海蘭褐蛋雞產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定

任偉欣，王潘龍，秦一峰，欒慶東，游儀雪，徐茜，郭泉宇，喬磊，尹燕博，張曉軒

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)在世界水平上屬于發(fā)展較快較好的國(guó)家，一直以來(lái)我國(guó)的禽產(chǎn)品產(chǎn)量與家禽存欄量均領(lǐng)先于大多數(shù)國(guó)家[1]。自20世紀(jì)70年代以來(lái)我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)已有了悠久的歷史，但以前的規(guī)模很小，養(yǎng)殖水平也較低，與發(fā)達(dá)國(guó)家差距較大。改革開(kāi)放后由于養(yǎng)禽規(guī)模的改變致使我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)迅速發(fā)展，特別是蛋雞產(chǎn)業(yè)更是邁向了一個(gè)新的臺(tái)階[2]。在2009年，我國(guó)的雞蛋產(chǎn)量就已經(jīng)超過(guò)了世界總產(chǎn)量的40%，位居世界第一，蛋雞存欄量更是達(dá)到了16億只。在畜牧業(yè)中蛋雞養(yǎng)殖屬于發(fā)展較快的行業(yè)，雞蛋又是我國(guó)人民的重要食品。發(fā)展蛋雞產(chǎn)業(yè)不僅能增加養(yǎng)殖戶(hù)的收入，還能改善人們的飲食，提高人們的生活水平[3]。因此蛋雞養(yǎng)殖業(yè)對(duì)于我國(guó)非常重要，提高蛋雞的生產(chǎn)效率以及雞蛋的品質(zhì)更是我們應(yīng)該高度重視的問(wèn)題。

在蛋雞的養(yǎng)殖過(guò)程中常常會(huì)發(fā)生多種疾病，例如壞死性腸炎，也稱(chēng)腸毒血癥，是由于感染了A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌而引起的一種腸道壞死、出血的多因素急性傳染病[4]，4周齡以上的蛋雞通常易感[5]。主要臨床癥狀為采食量下降、產(chǎn)蛋量減少、背羽粗亂、翅膀下垂、抑郁煩躁、排紅褐色干燥糞便，嚴(yán)重時(shí)雞只消瘦、眼窩凹陷、站立困難、排黑色稀便，伴有惡臭味，有時(shí)還混有血液[6]。該病發(fā)病突然死亡快并容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)狀況，屬于散發(fā)性家禽細(xì)菌性疾病[7]。在世界大部分地區(qū)均有報(bào)道，嚴(yán)重危害了家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展并給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌作為壞死性腸炎的主要病原菌，又稱(chēng)產(chǎn)氣莢膜梭菌，是由美國(guó)Velchii等[9]從一具尸體中分離出的一種厭氧的革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌，屬于人畜共患的條件性致病菌。該菌以低水平廣泛存在于多種健康動(dòng)物的腸道菌群中，同時(shí)也存在于土壤、糞便和污水等自然界中[10-11]。當(dāng)環(huán)境和飼養(yǎng)條件改變，機(jī)體受到應(yīng)激時(shí)會(huì)導(dǎo)致該菌不斷增殖而引起動(dòng)物的壞死性腸炎、人類(lèi)的食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽等[12-14]。目前產(chǎn)氣莢膜梭菌被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生α、β，ε，ι，θ，κ，λ等20種毒素，而α、β、ε和ι作為其主要的致病毒素將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為了5種毒素類(lèi)型，分別為A、B、C、D、E型[15-16]。

由于產(chǎn)氣莢膜梭菌等病原菌對(duì)蛋雞的影響較大，因此16SrRNA測(cè)序技術(shù)作為當(dāng)代最熱門(mén)的快速鑒定病原菌的方法被廣泛使用[17-18]。起初，人們都是用純培養(yǎng)和傳統(tǒng)分析方法對(duì)微生物進(jìn)行研究，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)只有0.1%～1%的微生物能夠通過(guò)純培養(yǎng)的方式被發(fā)現(xiàn)，大量具有巨大應(yīng)用潛能的微生物由于不可培養(yǎng)均無(wú)法被研究。為了解決這一問(wèn)題，組學(xué)概念應(yīng)運(yùn)而生，16SrRNA測(cè)序就是其中一種。由于其打破了傳統(tǒng)微生物研究方法所存在的局限，因此組學(xué)概念一出現(xiàn)，就被廣大學(xué)者們所接受[19-20]。雖然組學(xué)的研究方法還存在一些缺陷，但這并不能阻止廣大學(xué)者們應(yīng)用其去研究環(huán)境中各類(lèi)微生物的熱情。組學(xué)的指導(dǎo)思想十分清晰，它以反向生物學(xué)為中心，圍繞特定的生態(tài)環(huán)境，利用獨(dú)有的程序和方法，對(duì)所研究的基因組序列進(jìn)行分析，對(duì)功能基因進(jìn)行注釋?zhuān)瑫r(shí)通過(guò)對(duì)16SrRNA可變區(qū)的測(cè)定可以對(duì)環(huán)境中存在的多種微生物進(jìn)行同時(shí)分類(lèi)和準(zhǔn)確定量[21-22]。而且近年來(lái)，組學(xué)的分析程序也不斷被改善，數(shù)據(jù)庫(kù)不斷被擴(kuò)充，更有研究人員在生物信息學(xué)方面研發(fā)了許多可實(shí)用的軟件，這使得16SrRNA測(cè)序技術(shù)不管是在測(cè)序深度和準(zhǔn)確度，還是在性?xún)r(jià)比等方面都要強(qiáng)于傳統(tǒng)分析方法[23]。

