滑膜肉瘤中P300與EMT相關蛋白的表達及臨床意義

陳 浩，張 貞，王 寧，董雙雙，連小娟，梁偉華，蔣金芳，龐麗娟，齊 妍

滑膜肉瘤(synovial sarcoma, SS)是一種較少見的具有雙相分化、高侵襲性的軟組織腫瘤，約占軟組織肉瘤的10%；特征是存在特異性t (X;18)(p11;q11)易位產(chǎn)生SYT(18q11.2)-SSX(Xp11.2)融合基因，是SS主要致瘤因素且在臨床病理診斷中發(fā)揮重要作用。SS的組織形態(tài)學主要有BSS和MFSS兩種類型，前者在梭形細胞背景下表現(xiàn)為腺體或巣團上皮樣細胞，后者以梭形細胞為主[1]。課題組前期研究[2-3]表明，上皮間葉轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相關因子在SS的上皮和間葉成分中表達水平存在的差異，提示SS與EMT密切相關；通過外顯子芯片方法在SS中的上皮和間葉成分篩選出差異基因23個，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)通路下游基因P300。該文通過檢測SS不同組織成分中P300及EMT相關蛋白的表達，探討P300在滑膜肉瘤EMT中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例材料收集自1968-2015年石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科和新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科SS石蠟包埋組織40例，根據(jù)WHO軟組織最新分類標準(第五版)和Enzinger&Weiss軟組織腫瘤進行分型和分類，病理組織學分級參照法國癌癥中心聯(lián)盟軟組織肉瘤分級系統(tǒng)；TNM分期參照國際抗癌協(xié)會與美國癌癥聯(lián)合委員會制定的TNM分期系統(tǒng)。所有病例均進行免疫組化及一步法RT-PCR技術檢測SYT-SSX融合基因檢測進行最終確診，其中包括雙相型30例，單相纖維型10例。所有樣本由資深病理醫(yī)師復診。40例SS患者中隨訪例數(shù)為25例，因聯(lián)系方式或住址更換等原因?qū)е?5例失訪，隨訪率為62.5%。

1.2 融合基因檢測提取樣本組織中的RNA(石蠟TRIzol法，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司)，用一步法RT-PCR(試劑盒來自QIAGEN公司)擴增融合基因SYT-SSXl和SYT-SSX2(引物由Sangon合成，引物序列及退火溫度見表1)，經(jīng)1.5%瓊脂糖(BBI)凝膠電泳分析結果。

表1 PCR所用引物序列、引物對、退火溫度及擴增片段大小

1.3 免疫組織化學及結果判讀實驗采用Envision二步法試劑盒(北京中杉公司)，設立空白、陽性及陰性對照。檢測P300(1 ∶500，英國Abcam公司)及31例SS中E-cadherin(1 ∶200， 丹麥DAKO公司)，N-cadherin、β-catenin(1 ∶400)、Snail(1 ∶800)、Slug(1 ∶200)(英國Abcam公司)蛋白表達情況。判定染色結果采用統(tǒng)一評分標準，由兩位高年資病理醫(yī)師獨立雙盲閱片，結果取平均值。根據(jù)陽性細胞百分比和著色強度評分，結合陽性細胞及著色強度相乘分級，積分0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，9～12分為強陽性()。

1.4 統(tǒng)計學處理應用SPSS 26.0分析軟件，采用卡方檢驗或Fisher確切概率法對實驗所得P300、SYT-SSX表達情況數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，分析P300與滑膜肉瘤臨床與病理資料之間的關系以及P300與E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug的相關性。運用 Cox 回歸模型對 SS 患者總生存時間進行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 P300表達與SS臨床病理信息的相關性在40例SS中P300表達率為95%(38/40)。結果表明P300的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、發(fā)生部位、融合基因分型、組織學分級、TNM分期以及有無遠處轉(zhuǎn)移均無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 P300與滑膜肉瘤臨床病理參數(shù)的關系

