伯格替尼通過(guò)抑制EGFR磷酸化增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的輻射敏感性

胡關(guān)朔，趙國(guó)平

結(jié)直腸癌是第三大最常見的癌癥[1]，在世界范圍內(nèi)，每年有超過(guò)180萬(wàn)結(jié)直腸癌新增病例，88萬(wàn)例與結(jié)直腸癌有關(guān)的死亡報(bào)告[2]。臨床上，手術(shù)切除被認(rèn)為是結(jié)直腸癌的主要治療手段，放療被認(rèn)為是手術(shù)前后有效的治療方式[3]。因此，迫切需要適當(dāng)?shù)牟呗詠?lái)提高結(jié)直腸癌的輻射敏感性。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，EGFR磷酸化激活下游通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，輻射之后磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體(p-EGFR)表達(dá)顯著升高，p-EGFR通過(guò)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活[4-7]。抑制EGFR磷酸化可能是提高腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的有效手段。該文以輻射作為處理腫瘤細(xì)胞的治療手段，伯格替尼作為EGFR磷酸化抑制劑，以結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞作為研究對(duì)象，旨在通過(guò)使用伯格替尼抑制EGFR磷酸化，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞輻射敏感性，從而為結(jié)直腸癌治療提供可能的治療方案。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與輻射處理人結(jié)腸癌細(xì)胞系LOVO購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，在DMEM/F12 (美國(guó)HyClone公司)培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均以10%胎牛血清(以色列Biological公司)和1%青霉素/鏈霉素(上海碧云天公司)在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

以伽馬射線輻射器(Biobeam GM X irradiator, 德國(guó)Leipzig公司)作為輻射源，使用高能伽馬射線照射細(xì)胞，劑量率為3.27 Gy/min，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。設(shè)備每年由廠家進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)，保證輻射劑量的精度。

1.2 細(xì)胞活力測(cè)試CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。在96孔板中接種細(xì)胞懸液，5 000個(gè)/孔細(xì)胞，伯格替尼(1 000 nmol/L)處理細(xì)胞。藥物治療48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(optical density, OD)值。

1.3 化學(xué)品及試劑EGFR、p-EGFR(美國(guó)CST公司), cleaved caspase-9、cleaved caspase-7、cleaved caspase-3、γ-H2AX、ACTIN(中國(guó)proteintech公司), CCK-8(合肥biosharp公司)，伯格替尼(上海MCE公司)，膜蛋白提取試劑盒(上海碧云天公司)。

1.4 免疫熒光將細(xì)胞接種于玻片上，用PBST洗滌細(xì)胞3次(每次10 min)，再于室溫下用100%甲醇固定20 min。在室溫下用 0.5% Triton X-100滲透細(xì)胞30 min，1% BSA在PBST(0.1%，TritonX-100)中在室溫封閉1 h，滴加相應(yīng)兔來(lái)源的單克隆抗體(p-EGFR，1 ∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌3次，滴加相應(yīng)的熒光二抗室溫避光孵育30 min。PBST洗滌3次，細(xì)胞核用DAPI孵育3 min。PBST洗滌3次，玻片面朝下置于在玻片上，滴加含有抗熒光淬滅劑的封片劑封片，熒光顯微鏡檢測(cè)熒光。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)分別收集EGFR敲低、單獨(dú)輻射處理、單獨(dú)伯格替尼處理的LOVO細(xì)胞，以及輻射和伯格替尼聯(lián)合處理的LOVO細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，往細(xì)胞中加入適量RIPA裂解液(含有羅氏蛋白酶抑制劑)，冰上充分裂解，提取蛋白并進(jìn)行定量。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉TBST封閉液于室溫封閉1 h。孵育相應(yīng)來(lái)源的單克隆抗體[鼠抗ACTIN(1 ∶1 000)，γ-H2AX(1 ∶1 000)，兔抗：EGFR(1 ∶1 000)，p-EGFR(1 ∶1 000)，cleaved caspase-9(1 ∶1 000)，cleaved caspase-7(1 ∶1 000)和cleaved caspase-3(1 ∶1 000)], 4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，熒光檢測(cè)。

