固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中那西肽殘留

肖陳貴，沈金燦，朱萍萍，趙鳳娟，郭偉杰，康海寧，岳振峰

（深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心，深圳市食品安全檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東 深圳 518045）

那西肽是一種帶5個噻唑環(huán)的含硫多肽類抗生素，分子式為C51H43N13O12S6，由12個氨基酸及其衍生物組成，于1961年由法國科學(xué)家在鏈霉素的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)[1-3]。 那西肽具有抗病毒、抗菌的作用，對動物有明顯的促生長作用，已被作為一種良好的動物添加劑廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[4]。1998年我國將其批準(zhǔn)為國家3 類新 獸藥[5]，農(nóng)業(yè)部公告第168號明確將那西肽作為飼料藥物添加劑[6]。藥物性添加劑長期或過量濫用及不遵循休藥期使用，會對細(xì)菌耐藥，且緩慢蓄積引起器官的功能紊亂，對動物及人類健康產(chǎn)生危害[7]。為保障動物性食品安全，農(nóng)業(yè)部第278號公告中規(guī)定了那西肽雞的休期為7 d，且產(chǎn)蛋期禁用[8]；其他國家如日本，規(guī)定了雞和豬的肌肉、肝臟等組織那西肽的最高殘留限量均為30 μg/kg[9]。近年來多肽類抗生素的殘留逐漸受到關(guān)注，建立雞蛋中那西肽殘留的監(jiān)測方法，對保障動物源性食品的安全具有重要意義。

目前報道的那西肽殘留分析方法有高效液相色譜紫外檢測法[10-11]、高效液相色譜熒光檢測法[12-16]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18]等，研究對象包括制劑、飼料、動物肌肉、肝臟和腎臟組織等[10-18]， 雞蛋基質(zhì)中那西肽的殘留分析鮮見報道。由于那西肽禁止用于產(chǎn)蛋雞，高效液相色譜法存在靈敏度較差、抗干擾能力不強、無法確證分析能力等缺點，難以滿足雞蛋中那西肽的殘留要求；采用氣相色譜-質(zhì)譜測定，方法的前處理需進行衍生，操作復(fù)雜且穩(wěn)定性較差。近年來，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法檢測方法在痕量分析中得到廣泛應(yīng)用[18-20]，特別是對于多肽類抗生素殘留測定十分常見[21-25]，如王玉琴等[22]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中萬古霉素、去甲萬古霉素和桿菌肽A，劉佳佳等[23]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中5種多肽類抗生素。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定那西肽面臨的一大困難是那西肽的碎片離子信號強度低[21]，難以直接測定；為此，Song Xuqin等[21]采用堿水解法通過間接分析那西肽的降解產(chǎn)物HMIA而實現(xiàn)了那西肽的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，該方法實驗過程相對繁瑣，且測定的目標(biāo)物為降解產(chǎn)物而非那西肽原型，容易引起誤判。目前鮮見那西肽液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定的報道。因此，本實驗建立那西肽HPLC-MS/MS直接測定法，并結(jié)合固相萃取技術(shù)實現(xiàn)雞蛋中痕量那西肽的快速、靈敏、準(zhǔn)確測定，旨在為雞蛋中那西肽的殘留監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋 市購。

甲醇、乙腈、正己烷、乙酸銨（均為色譜純）， 二甲基亞砜（分析純） 上海安譜實驗科技股份有限 公司；甲酸（分析純） 江蘇永華化學(xué)股份有限公司；無水硫酸鈉（分析純） 上海國藥集團化學(xué)試劑有限 公司；那西肽標(biāo)準(zhǔn)品（純度77.6%） 廣州碩譜生物科技有限公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LCMS-8050型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、DGU-20A5R高效液相色譜儀 日本島津公司；Accucore RP-MS色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm） 美國Fisher科 技公司；HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg，使用前用3 mL甲醇活化） 美國Waters公司；3K18型離心機 德國Sigma公司；5982-9120固相萃取裝置 美國Agilent公司；TurboVap LV型氮吹濃縮儀 瑞典Biotage公司；EOFO-945066型漩渦混合器 美國Talkboys公司；0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取那西肽12.9 mg，用250 μL二甲基亞砜溶解，乙腈定容至50 mL，制得200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-20 ℃避光保存，有效期為2個月。將質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋為5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20 ℃下避光保存，有效期為1個月。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 樣品制備雞蛋樣品，經(jīng)高速組織搗碎機均勻搗碎，裝入干凈容器內(nèi)，加封后做好標(biāo)記，將試樣于-20 ℃保存。

