抗煙草花葉病毒（TMV）生防菌的鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

趙譽強，朱三榮，劉天波，，滕 凱，蔡海林，周向平，曾維愛，楊紅武，戴良英，周志成，周 鵬，唐前君*

1.湖南農業(yè)大學植物保護學院，長沙市芙蓉區(qū)農大路1號 410128

2.中國煙草總公司湖南省公司，長沙市天心區(qū)芙蓉南路一段628號 410004

煙草普通花葉病毒病是一種在世界范圍內廣泛傳播的植物病害，由煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）通過微傷口侵入宿主引起感染［1］。該病毒傳播速度快，寄主廣，遺傳變異性高，復合侵染，傳統(tǒng)的化學方法難以控制煙草普通花葉病毒病的侵染［2］。生防微生物的應用成為植物病蟲害防治的重要手段，利用拮抗細菌防治煙草病害已有相關報道。李軍營等［3］用平板對峙法從云南昆明青枯病發(fā)病煙田中篩選出1株對青枯病有拮抗作用的菌株Y4；王雯麗等［4］從煙草產區(qū)的健康煙苗中分離篩選出2株對赤星病有良好抗性的菌株，并對種子萌發(fā)有顯著的促生效應；付博等［5］從煙草根結線蟲卵囊中分離鑒定出1株貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），其發(fā)酵濾液對二齡幼蟲的校正死亡率達到91.7%。在煙草病毒病防治上，芽胞桿菌屬（Bacillus）拮抗菌可有效降低TMV的傳播和發(fā)病程度［6］；申莉莉等［7-8］從煙田土壤中分離出的兩株TMV拮抗細菌By33和By88，發(fā)酵產物對TMV有預防和鈍化作用，活性物質可抑制病毒在煙株體內復制且誘導植物產生抗性；Park等［9］從綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）O6中提取的抗病毒肽對TMV病毒的抑制率超過95%；余惠榮等［10］和厲彥芳等［11］從土壤中篩選鑒定的側孢短芽胞桿菌（Brevibacillus laterosporus）對TMV的抑制率為87.52%。郭叢等［12］從病毒病土壤中分離鑒定出1株對TMV有顯著拮抗作用的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）A3，發(fā)酵上清液對病毒的抑制率為95%，該菌劑還能降低煙葉內煙堿含量。生防菌劑的田間應用和工業(yè)化生產還需對發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行篩選和優(yōu)化，許大鳳等［13］、陳越等［14］通過單因素和響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，優(yōu)化后的拮抗效果和抗菌活性物質產量均顯著提高。此外，生防菌的田間應用效果并不穩(wěn)定，防治對象單一，不同產區(qū)種煙制度和生態(tài)環(huán)境的差異都會影響生防菌劑的定殖，并產生耐藥性，同時菌種多次轉接傳代，優(yōu)良遺傳性狀可能發(fā)生變異退化現(xiàn)象。因此，在不同的生態(tài)環(huán)境中挖掘和發(fā)現(xiàn)新的土著有益微生物防治煙草普通花葉病毒病十分重要。近年來貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）作為芽胞桿菌屬的一個新種而被廣泛關注，該菌在抑制病原物和生物防治上具有顯著優(yōu)勢，但國內利用貝萊斯芽胞桿菌在植物病毒病防治中的應用報道較少。為此，從感染TMV病株的根際土壤中篩選出對TMV有顯著拮抗作用的菌株Z5，并開展形態(tài)學觀察、生理生化試驗和分子生物學鑒定，篩選最適發(fā)酵培養(yǎng)基，確定最佳發(fā)酵條件，旨在為煙草普通花葉病的有效防治和生防菌的田間應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品：湖南農業(yè)大學耘園煙草試驗基地普通煙草花葉病毒病發(fā)病K326品種的煙株根際土壤；供試植物：三生煙（Nicotiana tabacumvar.samsun nn），種植于湖南農業(yè)大學植物病理學防蟲溫室；供試毒源：采自長沙市寧鄉(xiāng)煙田，經過4次單斑分離，分子檢測為純TMV，保存在湖南農業(yè)大學東沙植保基地；磷酸緩沖液（0.02 mol/L）：NaH2PO4·12H2O 4.37 g，Na2HPO4·2H2O 1.22 g，pH 7，溶 于1 000 mL ddH2O，121℃滅菌20 min。