試驗(yàn)應(yīng)用組學(xué)技術(shù)及多重PCR等方法對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行分離鑒定，研究其生物學(xué)特性和基因分型，探討壞死性腸炎的誘發(fā)機(jī)制，可為今后蛋雞壞死性腸炎的診治和預(yù)防提供理論依據(jù)，為產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定提供素材，對(duì)蛋雞養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有促進(jìn)作用。

1 材料

1.1 病料

從山東省青島市即墨區(qū)某蛋雞場(chǎng)患病蛋雞體內(nèi)無(wú)菌采集小腸、盲腸和直腸內(nèi)容物。

1.2 主要試劑

PCR反應(yīng)試劑，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；羊血、革蘭氏染色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；含鐵牛奶培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、胰蛋白胨—亞硫酸鐵—環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（TSC）、血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BAB）、亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（SPS），購(gòu)自青島海博生物科技有限公司。

1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌分型鑒定引物

根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌主要致病毒素（α、β、ε、ι）的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)多重PCR分型鑒定引物并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。序列見(jiàn)表1。

表1 多重PCR引物序列Table 1 Primers sequence of multiple PCR

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

20只350日齡的患病海蘭褐蛋雞。

2 方法

2.1 樣品的采集

從山東省某規(guī)?；半u場(chǎng)采集20只患有壞死性腸炎的病死雞，將其帶回試驗(yàn)室，全身消毒后剖開(kāi)腹腔，分別取出患病雞小腸、盲腸和直腸這三個(gè)腸段，并在腸段兩端結(jié)扎后放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在厭氧培養(yǎng)箱中將20只雞的三個(gè)腸段內(nèi)容物分別混合均勻后再兩兩混合，形成10份樣品。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及染色鏡檢

將合成后的樣品用厭氧液體培養(yǎng)基在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行50萬(wàn)倍梯度稀釋?zhuān)謩e涂布于TSC、BAB、SPS這三種固體培養(yǎng)基上，在37℃厭氧條件下恒溫培養(yǎng)24 h，取疑似菌落用三線法在相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行二代純化培養(yǎng)，并將純化后的單個(gè)菌落接種于厭氧液體培養(yǎng)基中。待液體培養(yǎng)基渾濁后，取少量涂片鏡檢。

2.3 生化鑒定及牛乳發(fā)酵

將鏡檢疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌株從二代培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落接種于麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、明膠、甘露醇、硝酸鹽等生化鑒定管及滅菌后的含鐵牛奶液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察其反應(yīng)。

2.4 16Sr RNA測(cè)序鑒定

將鏡檢和生化鑒定后判定為產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌液進(jìn)行12 000 r·min-1，3 min離心，收集沉淀，加入dd水在渦旋振蕩器上混合均勻后用煮沸的開(kāi)水煮6 min，再進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增體系為25μLEx-Taq酶，上下游引物各1μL，模板1μL，最后加入滅菌水22μL，總體系為50μL。將跑有條帶的PCR樣品送測(cè)序。

2.5 毒素分型鑒定

將產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，觀察其條帶數(shù)及條帶大小以鑒定其毒素分型情況。多重PCR的總反應(yīng)體系為25μL，分別為Ex-Taq酶12.5μL，模板2μL，上下游引物各1μL，滅菌水8.5μL。反應(yīng)條件為：94℃欲變性5 min；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

2.6 菌種保存

準(zhǔn)備好凍存管，在管壁上做好標(biāo)記。在厭氧培養(yǎng)箱中吸出分離菌的菌液與滅菌后的甘油以3∶1的形式混合均勻后凍于-80℃保存。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及染色鏡檢結(jié)果

