KSHV信號膜蛋白K15的致病機制

王心琛，桂思語，華 瑋,董凱旋 綜述 王林定 審校

卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma, KS)是一種罕見的內(nèi)皮細胞系腫瘤，也是世界上最常見的艾滋病相關(guān)惡性腫瘤之一[1]。KS是由卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)，又名人類皰疹病毒-8(human herpesvirus-8，HHV-8)引起的[2]。HHV-8首次于KS組織中通過代表性差異分析法發(fā)現(xiàn)，也是艾滋病感染的判定依據(jù)之一[3-4]。非洲和中東是KSHV流行率較高的地區(qū)，而美國和北歐的流行率相對較低，但傳播途徑尚未確定[5]。KSHV基因組中的K15基因編碼K15蛋白，該蛋白可顯著誘導血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和促炎性細胞因子以及環(huán)氧酶(cyclooxygenase,COX)-2、白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8等趨化因子的表達[6]。目前KS的臨床治療仍面臨巨大的挑戰(zhàn)，而信號膜蛋白K15可能成為未來研究的重點。該文就K15蛋白的作用機制和研究進展做一綜述。

1 概述

1.1 KS異常的血管生成、炎癥反應和細胞遷移是KS的重要病理特征。KS病變早期(斑塊期)會出現(xiàn)血管壁裂縫，引起紅細胞外滲進入周圍組織產(chǎn)生水腫，伴隨含鐵血黃素沉積形成紫紅色外觀，同時含有中性粒細胞和B細胞的炎性浸潤。疾病發(fā)展至后期(結(jié)節(jié)期)，內(nèi)皮細胞變異成梭形獲得侵襲性并在血管縫處聚集[6-7]。

1.2 KSHV目前研究[8]表明，不僅KS由KSHV感染引起，體腔性淋巴瘤(body cavity-based lymphoma,BCBL)、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)和多中心性牧牛人病(multicentric castleman′s disease,MCD)也與其有關(guān)。KSHV存在于已有KS病變的內(nèi)皮細胞、PEL細胞、MCD的濾泡周圍B細胞中，并常以潛伏期形式存在，病毒基因表達受限。KSHV擁有兩種生命周期模式，即潛伏期和裂解性復制，其中KSHV裂解性復制有利于KS的發(fā)展。在KS和其他相關(guān)惡性腫瘤內(nèi)皮細胞中，KSHV基因表達的病毒蛋白是強有力的信號分子，對于腫瘤的血管生成和炎癥反應有重要意義[9]。

1.3K15基因與蛋白K15基因位于病毒基因組的末端，其初始轉(zhuǎn)錄物由8個交替拼接的外顯子組成，表達KSHV基因組長獨特編碼區(qū)最右端的一個假定跨膜蛋白，即K15蛋白[10]。

K15蛋白是一個包含最多12個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個羧基末端的信號受體，有若干高度保守的信號模體，包括2個SH2結(jié)合位點、1個富含脯氨酸的SH3結(jié)合位點和1個TRAF結(jié)合位點[2]。既往的研究[4，11-12]表明，K15蛋白通過其羧基末端結(jié)構(gòu)域和其他胞內(nèi)蛋白相互作用，激活轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)和活化T細胞核因子(NFAT)，從而進一步激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路。

2 K15蛋白作用機制

2.1 誘導血管新生KS早期病變的特征之一是有顯著的血管生成。HHV-8初始感染和潛伏感染內(nèi)皮細胞過程中，K15蛋白會靶向激活VEGF信號通路，靶點有唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)域(down syndrome critical region，DSCR)-1和COX-2，從而招募多種炎癥和血管生成因子[6, 13]。基質(zhì)凝膠毛細管形成試驗[14]提示KSHV編碼的K15蛋白通過招募PLCγ1以及酪氨酸磷酸化，連續(xù)激活VEGF信號通路下游，觸發(fā)NFAT通路和上調(diào)DSCR-1的下游分子，增強KSHV感染的原代內(nèi)皮細胞的血管生成特性。

另外一方面，K15介導的信號通路調(diào)節(jié)分泌細胞因子和炎性趨化因子，如IL-6、CCL2、CXCL3和CXCL8，這些細胞因子都已被證實與KS發(fā)病機制有關(guān)，具有促進血管生成活性[13]。

2.2 慢性炎癥微環(huán)境與晚期觸發(fā)炎癥反應的經(jīng)典癌癥不同，巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和漿細胞的炎性浸潤在KS早期(斑塊期)已經(jīng)非常豐富。細胞經(jīng)HIV感染后生成的的炎性細胞因子(如干擾素(interferon,IFN)-γ)已被證實能夠體外誘導KSHV溶解再活化和內(nèi)皮細胞活化，因此艾滋病患者的慢性炎癥微環(huán)境可能有利于KS的發(fā)展[6]。