試劑：配置培養(yǎng)基、生理生化試驗所需藥品均為滬試國藥集團產品（分析純），16S rDNA片段擴增試劑購自北京全式金生物公司，DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司，鹽酸嗎啉胍（20%可濕性粉劑，上?；酃饣瘜W公司）；儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082A，上海精宏實驗設備有限公司）；熒光顯微鏡（Nikon-80i，日本尼康公司）；小型高速離心機（Centrifuge 5424，德國Effendorf公司）；PCR擴增儀（T00TMThermal Cycle，美國BIO-RAD公司）。

1.2 拮抗菌株的篩選與鑒定

1.2.1 拮抗菌株的篩選

稀釋分離法分離細菌，將5 g根際土壤樣品放入盛有45 mL無菌水的錐形瓶中，振蕩器振蕩1 h，在28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置12 h或過夜培養(yǎng)。抽濾棄去沉淀后，獲得1×10-1菌懸液。無菌水梯度稀釋得到1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6和1×10-7不同濃度的菌懸液，各吸取200μL涂布于NA培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1 d，間隔12 h觀察菌落生長情況，挑取特征不同的單菌落畫線純化2～3次，-80℃保存?zhèn)溆茫?5］。

1.2.2 拮抗菌株的活性鑒定

初篩選菌種用局部枯斑法復篩獲得具有生防潛力菌種，即取單菌落接種到25 mL NB培養(yǎng)基中，放置在30℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)52 h，所得發(fā)酵液于10 500 r/min離心15 min除去菌體，上清液經細菌過濾器（0.45μm）過濾得無菌培養(yǎng)液［12］。

稱取適量感病葉片，加少許綠色碳化硅研磨至勻漿，按1∶100（質量體積比）加入磷酸緩沖液配制成100倍TMV接種液，分別與NB培養(yǎng)基和無菌培養(yǎng)液等體積混合。選擇葉片大小、長勢一致的健康5～6葉期三生煙煙苗進行摩擦接種，右半葉接種NB培養(yǎng)基與病毒液的混合液為對照，左半葉接種無菌培養(yǎng)液與病毒液混合液為處理，接種5 min后用清水噴灑葉面。每株接種2～4個葉片，重復3次，早晚各噴清水1次。3 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)，并計算抑制率［16］（局部枯斑法）。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)特征觀察

用交叉劃線法將拮抗菌株接種到LB培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)24~48 h，觀察單菌落在培養(yǎng)基上的大小、顏色等特征；分別進行芽胞、莢膜、鞭毛染色，干燥后顯微鏡觀察形態(tài)。

1.2.3.2 生理生化試驗

依據細菌鑒定手冊［17］進行生理生化試驗，每組試驗設置空白對照，重復兩次。

1.2.3.3 菌株16S rDNA序列測序

用TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒（天根生化科技公司）提取細菌基因組DNA。依據呂翠等［18］的方法使用PCR進行菌落鑒定，擴增產物由上海生物工程技術公司測序。測序結果上傳NCBI數(shù)據庫進行Blast比對，下載同源性較高的屬內菌株基因序列。利用Mega 7.0軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3.4 全基因組測序

利用Illumina Miseq測序平臺對Z5基因組DNA進行測序，使用soapdefve包進行組裝，利用Glimmer軟件對編碼序列（CDSs）進行預測。利用在線平臺tRNAscan-SE和RNAmmer分別對tRNA和rRNA進行鑒定。使用在線平臺antiSMASH 2.0對次生代謝產物進行預測。

1.3 田間試驗

在歷年煙草普通花葉病毒病發(fā)病嚴重的煙田（湖南省長沙市寧鄉(xiāng)煙草站）中進行拮抗菌株防治效果的小區(qū)試驗。煙苗于3月中旬移栽，行株距為1.2 m×0.5 m。設置3個處理，分別為空白（清水對照），處理（Z5培養(yǎng)液，菌液濃度為6.1×106cfu/mL，直接噴霧），藥劑對照（鹽酸嗎啉胍，800倍稀釋液，3 kg/hm2），每處理4次重復，共計12個小區(qū)。各小區(qū)采取隨機區(qū)組排列方式，每小區(qū)4行，每行栽煙60株。大田期共用藥3次，第1次在移栽后10 d施藥，第2次和第3次分別在移栽后15 d和移栽后20 d施藥。施藥方法：煙株正反面均勻噴霧，最后一次施藥后30 d按照GB/T 23222—2008［19］調查煙草普通花葉病毒病發(fā)病情況，并計算各處理發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