對所有患者進行隨訪，僅獲得25例患者隨訪資料，隨訪時間約為3～69個月，中位隨訪時間為26個月，其中10例存活，15例死亡。通過 Cox 回歸模型探討SS患者臨床病理參數(shù)對患者總生存時間的影響顯示，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移(P=0.019)和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(P=0.003)是患者總生存時間的獨立危險因素(表3)，而患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、融合基因分型以及組織學分級與患者生存時間沒有明顯相關性。

表3 SS患者生存時間多因素Cox回歸分析

2.2 SYT-SSX融合基因與組織學分型的相關性40例SS患者中SYT-SSX融合基因陽性率為92.5%(37/40)，其中BSS和MFSS分別為90%(27/30)、100%(10/10)。用一步法RT-PCR分別檢測SYT-SSXl型和SYT-SSX2型，擴增產(chǎn)物為118 bp (圖1)。30例BSS中，SYT-SSX1型的陽性率為66.7%(18/27)，SYT-SSX2型為33.3%(9/27)；10例MFSS中，SYT-SSX1型為80%(8/10)，SYT-SSX2型為20%(2/10)。融合基因類型與SS組織學類型間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.688)，可能與樣本數(shù)量較少有關。

圖1 滑膜肉瘤SYT-SSX融合基因RT-PCR擴增產(chǎn)物(118bp)電泳圖

2.3 P300在BSS及MFSS中的表達P300在腫瘤細胞呈胞核著色。BSS中P300表達率為93.3%(28/30)，強陽性率為33.3%(10/30)，在上皮樣區(qū)表達明顯高于梭形細胞區(qū)(圖2A)。MFSS中P300表達率為100%(10/10)，強陽性率為60.0%(6/10)(圖2B)。P300在MFSS中的表達陽性強度高于BSS，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 P300在滑膜肉瘤不同組織學亞型中的表達

2.4 P300與EMT相關蛋白在SS中表達的相關性

2.4.1P300與EMT相關蛋白在SS不同組織學類型中的表達 分析P300陽性表達與EMT相關分子表達的相關性(圖3、表4)。在BSS中，P300的表達與EMT相關分子E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug的表達差異無統(tǒng)計學意義，與β-catenin的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)，P300高表達的病例中，77.8%(7/9)β-catenin不表達，反之，P300低表達的病例中，76.9%(10/13)β-catenin陽性表達。

表4 SS中P300與EMT相關蛋白表達的關系[n(%)]

在MFSS中，P300的表達與E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和Snail的表達差異無統(tǒng)計學意義，而與Slug的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.048)，P300高表達的病例中，80%(4/5)Slug不表達，P300低表達的病例中，100%(4/4)Slug呈陽性表達。以上結果提示P300可能在SS的EMT過程中發(fā)揮一定作用。

圖3 EMT相關蛋白在BSS和MFSS中的表達 EnVision ×200

2.4.2P300與EMT相關蛋白在BSS不同細胞成分中的表達 分析BSS的上皮樣細胞成分和梭形細胞成分中P300與EMT的關系(表5)。在BSS上皮樣細胞成分中，P300的高表達率為63.3%，其中E-cadherin、N-cadherin和β-catenin高表達，Snail和Slug低表達；而P300低表達的病例中E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Slug和Snail均高表達，差異無統(tǒng)計學意義。在梭形細胞成分中，P300的高表達率為26.7%(8/30)。無論在P300高表達還是低表達的病例中，P300與EMT相關蛋白的表達差異均無統(tǒng)計學意義。