2.2.1NF-κB信號通路的激活 NF-κB是一種多效性功能誘導型轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)細胞因子、生長因子和效應酶的表達參與細胞增殖分化、免疫反應、炎癥以及腫瘤轉(zhuǎn)化等生物過程。哺乳動物的NF-κB家族由5個成員組成，p50和p52(Ⅰ類)、p65/RelA、c-Rel和RelB (Ⅱ類)。p50和p52分別由p105和p100經(jīng)蛋白酶水解加工后產(chǎn)生。而大多數(shù)細胞中的NF-κB因子通常是p50/p65異源二聚體[15]。靜息態(tài)細胞中核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)能夠阻止NF-κB進入胞核，而NF-κB激活后可誘導IκB蛋白的磷酸化，并通過泛素-蛋白酶體途徑將其快速降解。經(jīng)典途徑通常誘導p50-p65二聚體從IκB介導的儲存庫中釋放，替代途徑則促進p52-RelB二聚體在細胞核中的積累[16]。NF-κB誘導激酶(NF-κB inducing kinase，NIK)可調(diào)節(jié)p100的磷酸化和水解，使其形成p52后再轉(zhuǎn)位入胞核。因此，NIK的含量是激活該通路的關(guān)鍵步驟[17]，正常情況下，NF-κB誘導NIK保持較低水平。以前的研究[11]表明K15蛋白可能是一個受泛素化調(diào)控且具有持續(xù)活性的NF-κB活化因子，其與負性NIK的共表達會導致NF-κB反應啟動子的激活減少，可能有助于調(diào)節(jié)KSHV感染細胞中NF-κB介導的細胞炎癥基因的表達。NF-κB途徑也已被證明在其他病毒誘導慢性炎癥的過程中存在，例如HHV-4潛伏膜蛋白(latent membrane protent,LMP)1以NIK依賴的方式激活NF-κB通路。

2.2.2誘導炎癥基因表達 K15蛋白在KSHV潛伏感染的B細胞中能夠激活炎癥基因的表達，如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-3和COX-2。其中COX-2是KSHV感染原代內(nèi)皮細胞時誘導的強有力的炎癥介質(zhì)之一。K15通過上調(diào)COX-2的表達可促進炎性細胞因子、趨化因子和生長因子的分泌，介導炎性細胞的招募[6, 10, 18]。

2.3 延長感染細胞壽命

2.3.1下調(diào)B細胞受體信號 KSHV與EB病毒同屬γ皰疹病毒亞科，二者DNA序列有高度同源性[19]。與其他皰疹病毒一樣，KSHV主要在B細胞中建立潛伏感染[13]。有研究[12]顯示CD8分子與K15胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的結(jié)合體在Y481EEV模體的Y481位點產(chǎn)生磷酸化，從而下調(diào)B細胞受體(BCR)信號轉(zhuǎn)導，抑制胞內(nèi)鈣動員和受感染B細胞凋亡，延長病毒潛伏期。也有學者發(fā)現(xiàn)EB病毒基因組編碼的蛋白LMP2A能夠維持記憶B細胞的潛伏期，BCR的下游效應子(如Lyn)能夠通過SH2結(jié)構(gòu)域識別磷酸化的LMP2A YEEA模體[20]。而LMP2A可以調(diào)節(jié)Lyn活性，因此LMP2A是將抗原受體活化信號轉(zhuǎn)化為鈣動員和激活MAPK途徑的關(guān)鍵因素[21]。此外，有研究[4]顯示在重組皰疹病毒的轉(zhuǎn)基因小鼠中，K15胞質(zhì)區(qū)抑制BCR近端酪氨酸磷酸化，進而阻斷Ca2+內(nèi)流。K15蛋白的拓撲結(jié)構(gòu)與LMP2A類似，因此可能激活某些相同的信號通路[10]。

2.3.2抗細胞凋亡 HS1相關(guān)蛋白X-1(HS1-associated protein X-1,HAX-1)是一種新型的細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白，具有與凋亡調(diào)控基因B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma，Bcl)-2編碼蛋白同源的結(jié)構(gòu)域，二者可以在體內(nèi)形成同源二聚體，二者可以在體內(nèi)形成同源二聚體，阻斷促凋亡蛋白Bax誘導的細胞凋亡，還擁有調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架運動的功能[14-15]。K15蛋白不僅與HAX-1相互作用，還可以誘導多種抗凋亡基因的表達，如A20、Bcl-2A1，大大提高了細胞增殖，轉(zhuǎn)移及生存能力，有助于延長KSHV感染細胞的存活時間[13]。

Bcl-2同源基因BHRF1和BALF1均于EB病毒感染潛伏期內(nèi)高表達，且表達產(chǎn)物與LMP2A協(xié)同發(fā)揮抗凋亡作用[4]。因此猜測K15蛋白可能也通過與類似抗凋亡蛋白的相互作用，對抗不同的促凋亡信號抑制細胞凋亡。