參考文獻［12］的方法，拮抗菌株在NA培養(yǎng)基上平板劃線，28℃恒溫培養(yǎng)64 h后，挑取單菌落接種NB培養(yǎng)基，每500 mL錐形瓶中裝200 mL培養(yǎng)基，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)64 h，得到的發(fā)酵液作為種子液用于后續(xù)試驗。

基礎培養(yǎng)基：備好裝有60 mL的NB培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和金氏液體培養(yǎng)基，在超凈工作臺中接種2 mL種子液于3種培養(yǎng)基上，3次重復，放置在28℃，180 r/min恒溫搖床培養(yǎng)64 h后，發(fā)酵液用局部枯斑法進行抗病毒拮抗活性測定（方法同1.2.2節(jié)）。用平板菌落計數(shù)法來測定菌落生長情況，將培養(yǎng)的發(fā)酵液稀釋至1×10-7，取100μL菌稀釋液涂布于NA培養(yǎng)基，每處理3次重復，12 h后用菌落計數(shù)器計算菌落總數(shù)［12］。

最佳碳源、氮源：分別添加等量的麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉代替基礎培養(yǎng)基的碳源；分別添加等量的魚粉、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨和硝酸銨替換基礎培養(yǎng)基中的氮源，每處理3次重復，接種2 mL種子液后搖床培養(yǎng)64 h，篩選最佳碳源、氮源種類。

1.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

參考文獻［12］的方法，采用最適培養(yǎng)基發(fā)酵，分別對不同發(fā)酵條件進行優(yōu)化篩選。發(fā)酵時間分別設置為24、36、48、60和72 h；初始pH分別設置為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0；培養(yǎng)溫度分別設置為20、24、28、32、36和40℃；裝液量設置為250 mL的三角瓶中分別裝入25、50、75、100和125 mL培養(yǎng)基。

以上試驗每組處理接種2 mL的種子液，3次重復，確定最佳發(fā)酵條件。菌數(shù)計量方法同1.4節(jié)，菌株抗TMV活性的測定方法同1.2.2節(jié)。

1.6 數(shù)據處理

使用SPSS 17.0和Excel 2019軟件對試驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析和制圖，采用Duncan's新差復極法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選與活性鑒定

從土壤中共分離出細菌菌株64株，用局部枯斑法計算菌株抗TMV平均抑制率，篩選出5株菌株對TMV抑制率超過70%（表1），其中Z5無菌培養(yǎng)液對TMV拮抗效果最佳，抑制率達96.40%（圖1）。

表1 分離菌株對TMV的抑制率Tab.1 Inhibition rates of isolated bacterial strains against TMV

圖1 菌株Z5對TMV的拮抗活性Fig.1 Antagonistic activity of bacterial strain Z5 against TMV

2.2 拮抗菌株的鑒定分析

2.2.1 菌株形態(tài)

平板上的菌株Z5為白色不透明菌落，外表無光澤，邊緣不規(guī)則，正面凸起，初期水漬、較粘，后期褶皺，呈擴散狀。Z5內生芽胞，芽胞呈橢圓形，具莢膜和鞭毛，是兩端鈍圓的短桿狀菌體。

2.2.2 生理生化試驗鑒定

生理生化試驗結果顯示，除氧化酶試驗、硫化氫試驗、吲哚試驗結果為陰性外，其他均為陽性（表2），結合菌落及菌體形態(tài)特征，初步鑒定菌株Z5為芽胞桿菌屬（Bacillus）。

表2 菌株Z5的生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of bacterial strain Z5

2.2.3 分子生物學鑒定

菌株測序結果通過NCBI比對，以NCBI中已發(fā)表的16S rDNA基因序列為基礎，構建系統(tǒng)進化樹。拮抗菌株Z5與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）親緣關系最近（圖2），同源性達到99%以上。