將蛋雞腸道內(nèi)容物涂板后發(fā)現(xiàn)其活菌數(shù)為1×108CFU·g-1。如圖1所示產(chǎn)氣莢膜梭菌在BAB瓊脂平板上為表面光滑、邊緣整齊、圓形、半透明菌落，在SPS和TSC固體培養(yǎng)基上則是以黑色為中心的灰白色圓形菌落。將其染色后1 000×鏡檢可發(fā)現(xiàn)大量革蘭陽(yáng)性，兩端鈍圓，大多單個(gè)存在的粗短桿狀細(xì)菌（圖2）。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Isolation and culture results of C.perfringens

圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的染色結(jié)果Fig.2 Coloration result of C.perfringens

3.2 生化鑒定及牛乳發(fā)酵結(jié)果

將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于生化鑒定管中，可發(fā)現(xiàn)其對(duì)麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖均有發(fā)酵作用，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵鼠李糖、纖維二糖、木糖、棉子糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇，液化明膠，不產(chǎn)生吲哚，無(wú)尿素酶，不還原硝酸鹽。將菌株接種于滅菌后的含鐵牛奶液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象（圖3）。

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化鑒定及牛乳發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Biochemical identification and milk fermentation results of C.perfringens

3.3 16Sr RNA測(cè)序鑒定結(jié)果

將分離菌株進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增及1%的瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中均顯現(xiàn)出約1 500 bp的條帶，符合16SrRNA條帶長(zhǎng)度，可以送測(cè)序。將測(cè)序回來(lái)的結(jié)果在NCBI上進(jìn)行基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)7株分離菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌的同源性高達(dá)99.86%～100%，圖4為7株菌16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果圖。為了更直觀的顯示7株菌（H1-H7）與產(chǎn)氣莢膜梭菌的親源關(guān)系，試驗(yàn)在NCBI上搜索了產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）、破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetani）、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum），以及嗜熱絲孢菌（Lutispora thermophila）的16SrRNA基因序列，將嗜熱絲孢菌作為外群利用MEGA6軟件根據(jù)最大似然法建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）。在進(jìn)化樹(shù)中可以看到試驗(yàn)的7株分離菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌的同源性最高，因此確定該試驗(yàn)中分離菌H1～H7均為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖4 16Sr RNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 16SrRNA amplification results

圖5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree

3.4 毒素分型鑒定結(jié)果

將產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)7株產(chǎn)氣莢膜梭菌均僅跑出一條約325 bp的目的條帶（圖6），符合α毒素的條帶長(zhǎng)度，因此確定試驗(yàn)分離出的7株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A型。

圖6 毒素分型結(jié)果Fig.6 Results of toxin typing

4 討論

該試驗(yàn)中患病雞群精神沉郁，食欲減退，雞只消瘦，羽毛松亂，同時(shí)伴有腹瀉，便血和脫水等癥狀。刨檢時(shí)發(fā)現(xiàn)小腸膨脹，腸壁脆弱，漿膜上有栗狀壞死斑。十二指腸、盲腸和直腸腸壁有出血點(diǎn)，粘膜潰瘍，腸道內(nèi)容物為混有血液的褐色或黑色稀糞。發(fā)病雞用土霉素、痢特靈等藥物無(wú)效果，而飼喂喹乙醇，肌注慶大霉素和青霉素后病情有所好轉(zhuǎn)。因此將該病診斷為壞死性腸炎，并由于產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)喹乙醇等藥物敏感判定該病可能是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起。

產(chǎn)氣莢膜梭菌作為雞腸道中的常駐菌群之一，在正常情況下不表現(xiàn)明顯臨床癥狀。當(dāng)雞群抵抗力下降、飼料轉(zhuǎn)換不良時(shí)會(huì)引起雞壞死性腸炎。該病一般在肉雞中多見(jiàn)，特別是2～6周齡的肉雞，很少發(fā)生于蛋雞[24]。該病的發(fā)病特征分為亞臨床和臨床兩種類(lèi)型。亞臨床型壞死性腸炎臨床癥狀明顯，病死率較低；臨床型則無(wú)任何先兆跡象，病雞突然死亡[25]。該病的形成多有明顯的誘因，包括破壞腸道上皮表面，誘導(dǎo)粘液產(chǎn)生；影響腸道菌群組成；改變家禽免疫狀態(tài)等。例如全麥飼糧會(huì)改變腸道黏度，產(chǎn)生復(fù)雜的碳水化合物，從而導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖；病毒感染可導(dǎo)致腸道表面的物理?yè)p傷，誘導(dǎo)禽類(lèi)的免疫狀態(tài)下降；飲食中添加魚(yú)粉會(huì)改變腸道微生物群，促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的增長(zhǎng)，對(duì)胃腸道上皮細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害[26-27]?？偠灾T發(fā)因素可導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速感染，迅速增殖，隨之發(fā)病。

