟件計(jì)算各微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)（alleles number，Na）、平均有效等位基因數(shù)（effective alleles number，Ne）、平均觀測雜合度（observed het-erozygosity，Ho）、平均期望雜合度（expected heterozygosity，He），并使用POPGENE 3.2軟件計(jì)算各微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）[19-20]。Na是反映群體遺傳變異大小的一個(gè)指標(biāo)，等位基因數(shù)越多，其多態(tài)性越高。Ne是基因一致度的倒數(shù)，反映等位基因間的相互影響，也可作為群體遺傳變異的一個(gè)測度[21]。He主要是根據(jù)種群內(nèi)當(dāng)前優(yōu)勢等位基因的分布頻率來推算；Ho是隨機(jī)抽取兩個(gè)樣本的等位基因不相同的概率。雜合度能夠反映基因多樣性，群體的雜合度表示某位點(diǎn)為雜合子的 概率[22]。PIC最初用于連鎖分析時(shí)對標(biāo)記基因多態(tài)性的估計(jì)[23]，現(xiàn)常用來表示微衛(wèi)星多態(tài)性高低的程度[24-25]。

1.3.7 特異性引物的有效性與適用性檢驗(yàn)

將篩選出的特異性引物用于寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的肌肉和肝臟鑒別中，檢驗(yàn)特異性引物的有效性與適用性。純種寧夏灘羊、藏綿羊和新疆細(xì)毛羊分別5 只，分別多點(diǎn)取其肝臟和肌肉的不同部分，每個(gè)樣本為25 g，采樣完成后將樣品分裝，共計(jì)30個(gè)樣本，品種對應(yīng)分別標(biāo)記。寧夏灘羊的肝臟標(biāo)記為Liver 1～5，肌肉標(biāo)記為Muscle 1～5；新疆細(xì)毛羊的肝臟標(biāo)記為Liver 6～10，肌肉標(biāo)記為Muscle 6～10；藏綿羊的肝臟標(biāo)記Liver 11～15，肌肉標(biāo)記為Muscle 11～15。分別提取肝臟DNA和肌肉DNA，用特異性引物對不同品種和部位的樣本進(jìn)行SSR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量評估結(jié)果

A260nm/A280nm用于評估核酸樣品的純度[26]：純DNA的A260nm/A280nm為1.8[27]，如果比值低于1.8，則表示DNA被蛋白或酚類物質(zhì)污染，需要純化DNA樣品[28]。凝膠電泳檢測條帶清晰說明完整性良好，若有拖尾或條帶呈彌散狀，則表明DNA存在不同程度的降解[29]。由表1可知，樣本所提取全基因組DNA質(zhì)量濃度為 （128.4±0.02）ng/μL，總體積50 μL，樣本A260nm/A280nm為1.81±0.03，表明DNA未被蛋白或酚類物質(zhì)污染。 圖1為DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，顯示樣本主條帶清晰，表明DNA分子無降解，完整性好，DNA質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis profile of DNA

表1 DNA質(zhì)量結(jié)果Table 1 Results of DNA quality

2.2 文庫構(gòu)建結(jié)果分析

圖2為堿基含量分布折線圖，橫坐標(biāo)表示讀序內(nèi)相對位置，縱坐標(biāo)為讀序中該位置堿基組成百分比，不同顏色折線表示不同堿基。依據(jù)測序原理[30]可知，在使用隨機(jī)打斷策略制備文庫時(shí)，如果文庫隨機(jī)性較好，則在讀序不同位置堿基組成分布比較均勻，反映到圖中為折線無較大波動[31-32]。由圖2可知，圖中的折線無較大波動，說明文庫隨機(jī)性較好，在讀序不同位置的堿基組成分布比較均勻，可以保證后續(xù)分析的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

圖2 堿基含量分布折線圖Fig. 2 Base composition distribution

2.3 SSR位點(diǎn)分布結(jié)果

使用MISA檢測序列中的SSR位點(diǎn)，F(xiàn)ast QC可視化SSR位點(diǎn)分析結(jié)果，共計(jì)46 557個(gè)有效SSR位點(diǎn)序列。如圖3所示，其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和復(fù)合SSR個(gè)數(shù)和占比分別為9 318（20.30%）、10 185（21.80%）、8 162（17.50%）、706（1.50%）、687（1.40%）、22（0.10%）和17 478（37.40%）。