2.3.3維持病毒潛伏期 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與維持病毒潛伏期，也有抑制病毒裂解的作用。K15蛋白最有可能通過其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的SH2結(jié)合位點YEEV模體中的Y481以及NIK和IκB激酶復合體的膜近端氨基酸磷酸化，激活IκB激酶復合物，從而活化NF-κB。因此SH2結(jié)合模體YEEV在延長病毒潛伏期中占據(jù)重要地位[18]。

K15基因?qū)儆诘湫偷脑缙诹呀饣?，主要在病毒裂解周期中表達。但在潛伏期的KSHV陽性PEL細胞中也發(fā)現(xiàn)了該基因，誘導病毒進入裂解周期后其表達增加。因此可以猜測K15基因可能根據(jù)病毒處于潛伏期或裂解期適當調(diào)節(jié)表達量，通過轉(zhuǎn)導促生存信號提高細胞活性[13]。

2.4 促進細胞遷移和侵襲腫瘤細胞的異常遷移會導致病灶轉(zhuǎn)移，這是大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因[10]。在晚期KS病變中，KSHV感染的內(nèi)皮細胞失去正常形態(tài)變成紡錘形并獲得侵襲特性[14]。與其他皰疹病毒一樣，大多數(shù)KSHV感染的細胞處于潛伏期，只有少部分潛伏感染的細胞自發(fā)性溶解再激活，將病毒傳播至易感細胞，如B細胞和T細胞[21]。此外，裂解感染的細胞合成的細胞因子一般以旁分泌方式促進病理性血管生成和潛伏感染細胞的侵襲[14]。K15蛋白會上調(diào)與細胞遷移有關(guān)的基因表達，誘導幾種已知參與細胞運動的蛋白質(zhì)的生成[4]。實驗研究[10]證明K15可以通過激活MMP-1、MMP-2、MMP-9和AP-1提高原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞的侵襲性。

2.4.1K15蛋白與PLC γ1的相互作用 K15蛋白通過招募和激活細胞蛋白PLCγ1及其下游效應分子βPIX、GIT1和cdc42，顯著提高病毒潛伏期內(nèi)皮細胞的侵襲性。研究[14]已經(jīng)證明GIT1與βPIX能夠形成穩(wěn)定的復合體并充當PLCγ1誘導的蛋白復合體，即PLCγ1-GIT1-βPIX-cdc42復合體的支架。PLCγ2 cSH2結(jié)構(gòu)域作為顯性抑制物，能夠以劑量依賴的方式抑制K15蛋白對于PLCγ1的招募和激活。K15蛋白與PLCγ1相互作用是受感染內(nèi)皮細胞獲得侵襲性所必需的條件，發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用的PLCγ2 cSH2結(jié)構(gòu)域可能作為一個重要的治療靶點。

2.4.2K15P與K15M的重要作用K15基因可分為P、M和N三種基因型，其中K15P與K15M有33%的氨基酸同源性，在功能上基本等效[10]。已有研究[4]表明，K15P通過誘導鈣庫操作性鈣離子通道(store-operated calcium entry，SOCE)的重要膜蛋白Orail1的形成參與Ca2+信號轉(zhuǎn)導，并促進細胞遷移。研究[10]表明K15M在KSHV陽性的PEL細胞中潛伏表達，通過其SH2結(jié)構(gòu)域定位于細胞溶酶體膜，誘導細胞遷移和侵襲，同時提高NF-κB的活性。K15M可能通過負調(diào)節(jié)miR-21和miR-31的胞內(nèi)含量參與KSHV介導的腫瘤轉(zhuǎn)移。K15M是否通過調(diào)節(jié)溶酶體膜的通透性從而影響組織蛋白酶的釋放還未得到實驗驗證，但這仍可能是一種治療KSHV相關(guān)癌癥的新方法。

3 展望

K15可激活細胞的Ras/MAPK和NF-κB通路，并弱激活JNK/SAPK通路，上調(diào)細胞因子和趨化因子的表達，引起免疫和炎癥效應。K15蛋白招募并激活PLCγ1，提高原代內(nèi)皮細胞的血管生成活性，同時以PLCγ1-GIT1-βPIX-cdc42復合物的方式促進KSHV感染的內(nèi)皮細胞遷移和侵襲，因此可以成為治療KS的有效靶點。K15蛋白與抗凋亡蛋白HAX-1之間的相互作用可以有效延長細胞壽命，也可成為治療KS的突破點。大部分情況下K15蛋白通過羧基末端結(jié)合的模體與特定的宿主蛋白相互作用，促進病毒感染和擴散。對其致病機制的深入研究依據(jù)，可能為開發(fā)新型抗病毒和抗感染藥物提供依據(jù)。