1.6 流式細(xì)胞分析用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞重新懸浮在1×緩沖液中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml。將104個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5 ml的培養(yǎng)管中。添加5 μl FITC Annexin V和5 μl PI。輕輕渦旋細(xì)胞，并在室溫避光孵育15 min。在每管中添加400 μl緩沖液，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀分析。

1.7 DR-GFP質(zhì)粒質(zhì)粒由軍事科學(xué)院王治東實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。細(xì)胞通過(guò)兩種主要途徑修復(fù)DSBs：非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重組(homologous recombination，HR)。NHEJ和HR的發(fā)生往往與過(guò)早衰老和腫瘤發(fā)生有關(guān)，因此用定量的方法來(lái)測(cè)量每個(gè)DSB修復(fù)途徑是很重要的。課題組利用已經(jīng)開發(fā)的熒光報(bào)告結(jié)構(gòu)DR-GFP，測(cè)量NHEJ和HR。該結(jié)構(gòu)是基于一個(gè)工程GFP基因，包含一個(gè)罕見的切割I(lǐng)-SceI內(nèi)切酶誘導(dǎo)DSBs的識(shí)別位點(diǎn)。起始結(jié)構(gòu)為GFP陰性，因?yàn)镚FP基因被額外的外顯子或突變滅活。 成功修復(fù)I-SceI誘導(dǎo)的NHEJ或HR斷裂，恢復(fù)功能性GFP基因。通過(guò)流式細(xì)胞分析術(shù)細(xì)胞測(cè)量計(jì)算的GFP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而提供了NHEJ或HR效率的定量測(cè)量。

1.8 構(gòu)建EGFR敲低的LOVO穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系使用三質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建慢病毒顆粒(pLKO.1，psPAX2和pMD2.G)，psPAX2和pMD2.G是輔助包裝質(zhì)粒。目標(biāo)序列為 5′-CCCGTCGCTATCAAGGAATTA-3′，構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系使用含嘌呤霉素(1.5%)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 輻射誘導(dǎo)EGFR磷酸化水平升高通過(guò)Western blot方法檢測(cè)EGFR和p-EGFR的表達(dá)水平。使用4 Gy的輻射劑量，在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)EGFR和p-EGFR的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示輻射處理細(xì)胞24 h后p-EGFR的含量到達(dá)最高值(圖1A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.335，P<0.01)，用不同劑量(0～8 Gy)輻射處理LOVO細(xì)胞，24 h后對(duì)LOVO細(xì)胞的EGFR和p-EGFR的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。隨著輻射劑量的升高，EGFR的磷酸化水平升高(圖1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.115，P<0.01)。

2.2 輻射誘導(dǎo)細(xì)胞膜上EGFR磷酸化水平升高不同劑量(0～8Gy)輻射處理LOVO細(xì)胞，24 h后提取LOVO細(xì)胞的膜蛋白并對(duì)EGFR磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)，Western blot結(jié)果顯示，隨著輻射劑量的增加，細(xì)胞膜上EGFR的磷酸化水平增高(圖2A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.332，P<0.01)。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)磷酸化EGFR的定位，4 Gy輻射處理，24 h后對(duì)LOVO細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)，結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，輻射處理之后細(xì)胞膜上EGFR磷酸化水平增高(圖2B)。綜上結(jié)果，EGFR是通過(guò)自身磷酸化響應(yīng)輻射。

2.3 伯格替尼呈劑量依賴性抑制EGFR磷酸化水平采用不同濃度的伯格替尼(0、10、100、500、1 000、3 000 nmol/L)處理細(xì)胞48 h后檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示隨著伯格替尼濃度的升高，LOVO細(xì)胞活力被抑制(圖3A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.365，P<0.01)。Western blot分析結(jié)果顯示，EGFR的磷酸化水平隨著藥物濃度的增加而降低(圖3B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=132.336，P<0.01)。