1.3.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.01 g）均質(zhì)試樣，于50 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入8 mL 1%甲酸-乙腈提取液，渦旋振蕩10 min，9 500 r/min離心5 min，取上清液于另一50 mL離心管中，加入8 mL 1%甲酸-乙腈再次提取，渦旋振蕩10 min，離心5 min，合并2 次提取液，加入水定容至20 mL，混合均勻。準(zhǔn)確吸取10 mL混合提取液于15 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入3 mL乙腈飽和正己烷，上下輕搖20 次，9 500 r/min離心5 min，收集乙腈層。收集液以1 s/滴的速率過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，抽干，收集全部流出液。流出液中加入1 g無水硫酸鈉，渦旋混合1 min，9 500 r/min離心5 min，靜置分層，取上清液于15 mL刻度玻璃管中。將上清液50 ℃吹氮濃縮至0.5 mL左右，加入含2%甲酸的乙腈溶液定容至1 mL，混勻，過0.22 μm微孔濾膜，供HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 檢測條件

HPLC條件：Accucore RP-MS色譜柱（100 mm× 2.1 mm，2.6 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積20 μL；流動相A：10 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B：乙腈；流速200 μL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，70% A，30% B；1～5 min，流動相B線性增至90%，保持1 min；6.1～8 min，70% A，30% B。

MS條件：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；碰撞氣為氬氣；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple teaction monitoring，MRM）；霧化器流量3 L/min；加熱氣流量10 L/min；接口溫度300 ℃；脫溶劑溫度526 ℃；傳輸線溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；干燥氣流量10 L/min；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 那西肽質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of mass spectrometry for the determination of nosiheptide

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用日本島津公司的Labsolutions軟件對檢測數(shù)據(jù)進行處理，采用Excel軟件對結(jié)果進行分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇

雞蛋中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等，基質(zhì)復(fù)雜。乙腈具有極性適中、穿透力強的特點，常被用于樣品中那西肽的提取[12-15]；此外，由于雞蛋中含有大量蛋白質(zhì)，采用乙腈進行提取可以快速將蛋白質(zhì)變性，減少蛋白質(zhì)的干擾。實驗曾參考文獻[12-15]采用純乙腈作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用純乙腈提取回收率低；考慮到溶液的酸堿性對樣品提取效果有很大影響，因此實驗進一步比較了1%甲酸-乙腈、1%氨水-乙腈及純乙腈3種提取液對目標(biāo)物的提取效率，結(jié)果如圖1所示。在加標(biāo)質(zhì)量濃度為10 μg/kg條件下，3種不同提取溶液提取效率有明顯差異。采用純乙腈提取其回收率在40%以下；在乙腈中加入酸或堿，均能有效提升提取效率，加入1%氨水，回收率提升到60%左右；而加入1%甲酸，回收率提高到80%以上，這可能是加入甲酸酸化后，蛋白質(zhì)的極性增加，從而減少了變性蛋白質(zhì)對那西肽的吸附，因而提取效率得到顯著提升。為進一步細(xì)化甲酸的用量，分別考察0.5%、1%、1.5%、2%和3%的甲酸溶液對目標(biāo)物提取的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)甲酸溶液體積分?jǐn)?shù)低于1.5%時，回收率較高，在90%以上；超過1.5%時，回收率逐步下降。因此，最終選用1%甲酸-乙腈作為提取溶液。

圖1 不同提取液的提取效率Fig. 1 Effect of different extraction solvents on nosiheptide recovery

圖2 甲酸體積分?jǐn)?shù)對回收率的影響Fig. 2 Effect of formic acid concentration on nosiheptide recovery