3 討論

幾乎所有的SS都具有特征性融合基因SYT-SSX，其不僅可以作為臨床病理診斷有效的檢測指標，而且在致瘤過程中具有重要作用[4]。SS的發(fā)生發(fā)展可能與EMT相關，且融合基因有一定的調(diào)控作用。Ladanyi et al[5]對243例SS病例分析發(fā)現(xiàn)，98%的患者表達SYT-SSX基因，其中61%為SYT-SSX1，37%為SYT-SSX2；BSS中SYT-SSX1的表達高于SYT-SSX2，MFSS中SYT-SSX1的表達低于SYT-SSX2，認為SYT-SSX1基因可能更容易促進腫瘤細胞上皮分化。Wei et al[6]對37例SS研究發(fā)現(xiàn)，SYT-SSX的表達率為89.2%，BSS均為SYT-SSX1型，MFSS均為SYT-SSX2型；表明SYT-SSX與SS的組織學分型可能有關。本研究中66.7%的BSS存在SYT-SSX1，33.3%為SYT-SSX2 ，1型明顯高于2型，與文獻報道相符合；但在MFSS中80.0%為SYT-SSX1，20.0%為SYT-SSX2，和文獻報道略有差異，可能與樣本量少有關。

表5 BSS不同細胞成分中P300與EMT相關蛋白的相關性[n(%)]

SYT-SSX可通過干擾Snail、Slug對E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制作用，進而影響EMT過程[1]。EMT與間葉性腫瘤和肉瘤的生物學和臨床過程相關，該過程中上皮細胞溶解細胞間連接，獲得具有增強遷移能力的間充質(zhì)特性，促進了腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。EMT過程受轉(zhuǎn)錄因子、信號通路和miRNA等很多因素的影響，相關的信號通路有TGF-β、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、Src、Ras-MAPK等。TGF-β作為EMT發(fā)展中的一個重要的通路，在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要的促癌作用[7-8]。課題組前期通過分析BSS上皮和間葉兩種細胞成分基因組SNP的改變，顯示兩種成分之間存在23個顯著差異基因(包括P300)，而P300是TGF-β通路中的一個下游基因[3, 9]。P300在TGF-β信號通路中起到關鍵作用，它作為Smad3的轉(zhuǎn)錄輔活化因子，通過與Smad3的相互作用或介導組蛋白乙?；龠M了TGF-β通路的激活[10]。

P300是轉(zhuǎn)錄共激活因子組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移家族中的一員,參與多種細胞過程如增殖，分化，凋亡，細胞周期調(diào)控和DNA損傷應答的調(diào)節(jié)[11]。de Bruijn et al[12]研究發(fā)現(xiàn)，SS相關蛋白SS18(也稱SYT或SSXT)作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，其活性可能是由P300等因子介導的。Krubasik et al[13]研究發(fā)現(xiàn)，在結腸癌中P300的缺乏導致癌細胞的黏附性降低和遷徙能力增加，暗示P300的缺乏可能促進EMT過程。在乳腺癌中的研究中[14]，P300的高表達與病理組織分型、臨床分期和復發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關，縮短了患者的生存期及無疾病進展生存期，提示P300的表達是預測和評估乳腺癌預后的重要獨立因素。P300在肉瘤方面的研究甚少，主要涉及P300作為肉瘤癌蛋白的轉(zhuǎn)錄輔活化因子[12]，但關于滑膜肉瘤臨床預后及EMT方面的研究甚少。本研究表明，BSS中P300的表達與E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug的表達均無關，但其表達強度與β-catenin密切相關；而在MFSS中P300的表達強度與Slug密切相關。在腫瘤中，Smad依賴性TGF-β通路能夠誘導Snail、Slug等因子的表達，Wnt/β-catenin通路會使細胞質(zhì)和細胞核中的β-catenin過度表達，從而導致EMT的發(fā)生以及腫瘤的轉(zhuǎn)移[8]，以上提示P300可能參與SS的上皮樣細胞分化以及EMT過程，具體機制尚待進一步深入研究。

綜上所述，P300作為TGF-β信號通路的下游基因可能參與SS上皮分化及EMT過程，在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，從而影響SS的侵襲轉(zhuǎn)移。