基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的橘皮竹茹湯血清藥物化學(xué)初步研究*

王小雙，魏文峰，韓德強(qiáng)，霍金海，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，哈爾濱 150036）

橘皮竹茹湯源自張仲景的《金匱要略》，由橘皮、大棗、竹茹、人參、生姜、甘草組成。原文為：“噦逆者，橘皮竹茹湯主之。”后世醫(yī)家以“胃虛有熱，胃氣上逆”“寒熱相搏”“脾胃虛寒，胃失和降”等概括本方病因病機(jī)[1]?，F(xiàn)代研究表明，橘皮竹茹湯已廣泛應(yīng)用于醫(yī)治慢性胃炎、幽門(mén)水腫、幽門(mén)不全梗阻、消化性潰瘍、消化功能不良引起的嘔吐、反流性食管炎等疾病[2-4]。

超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)是一種具有高分辨率、高靈敏度特點(diǎn)的質(zhì)譜技術(shù)。目前大量研究報(bào)道了UPLC-Q-TOF/MS作為一種分析方法被應(yīng)用于中藥或中藥復(fù)方的入血成分研究，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好[5-6]。

中藥成分復(fù)雜，想要確定中藥入血后的有效成分并闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)現(xiàn)代化的分析手段對(duì)其給藥后血清進(jìn)行原型成分以及代謝產(chǎn)物分析是必不可少的。同時(shí)，尚未有橘皮竹茹湯入血成分研究的相關(guān)報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)旨在采用UPLC-QTOF/MS技術(shù)推斷或鑒定其入血成分。

1 材料與儀器

1.1 儀器 實(shí)驗(yàn)用儀器具體情況見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器情況

1.2 試劑與藥品 對(duì)照品甘草酸（批號(hào)G-003-160330）、刺芒柄花素（批號(hào) C-018-160304）購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；柚皮苷（批號(hào)110722-201815）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水合氯醛（批號(hào)20100827，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；自制橘皮竹茹湯凍干粉（陳皮飲片購(gòu)自湖北隨州，批號(hào)17112111；竹茹飲片購(gòu)自安徽岳西，批號(hào)1708311；大棗飲片購(gòu)自河北安國(guó)，批號(hào)1709061；人參飲片購(gòu)自吉林通化，批號(hào)180311；生姜飲片購(gòu)自浙江磐安，批號(hào)ZJP2011165；甘草飲片購(gòu)自甘肅隴西，批號(hào)17111411）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wister大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，SPF級(jí)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心供給，許可證號(hào)：SYXK（黑）2016-008。大鼠于SPF級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)，室溫20～25℃，濕度50%～70%。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備 取橘皮竹茹湯凍干粉1.0g，精密稱(chēng)定，加甲醇25 mL，超聲處理（功率300 W，頻率 40 KHz）30 min，放冷，補(bǔ)足甲醇，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，13 000 r/min離心5 min（離心半徑7 cm），取上清液，即得。

2.2 給藥藥液的制備 取橘皮竹茹湯凍干粉，加適量蒸餾水超聲溶解，制成0.108 g/mL藥液供大鼠灌胃使用。

2.3 血清樣本的制備 Wister大鼠禁食12 h（自由飲水），給藥組按照10.8 g/kg（相當(dāng)于人體臨床1 d劑量的10倍）灌胃橘皮竹茹湯凍干粉藥液，空白組按照10.0 mL/kg灌胃蒸餾水。給藥1 h后，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，取腹主動(dòng)脈血，離心（3 000 r/min，10 min，離心半徑7 cm），取上清液，-80℃保存。

取大鼠空白血清及給藥血清各400 μL，各加入10 μL 磷酸，渦旋震蕩（2 500 r/min），分別加入 1.6 mL乙腈，渦旋震蕩（2 500 r/min），離心（13 000 r/min，4℃，10 min，離心半徑 7 cm），取上清液，氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋震蕩（2 500 r/min，60 s），離心（13 000 r/min，4 ℃，10 min，離心半徑7 cm），取上清液，供UPLC-Q-TOF/MS分析。

2.4 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），ACQUITY UPLC BEH C18VanGuard Pre-Column預(yù)柱（2.1mm×5mm，1.7μm），柱溫35℃，0.1%甲酸水為流動(dòng)相A，0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相 B，梯度洗脫（0～3 min，0%～5%B；3～10 min，5%～50%B；10～18 min，50%～100%B；18～18.1 min，100%～5%B；18.1～20 min，5%B），流速 0.3 mL/min，進(jìn)樣量 5 μL。

2.5 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件設(shè)置見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件