2.2 凈化條件的選擇

乙腈提取液中含有部分油脂，實驗采用正己烷對提取液進行脫脂，脫脂后的提取溶液呈淺黃色。為了進一步去除其中色素，實驗通過固相萃取柱去除，分別比較HLB、C18兩種固相萃取柱對回收率的影響。在加標(biāo)量為10 μg/kg條件下，將提取液分別過2種不同固相萃取柱，考察其對回收率的影響。結(jié)果表明，2種固相萃取柱均具有較好的除色效果，過固相萃取液后提取液無色、透明、澄清；過柱后的回收率良好，C18的回收率為87%，HLB回收率為96%。因此，最終選擇HLB固相萃取柱進行凈化。

2.3 濾膜的影響

那西肽為多肽類物質(zhì)，不同材料濾膜可能對回收率有較大影響。本實驗將5 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別過聚四氟乙烯膜和聚酰胺有機膜2種不同類型微孔濾膜。結(jié)果表明采用聚四氟乙烯膜回收率為94%，而采用常規(guī)的聚酰胺有機濾膜回收率僅為63%，該結(jié)果表明常用的聚酰胺膜對那西肽有較強的吸附作用。因此，實驗選擇聚四氟乙烯材質(zhì)濾膜。

2.4 測定條件的優(yōu)化

取0.5 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，以流動注射的方式在負(fù)離子模式下進行一級質(zhì)譜全掃描，得到那西肽的準(zhǔn)分子離子峰（[M-H]-）m/z1 220，[M-H]-母離子再通過二級質(zhì)譜全掃描，[M-H]-離子在碰撞池發(fā)生碎裂產(chǎn)生不同的碎片離子（圖3），主要碎片有m/z1 176、1 017和973。Song Xuqin等[21]發(fā)現(xiàn)那西肽無論是采用電噴霧電離或大氣壓化學(xué)電離都只能得到低強度的碎片離子，本實驗也發(fā)現(xiàn)當(dāng)碰撞能量小于30 eV時，無法得到有效的碎片離子；但是，在較高碰撞能量（45 eV）條件下，那西肽能夠通過碰撞得到多個明顯的碎片離子，如圖3所示。這可能是由于那西肽為環(huán)狀多肽，分子結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，且分子較大（相對分子質(zhì)量超過1 000），因此需要較高碰撞能量才能碎裂。對得到的主要碎片離子進行解析，結(jié)果如圖4 所示。發(fā)生碎裂的位置為酯基兩側(cè)和圖中標(biāo)示的C—S鍵處，準(zhǔn)分子離子[M-H]-丟掉碎片a得到[M-H-a]-， 對應(yīng)相對分子質(zhì)量1 176；[M-H]-丟掉碎片b得到 [M-H-b]-，對應(yīng)相對分子質(zhì)量1 017；[M-H]-同時丟掉碎片a和碎片b得到[M-H-a-b]-，對應(yīng)相對分子質(zhì)量973。m/z973和m/z1 176豐度較高，故最終選擇作為定量、定性離子。以MRM負(fù)離子模式優(yōu)化碰撞電壓、霧化器流量、加熱氣流量、脫溶劑溫度、加熱塊溫度、干燥氣流量等各質(zhì)譜參數(shù)，得到最佳質(zhì)譜條件見表1。

圖3 那西肽質(zhì)譜圖Fig. 3 MS/MS spectrum of nosiheptide

圖4 那西肽質(zhì)譜碎裂途徑Fig. 4 Fragmentation pathways of nosiheptide

那西肽為多肽類抗生素，分子上帶有多個氨基和羥基等極性基團，流動相的緩沖鹽對其在色譜的保留及質(zhì)譜響應(yīng)有重要影響。常用的有機相有甲醇和乙腈，由于那西肽在乙腈中具有較好的溶解性，因此選擇乙腈作為有機相。那西肽質(zhì)譜檢測采用負(fù)離子模式，中性或偏堿環(huán)境更有利于質(zhì)譜負(fù)離子的產(chǎn)生，因此采用質(zhì)譜檢測中常用的醋酸銨溶液作為水相，該溶液能夠?qū)⑷芤簆H值有效控制在中性條件。在相同梯度洗脫條件下考察2、5 mmol/L和10 mmol/L醋酸銨溶液對質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。該結(jié)果表明10 mmol/L醋酸銨作為水相時響應(yīng)最高，即較高濃度的醋酸銨有利于質(zhì)譜響應(yīng)的提高，這主要是溶液中的醋酸根離子有助于負(fù)離子的產(chǎn)生[26-27]， 但高濃度的鹽溶液容易在質(zhì)譜錐孔沉積而導(dǎo)致堵塞，因此最終采用10 mmol/L醋酸銨作為水相。采用優(yōu)化后的梯度洗脫條件，實現(xiàn)了5 min內(nèi)那西肽的快速測定。