圖2 菌株Z5的16S r DNA系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacterial strain Z5 based on 16Sr DNA sequence

2.2.4 全基因組測序

通過測序和組裝獲得了貝萊斯芽胞桿菌Z5的基因組數(shù)據。其中包含3 913 900 bp，GC含量（質量分數(shù)）為46.5%，分布于283個contigs中。根據基因組數(shù)據，鑒定出1個5S-16S-23S操縱子、32個tRNAs和3 975個蛋白編碼序列（CDSs）。

菌株Z5的基因組中含有多種合成抗菌代謝產物和抗生素（次生代謝產物）的基因簇，包括具有生物控制功能的脂肽（LP）和聚酮（polyketides）。通過antiSMASH 2.0預測，在菌株Z5中發(fā)現(xiàn)非核糖體肽合成酶（NRPSs），編碼4'-磷酸腺苷基轉移酶（phospho-pantheinyl transferase，Sfp）。Z5還包括表面活性素（surfactin）、豐原素（fengycin）、桿狀肌動蛋白（bacillibactin）和桿菌霉素D（bacillomycin D）。

2.3 貝萊斯芽胞桿菌Z5的田間防治效果

田間小區(qū)試驗煙苗發(fā)病情況調查結果（表3）顯示，菌株Z5培養(yǎng)液處理的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)較清水對照顯著降低，Z5培養(yǎng)液對煙草普通花葉病毒病的田間防效達到50.43%，和鹽酸嗎啉胍800倍稀釋液處理的防治效果（54.80%）差異不顯著。

表3 Z5培養(yǎng)液對TMV的田間防效①Tab.3 Field control efficacy of Z5 culture solution against TMV

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

培養(yǎng)基：Z5在3種培養(yǎng)基中生長情況不同，菌數(shù)差異顯著，NB培養(yǎng)基中Z5菌數(shù)最多（5.79×1010cfu/mL），對TMV抑制率最高（98.02%）。因此，選用NB培養(yǎng)基進行后續(xù)發(fā)酵條件試驗（圖3A）。

碳源、氮源：以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中菌株Z5菌數(shù)最多（5.68×1010cfu/mL），且發(fā)酵液抗病毒效果最好（97.18%）（圖3B）。Z5在常見的氮源中生長存在明顯差異，在酵母膏中的菌數(shù)最多，且病毒的抑制率最高（98.14%）（圖3C）。因此，葡萄糖、酵母膏為最適碳源和氮源。

圖3 培養(yǎng)基（A）、碳源（B）和氮源（C）對菌株Z5的菌數(shù)及其抗病毒活性影響Fig.3 Effects of culture mediums（A）,carbon sources（B）,nitrogen sources（C）on bacterial count and antiviral activity of bacterial strain Z5

2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 發(fā)酵時間對Z5抗TMV活性的影響

隨著發(fā)酵時間的推移，菌數(shù)在穩(wěn)定增長，并在培養(yǎng)72 h后達到最大值；同時菌株的抗病毒物質逐漸積累，48 h后抗病毒效果顯著增強，60～72 h之間，逐漸穩(wěn)定，病毒抑制率達94.14%，72 h時達到最大菌數(shù)4.91×1010cfu/mL（圖4）。因此，選擇72 h為最佳發(fā)酵時間。

圖4 發(fā)酵時間對菌株Z5及其抗病毒活性的影響Fig.4 Effects of fermentation time on bacterial count and antiviral activity of bacterial strain Z5

2.5.2 初始pH對Z5抗TMV活性的影響

初始pH對菌體Z5的菌數(shù)和抗病毒效果的影響有顯著差異（圖5）。初始pH在7.0～10.0，較適合菌株生長，初始pH為10.0時菌數(shù)最多（6.35×1010cfu/mL），初始pH繼續(xù)升高到11時，菌數(shù)驟降；對病毒抑制率也呈現(xiàn)相似的趨勢，初始pH為7.0時抗病毒效果最好（97.14%）。綜合分析認為，菌株Z5最佳發(fā)酵初始pH為7。