2.6 數(shù)據(jù)分析方法 將橘皮竹茹湯給藥血清和空白血清導(dǎo)入Peakview軟件，設(shè)置相關(guān)參數(shù)（Mass Errorr≤10；權(quán)重30%，Isotope≤10%；權(quán)重30%，F(xiàn)ormula Finderscore＞70%）扣除空白血清成分干擾，將檢測(cè)到的其余離子與體外藥材提取液所檢測(cè)到化合物的保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素峰度比及二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，相同則確認(rèn)為橘皮竹茹湯凍干粉中的原型成分[7]。

運(yùn)用MetabolitePilot 2.0.4軟件，導(dǎo)入前期推斷或鑒定的橘皮竹茹湯化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式和總離子流圖，為每一個(gè)化學(xué)成分設(shè)置不同的Biotransformation parameters，選擇所有可能的Ⅰ、Ⅱ相代謝途徑，設(shè) 置 Generic ParametersPeak、Finding Strategy 和Compound-Specific Parameters，給藥血清的液質(zhì)采集數(shù)據(jù)為sample，空白血清的液質(zhì)采集數(shù)據(jù)為control進(jìn)行分析[8-9]，最后結(jié)合軟件及相關(guān)文獻(xiàn)給出代謝物的保留時(shí)間及二級(jí)碎片，推斷可能的代謝物。

3 結(jié)果

3.1 橘皮竹茹湯UPLC-Q-TOF/MS色譜圖的采集 根據(jù)建立的橘皮竹茹湯血中移行成分分析方法，采用正、負(fù)離子模式采集橘皮竹茹湯凍干粉樣品、給藥血清和空白血清數(shù)據(jù)。正離子模式總離子流圖見(jiàn)圖1，負(fù)離子模式總離子流圖見(jiàn)圖2。

圖1 正離子模式下總離子流圖

圖2 負(fù)離子模式下總離子流圖

3.2 橘皮竹茹湯血中移行成分分析與鑒定 根據(jù)“2.6”項(xiàng)的分析方法，結(jié)合對(duì)照品比對(duì)及文獻(xiàn)報(bào)道[10-15]，鑒定出大鼠灌胃橘皮竹茹湯凍干粉后的血中移行成分41個(gè)，包括原型成分13個(gè)、代謝產(chǎn)物28個(gè)。見(jiàn)表3。

表3 橘皮竹茹湯凍干粉血中移行成分分析結(jié)果

續(xù)表3

續(xù)表3

3.3 主要色譜峰的質(zhì)譜分析

3.3.1 原型成分的鑒定 本研究鑒定了原型成分13個(gè)，以化合物2和9說(shuō)明推測(cè)過(guò)程。

化合物2：負(fù)離子模式下，化合物2在含藥血清總離子流圖的柚皮苷保留時(shí)間與樣品總離子流圖一致，二級(jí)質(zhì)譜碎片一致，準(zhǔn)分子離子峰m/z 579.175 7相對(duì)豐度較強(qiáng)，擁有共同二級(jí)碎片m/z 403.143 4、271.062 1、151.002 9 等。通過(guò)查詢相關(guān)成分的文獻(xiàn)[16]，推斷化合物2為柚皮苷。二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3，其可能的裂解過(guò)程見(jiàn)圖4。

圖3 柚皮苷負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖

圖4 推測(cè)的柚皮苷裂解途徑

化合物9：正離子模式下，化合物9在含藥血清總離子流圖與樣品總離子流圖甘草酸的保留時(shí)間一致，二級(jí)質(zhì)譜碎片一致，準(zhǔn)分子離子峰m/z 823.409 4相對(duì)豐度較強(qiáng)，擁有共同二級(jí)碎片m/z 647.377 3、471.344 9、369.236 9 等。通過(guò)查詢相關(guān)成分的文獻(xiàn)[17]，推斷化合物9為甘草酸。二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5，其可能的裂解過(guò)程見(jiàn)圖6。

圖5 甘草酸正離子模式下的質(zhì)譜圖

圖6 推測(cè)的甘草酸裂解途徑

3.3.2 代謝產(chǎn)物的鑒定 本研究推測(cè)了28個(gè)代謝產(chǎn)物，以化合物20和化合物37為例說(shuō)明鑒定過(guò)程。

化合物20：刺芒柄花素是來(lái)自甘草的黃酮類(lèi)成分，易發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)。通過(guò)MetabolitePilot代謝軟件分析發(fā)現(xiàn)，化合物20為刺芒柄花素A環(huán)7位發(fā)生葡萄糖醛酸化的產(chǎn)物。該產(chǎn)物在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰m/z 443.101 7[M-H]-，比刺芒柄花