圖5 醋酸銨水相質(zhì)量濃度對質(zhì)譜信號強度的影響Fig. 5 Effect of aqueous phase concentration of ammonium acetate on mass spectrometric signal intensity

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是與分析物共同洗脫并干擾質(zhì)譜儀電離過程的基質(zhì)物質(zhì)引起的，導(dǎo)致檢測信號的增強或抑制，可影響儀器的靈敏度和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[28-29]。采用基質(zhì)匹配和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線，公式如下：ME/%=（S1/S2-1）×100。其中，S1為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；S2為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。計算結(jié)果為負(fù)數(shù)，顯示基質(zhì)為抑制作用，為正數(shù)顯示為增強作用。通常，|ME|≤10%時，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略不計；|ME|在10%～20%之間，存在較弱的基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＞20%，存在強基質(zhì)效應(yīng)[21,30]。考察本方法的基質(zhì)效應(yīng)，實驗結(jié)果表明，那西肽化合物的ME為-67.3%，存在強基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此，本研究在定量分析中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 方法的線性范圍與檢出限、定量限

在空白樣品提取液中添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L），采用本方法測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進行線性擬合，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，那西肽在1.0～20.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性方程為y=710.936x-168.718，線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.998。在最低添加水平下，以3 倍和10 倍信噪比結(jié)合濃度外推法確定方法的檢出限和定量限，那西肽的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。雞蛋樣品添加1.0 μg/kg的MRM色譜圖如圖6所示。

圖6 雞蛋中加標(biāo)1.0 μg/kg那西肽的MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatogram of egg samples spiked with 1.0 μg/kg nosiheptide

Song Xuqin等[21]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法通過測定那西肽堿水解產(chǎn)物4-羥甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸實現(xiàn)豬、雞和魚等動物組織中那西肽的測定，方法的定量限為2.0 μg/kg，回收率為85%～108%。與該方法相比，本方法通過對那西肽完整化合物進行HPLC-MS/MS分析，方法更為直接、簡便，不容易導(dǎo)致假陽性，且靈敏度也更高。

2.7 樣品測定

以不含有那西肽的雞蛋樣品作為空白樣品，在空白雞蛋樣品中分別添加1.0、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg那西肽標(biāo)準(zhǔn)，每個添加水平平行測定6個樣品，進行回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差檢測，結(jié)果如表2所示。在添加量范圍內(nèi)，那西肽的平均回收率為83.8%～96.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.0%～8.8%。陳慧華等[15]采用高效液相色譜法測定動物肌肉、肝臟組織中那西肽殘留量，平均回收率為73.8%～93.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～11.1%；Song Xuqin等[21]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬、雞和魚等動物組織中那西肽殘留，回收率為85%～108%；與兩者相比，本方法的準(zhǔn)確度基本處于同一水平。采集深圳地區(qū)不同超市的10 份雞蛋樣品采用本方法進行檢測，未在樣品中檢出那西肽殘留。

表2 雞蛋中那西肽分析方法回收率及精密度（n=6）Table 2 Recoveries and precision (RSDs) for egg samples spiked at three different concentration levels (n = 6)

3 結(jié) 論

基于HPLC-MS/MS技術(shù)，建立那西肽的直接分析方法。樣品經(jīng)酸化乙腈提取，正己烷脫脂后采用固相萃取凈化除雜，通過HPLC-MS/MS聯(lián)用儀進行測定。本方法具有操作簡便、靈敏度高、回收率好、具有確證能力等優(yōu)勢，能夠滿足我國法規(guī)對于雞蛋中那西肽殘留的監(jiān)管要求，為雞蛋中那西肽的檢測提供了重要技術(shù)支撐。