圖5 初始p H對菌株Z5的菌數(shù)和抗病毒活性影響Fig.5 Effects of initial pH on bacterial count and antiviral activity of bacterial strain Z5

2.5.3 培養(yǎng)溫度對Z5抗TMV活性的影響

在28℃條件下發(fā)酵，Z5的產菌數(shù)達到最大（6.98×1010cfu/mL），對病毒抑制率也最高（95.04%），低于和高于28℃時，Z5的產菌數(shù)出現(xiàn)了明顯下降。36℃時Z5發(fā)酵液的抗病毒效果明顯下降，40℃時產菌數(shù)遠低于28℃，且病毒抑制率低于10%（圖6）?？梢?，Z5的最佳發(fā)酵溫度為28℃。

圖6 不同溫度對菌株Z5的菌數(shù)及其抗病毒活性的影響Fig.6 Effects of fermentation temperature on bacterial count and antiviral activity of bacterial strain Z5

2.5.4 裝液量對Z5抗TMV活性的影響

裝液量的不同對菌株的生長和病毒抑制效果有顯著影響（圖7）。當裝液量為100 mL時，菌株Z5的產菌數(shù)達到最大（8.36×1010cfu/mL），同時對病毒抑制率達到最大（98.71%）。裝液量低于或高于100 mL時，其產菌數(shù)和對病毒抑制率均有明顯下降，出現(xiàn)了供氧不足的情況。因此，Z5的最適裝液量為100 mL/250 mL。

圖7 不同裝液量對菌株Z5的菌數(shù)及其抗病毒活性的影響Fig.7 Effects of medium volumes on bacterial count and antiviral activity of bacterial strain Z5

3 討論

本試驗中從湖南省長沙市芙蓉區(qū)耘園煙草普通花葉病發(fā)病植株根際土壤中篩選出1株對TMV拮抗效果良好的細菌菌株Z5，對TMV的枯斑抑制率高達96.40%，經形態(tài)學鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。為增加菌株Z5的發(fā)酵產量和抗病毒活性物質產出，以Z5的菌數(shù)和對TMV的抑制率為主要評價指標，對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，不同的培養(yǎng)基和不同的發(fā)酵條件產生的拮抗物質含量和抑制效果存在明顯差異。Z5在以葡萄糖為碳源和以酵母膏為氮源的NB培養(yǎng)基上生長情況最好，更容易產生拮抗物質；優(yōu)化試驗結果表明菌株Z5的初始pH和發(fā)酵時間與多數(shù)芽胞桿菌屬的試驗結果一致，但培養(yǎng)溫度和裝液量有所差異［20-23］，這可能是由菌株的遺傳特性、生活環(huán)境或作用對象不同所致。貝萊斯芽胞桿菌Z5對TMV有明顯的抑制作用，與申莉莉等［7-8］分離到的B.amyloliquefaciens菌株Ba33相似，該菌通過體外鈍化、抑制侵染和誘導抗性等機制來抑制TMV的侵染?；谌蚪M測序和功能預測，推測貝萊斯芽胞桿菌Z5產生的拮抗物質如表面活性素、桿菌霉素等脂肽類和聚酮類物質可能對病毒粒體的完整性造成破壞，會損傷細胞膜、細胞壁。Z5還可能會影響煙草的SA和JA信號通路，誘導系統(tǒng)抗性。但有關活性物質成分和作用機理、是否具有促進植物生長和其他作用等還需進一步的深入研究。此外，本試驗中僅在搖床條件下對Z5培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，而相關發(fā)酵工藝以及Z5發(fā)酵液與其他生物活性成分的復配等還需要進一步驗證和完善。

4 結論

篩選鑒定出1株對TMV有明顯抑制作用的貝萊斯芽胞桿菌Z5，對TMV抑制率為96.40%，貝拉斯芽胞桿菌Z5的最適培養(yǎng)基和發(fā)酵條件是采用NB培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，葡萄糖為碳源，酵母膏為氮源，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度28℃，發(fā)酵時間60~72 h。優(yōu)化后菌數(shù)增長44.38%，對TMV抑制率穩(wěn)定，可達到98.71%。田間小區(qū)試驗對普通煙草花葉病毒病防效達到50.43%，與鹽酸嗎啉胍（可濕性粉劑）的防效基本相當。