圖3 綿羊基因組不同重復(fù)類型SSR的分布比例Fig. 3 Proportions of different repeat types of SSRs in ovine genome

由圖4氣泡圖和箱線圖可以清晰看出SSR的數(shù)目、分布和分布密度情況。發(fā)現(xiàn)p1～p6類型即單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的占比普遍較低，而c和c*類型，即復(fù)合SSR的占比及分布明顯高于其他核苷酸重復(fù)類型；復(fù)合重復(fù)基元種類豐富，要遠(yuǎn)高于非復(fù)合SSR。觀察分析基因組中存在的復(fù)合重復(fù)基元發(fā)現(xiàn)，核苷酸重復(fù)基元組合差異明顯，主要包括(A)13(AA)6*、(A)12(AA)6*、(AA)6(A)13*、(A)14(AA)7*、(A)15(AA)7*(AAA)5*、(AA)7(A)14*等復(fù)合重復(fù)類型[33]。SSR位點(diǎn)的豐富度分布模式和占比情況與耿多等[34]利用MISA查找拼接序列SSR位點(diǎn)，分析SSR序列特征的結(jié)果相同。

圖4 綿羊基因組SSR重復(fù)單元分布箱線圖（A）和氣泡圖（B）Fig. 4 Boxplot (A) and bubbleplot (B) of SSR repeat unit distribution in ovine genome

2.4 SSR引物篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)選取分別來自寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊3個(gè)品種綿羊的DNA為模板，隨機(jī)挑選100 對引物，合成100 對引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測。如圖5所示，在100 對引物中篩選出50 對在3種綿羊中具有不同程度明亮清晰度的引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。引物序號分別為1、2、3、4、5、6、10、11、12、14、15、19、20、21、22、24、36、38、42、45、49、50、51、52、56、61、62、63、65、67、69、70、74、76、77、78、79、84、85、86、88、89、92、93、95、96、97、98、99、100（標(biāo)注處為挑選的適宜引物）。

圖5 綿羊基因組SSR引物凝膠電泳圖Fig. 5 Electrophoresis profiles of PCR amplification productions of ovine genome with SSR primers

2.5 基因組SSR引物的篩選

在初步篩選的50 對引物中，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果及毛細(xì)管電泳峰圖檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有10 對SSR引物成功擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶，且具有豐富又穩(wěn)定的多態(tài)性。該10 對引物詳細(xì)信息見表2，片段大小在102～269 bp之間，退火溫度在59～61 ℃之間。其余引物擴(kuò)增不成功主要是由于出現(xiàn)了明顯雜帶或擴(kuò)增產(chǎn)物片段與預(yù)期產(chǎn)物片段大小不符的情況[35]。

表2 綿羊基因組SSR引物信息Table 2 Information of SSR primers used for amplification of ovine genome

2.6 基因組SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

將篩選的10 對基因組SSR引物，對寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊共計(jì)60個(gè)樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，10 對基因組SSR引物在寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊群體中均能檢測到多態(tài)性，但多態(tài)性水平有所不同。 表3為10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果顯示，寧夏灘羊各參數(shù)平均值為Na 4.100、Ne 3.782、Ho 1.007、He 0.704、PIC 0.432，為中等多態(tài)性引物。新疆細(xì)毛羊各參數(shù)平均值為Na 3.100、Ne 2.747、Ho 1.009、He 0.615、PIC 0.414，為中等多態(tài)性引物。藏綿羊Na 3.600、Ne 3.193、Ho 0.953、He 0.660、PIC 0.425，為中等多態(tài)性引物。當(dāng)Ne低于Na時(shí)，說明在基因組中存在一些高頻率的等位基因，以上結(jié)果表明，本研究獲得的10 對引物存在高頻率的等位基因，擴(kuò)增的SSR位點(diǎn)豐富。10 對引物在3個(gè)綿羊群體有較高的遺傳多樣性水平，其中寧夏灘羊在10個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多態(tài)程度要高于藏綿羊和新疆細(xì)毛羊，表明多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的選用對群體統(tǒng)計(jì)指標(biāo)具有較大的影響。PIC存在差異可能是有兩方面的原因：一方面可能是使用的微衛(wèi)星標(biāo)記的種類和具體位點(diǎn)不同；另一方面可能是檢測方法所產(chǎn)生的遺傳多態(tài)性差異。