圖1 輻照誘導(dǎo)EGFR磷酸化水平升高

圖2 輻照誘導(dǎo)細(xì)胞膜上EGFR磷酸化水平升高

圖3 伯格替尼呈劑量依賴性抑制EGFR磷酸化水平

2.4 伯格替尼處理結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO可以抑制非同源末端連接課題組構(gòu)建了EGFR敲低的LOVO細(xì)胞系，Western blot檢測(cè)敲低效果，在EGFR敲低的細(xì)胞系中，EGFR和p-EGFR的表達(dá)顯著降低(圖4A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.331，P<0.01)。EGFR通過(guò)參與非同源末端連接促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，使用DR-GFP系統(tǒng)進(jìn)行檢驗(yàn)，該系統(tǒng)的原理如圖所示(圖4B)I-Sce切割A(yù)D區(qū)域產(chǎn)生非同源末端，如果細(xì)胞內(nèi)存在非同源末端連接，則斷裂區(qū)域可被修復(fù)，報(bào)告基因GFP表達(dá)，發(fā)出綠光。使用DR-GFP質(zhì)粒系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞非同源末端連接水平，結(jié)果顯示在敲低EGFR的LOVO細(xì)胞中非同源末端連接被抑制，伯格替尼處理之后，非同源末端連接被抑制(圖4C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.851，P<0.01)。

2.5 伯格替尼處理可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的輻射敏感性濃度為1 000 nmol/L的伯格替尼處理細(xì)胞24 h之后進(jìn)行4 Gy輻射處理，輻射之后24 h進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示γ-H2AX、cleaved caspase-3、cleaved caspase-7和 cleaved caspase-9表達(dá)升高(圖5A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Annexinv FITC/PI 雙標(biāo)記法檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞總凋亡率分別為(6.7±2.3)%、(29.1±3.1)%、(8.2±2.2)%、(33.3±2.5)% (圖5B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.674，P<0.01)。

圖4 伯格替尼處理結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO可以抑制非同源末端連接

圖5 伯格替尼處理可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌LOVO的輻射敏感性

3 討論

結(jié)直腸癌是威脅人類健康的一種重大疾病，放療是治療結(jié)直腸癌的一種有效手段，但細(xì)胞內(nèi)損傷修復(fù)機(jī)制的激活會(huì)使結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放療產(chǎn)生抵抗[8]。EGFR信號(hào)通路的激活是產(chǎn)生輻射抵抗的關(guān)鍵因素，EGFR對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化起著重要作用，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)[9]。因此探究EGFR信號(hào)通路在損傷修復(fù)中的作用對(duì)結(jié)直腸的放療至關(guān)重要。

EGFR活化后可以激活ERK和AKT通路促進(jìn)細(xì)胞存活，并且以磷酸化形式轉(zhuǎn)位入核參與DNA損傷修復(fù)，通過(guò)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)減少細(xì)胞凋亡[10]，這可能是癌細(xì)胞產(chǎn)生輻射抗性的主要原因。本研究顯示，輻射之后結(jié)直腸癌細(xì)胞中EGFR的磷酸化水平升高，本實(shí)驗(yàn)使用DR-GFP質(zhì)粒驗(yàn)證EGFR主要通過(guò)參與非同源末端連接修復(fù)導(dǎo)致輻射抵抗，與之前的報(bào)道[11]一致。因此抑制EGFR的磷酸化可能是提高結(jié)直腸癌細(xì)胞輻射敏感性的有效手段。

伯格替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，于2016年5月被食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，可以有效抑制AKT陽(yáng)性，三突變的EGFR癌細(xì)胞，并在非小細(xì)胞肺癌中得到證實(shí)[12]。本實(shí)驗(yàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞驗(yàn)證了伯格替尼對(duì)EGFR磷酸化的抑制作用，伯格替尼呈劑量依賴性的抑制EGFR磷酸化。使用伯格替尼處理細(xì)胞后，結(jié)直腸癌細(xì)胞非同源末端重組修復(fù)途徑被顯著抑制。

細(xì)胞凋亡是輻射誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的主要方式[13]，cleaved caspase-9通過(guò)激活下游效應(yīng)蛋白caspase-3和caspase-7產(chǎn)生cleaved caspase-3, cleaved caspase-7進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。本研究顯示伯格替尼聯(lián)合輻射處理從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡通路，最終誘導(dǎo)線粒體依賴的內(nèi)在凋亡，線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, and cleaved caspase-9表達(dá)顯著升高，從而增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射增敏作用。

綜上所述，伯格替尼通過(guò)抑制EGFR的磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞的非同源末端鏈接修復(fù)被抑制，加劇輻射引起的DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。本實(shí)驗(yàn)首次將伯格替尼與癌癥放射治療相結(jié)合，這些數(shù)據(jù)可能為臨床上結(jié)直腸癌治療提供支持。