素準(zhǔn)分子離子峰m/z 267.065 9[M-H]-多176.035 8，符合1分子葡萄糖醛酸的分子量。結(jié)合其特征碎片m/z 267.065 9、252.042 9、223.042 1 等，與刺芒柄花素的二級(jí)碎片相一致，符合其葡萄糖醛酸化的過(guò)程。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[18]，芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖經(jīng)Ⅰ相代謝水解反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化為芒柄花素，易發(fā)生

葡萄糖醛酸化反應(yīng)。二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7，其可能的裂解過(guò)程見(jiàn)圖8。

圖7 刺芒柄花素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖

圖8 推測(cè)的刺芒柄花素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物裂解途徑

化合物37：柚皮黃素是陳皮中的黃酮類(lèi)成分，易發(fā)生Ⅰ相代謝反應(yīng)。通過(guò)MetabolitePilot代謝軟件分析發(fā)現(xiàn)，化合物37為柚皮黃素C環(huán)3位脫羥基產(chǎn)物。在正離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 403.136 7[M+H]+比柚皮黃素準(zhǔn)分子離子峰m/z 419.148 2[M+H]+少16，提示失去1個(gè)氧原子，發(fā)生脫羥基。結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片離子 m/z 388.110 6、373.091 8、345.089 1等，與柚皮黃素的二級(jí)質(zhì)譜碎片相比較，符合脫羥基過(guò)程。其準(zhǔn)分子離子峰m/z 401.367 3丟失甲基產(chǎn)生m/z 388.110 6碎片離子，繼續(xù)丟失C環(huán)上的1分子一氧化碳和1個(gè)氧原子產(chǎn)生m/z 345.089 1碎片離子。另一條裂解途徑為A環(huán)甲氧基丟失，同時(shí)導(dǎo)致C環(huán)C-O鍵斷裂產(chǎn)生m/z 373.091 8碎片離子，m/z 373.091 8碎片離子丟失亞甲基產(chǎn)生m/z 359.114 6碎片離子。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，該柚皮黃素脫羥基產(chǎn)物與川陳皮素的裂解規(guī)律一致，所以推測(cè)柚皮黃素脫羥基產(chǎn)物為川陳皮素。二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖9，其可能的裂解過(guò)程見(jiàn)圖10。

圖9 柚皮黃素脫羥基產(chǎn)物正離子模式下的質(zhì)譜圖

圖10 推測(cè)的柚皮黃素脫羥基產(chǎn)物裂解途徑

4 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了不同給藥劑量（1、5和10倍），結(jié)果顯示，10倍給藥劑量的響應(yīng)值最高，色譜峰最多，故10倍是最佳給藥劑量?？疾炝?種血清處理方法（乙腈沉淀法、甲醇沉淀法、固相萃取-乙腈洗脫和固相萃取-甲醇洗脫），結(jié)果顯示，乙腈沉淀法是血中移行成分最多的一種方法，故乙腈沉淀法是血清最佳處理方法?？疾炝?個(gè)不同采血時(shí)間節(jié)點(diǎn)（0、0.5、1、2、4、8、12、24 h），結(jié)果顯示，給藥 1 h 檢測(cè)到的峰數(shù)目最多，故最佳采血時(shí)間節(jié)點(diǎn)為給藥后1h。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃給予橘皮竹茹湯凍干粉的含藥血清，推斷了41個(gè)血中移行成分，其中原型成分13個(gè)、代謝產(chǎn)物28個(gè)，來(lái)自陳皮的主要是黃酮類(lèi)成分，包括橙皮苷、柚皮黃素等，能夠清除羥自由基、保護(hù)膜損傷、抑制幽門(mén)螺桿菌增殖、抗炎及增強(qiáng)幽門(mén)泵活動(dòng)促進(jìn)胃排空[20]。來(lái)自甘草的主要是黃酮類(lèi)和三萜類(lèi)成分，甘草中的甘草次酸能夠抑制幽門(mén)螺桿菌感染后的胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗炎作用[21]。來(lái)自生姜的主要是姜辣素類(lèi)成分，包括6-姜酚、6-姜烯酚等，能夠抑制胃黏膜上5-羥色胺3（5-HT3）和5-羥色胺4（5-HT4）受體發(fā)揮止吐作用[22]。結(jié)合各味藥物的傳統(tǒng)藥效及藥理作用，初步推測(cè)本實(shí)驗(yàn)得到的41個(gè)入血成分可能是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。