表3 10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of ten microsatellite loci

2.7 綿羊肉基因組SSR引物特異性檢測分析

通過對寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊所檢測的50個(gè)基因組SSR標(biāo)記位點(diǎn)峰圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中3 對引物能夠顯著區(qū)分3種綿羊品種。圖6～8分別為scaffold632:150-463、scaffold31384:146-461和scaffold7676:103-270對寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的毛細(xì)管電泳圖結(jié)果。

根據(jù)SSR分型峰圖，分別建立了寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的SSR標(biāo)準(zhǔn)分型峰值譜圖。由圖6可知，scaffold632:150-463引物對灘羊的特征值大小為207.96 bp和210.28 bp，對新疆細(xì)毛羊和藏綿羊特征值大小分別是215.17 bp和215.24 bp，表明scaffold632:150-463熒光引物對寧夏灘羊源性肉特異性良好，可以對寧夏灘羊與新疆細(xì)毛羊和藏綿羊進(jìn)行區(qū)分。由圖7可知，scaffold31384:146-461引物對新疆細(xì)毛羊的特征值大小為228.37 bp和231.45 bp，對寧夏灘羊和藏綿羊特征值大小分別是230.39 bp和230.41 bp，表明scaffold31384:146-461熒光引物對新疆細(xì)毛羊源性肉特異性良好，能夠?qū)π陆?xì)毛羊與寧夏灘羊和藏綿羊進(jìn)行區(qū)分。由圖8可知，scaffold7676:103-270引物對藏綿羊的特征值大小為94.83 bp和110.46 bp，對寧夏灘羊和新疆細(xì)毛羊特征值大小分別是111.46 bp和111.45 bp，表明scaffold7676:103-270熒光引物對藏綿羊肉特異性良好，能夠?qū)Σ鼐d羊與新疆細(xì)毛羊和寧夏灘羊進(jìn)行區(qū)分。

圖6 綿羊基因組scaffold632:150-463位點(diǎn)SSR電泳圖Fig. 6 Capillary electrophoregrams of ovine genome with primer scaffold632:150-463 genomic

圖7 綿羊基因組scaffold31384:146-461位點(diǎn)SSR電泳圖Fig. 7 Capillary electrophoregrams of ovine genome with primer scaffold31384:146-461

圖8 綿羊基因組scaffold7676:103-270位點(diǎn)SSR電泳圖Fig. 8 Capillary electrophoregrams of ovine genome with primer scaffold7676:103-270

2.8 特異性引物的有效性與適用性檢驗(yàn)結(jié)果

2.8.1 DNA提取質(zhì)量評估

分別對提取得到的3種綿羊肝臟DNA和肌肉DNA進(jìn)行質(zhì)量評估，結(jié)果見表4。樣本所提取肌肉DNA質(zhì)量濃度為（125.6±0.02）ng/μL，總體積50 μL，樣本A260nm/A280nm為1.80±0.04；樣本所提取肝臟DNA質(zhì)量濃度為（128.9±0.01）ng/μL，總體積50 μL，樣本A260nm/A280nm為1.82±0.03。表明DNA未被蛋白或酚類物質(zhì)污染。圖9為DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，顯示樣本主條帶清晰，表明DNA完整性好，DNA分子無降解。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，3種綿羊的肝臟DNA和肌肉DNA的提取質(zhì)量相差不大，且相同體積下，肝臟DNA的質(zhì)量濃度更高。一般來說，脊椎動物的肌肉、心臟、肝、腎、脾等器官組織都是DNA的良好來源，但肝臟的DNA產(chǎn)量最大。動物DNA的提取多以肝臟為原料，這是由于肝臟是可以不斷產(chǎn)生新細(xì)胞的器官，很多細(xì)胞處在分裂期，此時(shí)DNA呈現(xiàn)高度螺旋狀態(tài)，通過微量采樣就可以提取得到大量DNA，能夠滿足各種涉及PCR的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[36]。李龍飛等[37]通過采集雞的肝臟、血液、羽髓等不同部位樣品，采用不同處理程序提取樣品基因組DNA。結(jié)果表明，雞肝臟（50 mg）樣品的基因組DNA提取量與雞微量血液（50 μL）和羽髓樣品的基因組DNA提取量相當(dāng)。蔡振媛等[38]為確定一種方便的野外動物樣品保存方法，用不同方法處理高原鼠肌肉和肝臟組織，并提取基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)對提取的基因組總DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：通過相同方式處理并提取的肝臟DNA產(chǎn)量比肌肉組織高，說明肝臟是理想的基因組DNA提取樣本。

表4 DNA質(zhì)量結(jié)果Table 4 Results of DNA quality

圖9 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig. 9 Electrophoresis profile of DNA

2.8.2 3 條特異性引物的毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果

將提取的寧夏灘羊、藏綿羊和新疆細(xì)毛羊的肝臟和肌肉DNA，采用3 條熒光引物分別擴(kuò)增后，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，檢測結(jié)果見表5。引物scaffold632:150-463的毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果表明，Liver 1～5、Muscle 1～5，共5 只綿羊?yàn)閷幭臑┭颍灰飐caffold31384:146-461的毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果顯示，Liver 6～10、Muscle 6～10，共5 只綿羊?yàn)樾陆?xì)毛羊；引物scaffold7676:103-270的毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果顯示，Liver 11～15、Muscle 11～15，共5 只綿羊?yàn)椴鼐d羊。說明通過SSR方法獲得的3 條熒光引物對寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的肌肉和肝臟特異性和適用性均良好，能夠?qū)@3種綿羊肉進(jìn)行有效區(qū)分。

表5 特異性引物驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Verification of specific primers

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)提取純種寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的肝臟DNA，DNA提取結(jié)果表明DNA無污染且完整性好。利用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建、擴(kuò)增、純化和質(zhì)控，結(jié)果表明文庫堿基質(zhì)量良好，隨機(jī)性較好，堿基組成分布比較均勻，實(shí)現(xiàn)綿羊全基因組成功建庫。通過50 對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并使用毛細(xì)管電泳檢測SSR分型后，挑選多態(tài)性引物對寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊樣本進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測。結(jié)果顯示，有10 對SSR引物成功擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶，具有豐富又穩(wěn)定的多態(tài)性。將10 對多態(tài)性SSR引物對寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊進(jìn)行遺傳多樣性分析。其中，寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的平均Na分別為4.100、3.100和3.600；平均Ne分別為3.782、2.747和3.193；平均Ho分別為1.007、1.009和0.953；平均He分別為0.704、0.615和0.660；平均PIC分別為0.432、0.414和0.425，說明寧夏灘羊的遺傳多態(tài)程度要高于藏綿羊和新疆細(xì)毛羊。毛細(xì)管熒光電泳檢測峰圖結(jié)果表明：scaffold632:150-463熒光引物對寧夏灘羊源性肉特異性良好，scaffold31384:146-461熒光引物對新疆細(xì)毛羊源性肉特異性良好，scaffold7676:103-270熒光引物對藏綿羊肉特異性良好；這3 對引物能夠?qū)崿F(xiàn)對寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的有效區(qū)分，且對于不同品種的羊肉檢測有很好的適用性。此研究成功建立我國西北地區(qū)3個(gè)綿羊品種的基因庫，科學(xué)準(zhǔn)確鑒別3個(gè)品種純種綿羊肉，不僅進(jìn)一步擴(kuò)大了寧夏純種灘羊的鑒別范圍，保證寧夏純種灘羊的優(yōu)勢，而且對于西部地區(qū)綿羊肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展以及科學(xué)開發(fā)利用也具有重要的指導(dǎo)意義。