產(chǎn)氣莢膜梭菌可在不同動(dòng)物中引起多種疾病，例如家畜的“猝死癥”、禽類(lèi)的壞死性腸炎以及人類(lèi)的食物中毒等，這些不同的發(fā)病形式主要取決于病原體所產(chǎn)生的主要毒素類(lèi)型[28]。產(chǎn)氣莢膜梭菌可根據(jù)這些主要毒素的不同組合分為A、B、C、D、E5種類(lèi)型。A型菌的主要毒素為α毒素，同時(shí)α毒素也存在于B、C、D、E這四種類(lèi)型菌中，β毒素作為B型菌的致死毒素和C型菌的壞死因子則同時(shí)存在于B型和C型菌中。ε作為D型菌的主要致病因子同時(shí)存在于B型和D型菌中，而ι毒素和α毒素則同時(shí)存在于E型菌中[29]。A型疾病已在雞和羊中得到證實(shí)，而B(niǎo)型疾病主要發(fā)生在羊身上，可由于β毒素導(dǎo)致壞死性腸炎，偶爾也會(huì)由于ε毒素而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)改變。C型疾病主要發(fā)生在大多數(shù)物種的新生兒中，由于β毒素對(duì)胰蛋白酶的作用非常敏感，而初乳對(duì)蛋白酶具有抑制作用，這可能是導(dǎo)致這種年齡傾向的重要原因。D型疾病主要發(fā)生在綿羊和山羊身上，該病的特點(diǎn)是產(chǎn)生神經(jīng)學(xué)方面的臨床癥狀。E型疾病傳統(tǒng)上被認(rèn)為是兔子的疾病，但偶爾也會(huì)在羊和牛的身上被檢測(cè)出來(lái)[30]。雞的壞死性腸炎多由A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起，根據(jù)試驗(yàn)的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，從病死蛋雞腸道內(nèi)容物中分離出產(chǎn)氣莢膜梭菌均僅檢測(cè)出α毒素，因此判定該試驗(yàn)的分離菌均為A型，說(shuō)明引起該蛋雞場(chǎng)發(fā)生壞死性腸炎的產(chǎn)氣莢膜梭菌大多為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

雞壞死性腸炎在全球大多數(shù)國(guó)家均有報(bào)道。根據(jù)研究顯示，已有超過(guò)50%的雞群感染壞死性腸炎。其中亞洲發(fā)病率最高，其次是歐洲及拉丁美洲等[29]。在我國(guó)主要集中于長(zhǎng)江以北地區(qū)，例如山東、河北、山西等[9]。散養(yǎng)雞場(chǎng)較集約化雞場(chǎng)更易發(fā)病[31]，并且在同一雞群或者同一地區(qū)可反復(fù)發(fā)生，持續(xù)出現(xiàn)病死雞和淘汰雞[32]，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)該試驗(yàn)中患病雞群進(jìn)行解刨時(shí)發(fā)現(xiàn)患病雞。

在以前，抗生素的使用可對(duì)壞死性腸炎起到一定的抑制作用。但隨著蛋雞養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，抗生素的使用也越來(lái)越廣泛，導(dǎo)致抗生素的耐藥性逐漸增加。近年來(lái)已報(bào)道產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)慶大霉素，鏈霉素，草酸，林可霉素，紅霉素和螺旋霉素等均具有耐藥性。不僅如此，抗生素在肉、蛋等食品中還出現(xiàn)了殘留問(wèn)題，導(dǎo)致消費(fèi)者對(duì)無(wú)抗產(chǎn)品的需求增加，因此抗生素的使用要求越來(lái)越嚴(yán)格，蛋雞的患病率也就越來(lái)越高[33]。據(jù)估計(jì)，壞死性腸炎每年給全球家禽養(yǎng)殖業(yè)造成的生產(chǎn)損失超過(guò)20億美元。這已經(jīng)引起了全球各大養(yǎng)禽業(yè)的高度重視，各個(gè)國(guó)家也已經(jīng)開(kāi)始了對(duì)雞壞死性腸炎以及產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究，力爭(zhēng)盡快控制該疾病[28]。試驗(yàn)對(duì)患病雞場(chǎng)進(jìn)行的研究也可為預(yù)防雞壞死性腸炎提供理論依據(jù)及基礎(chǔ)素材，進(jìn)一步推動(dòng)蛋雞養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

由于該類(lèi)疾病在出現(xiàn)臨床癥狀后死亡的速度較快，因此免疫預(yù)防成為了最重要的控制措施。這要求在平時(shí)的飼養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)及時(shí)清糞，保持環(huán)境衛(wèi)生良好，勤消毒，加強(qiáng)通風(fēng)及飼糧管理[34]。在日常飼料中添加一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[35]。同時(shí)對(duì)病死雞進(jìn)行無(wú)害化處理，減少傳染的可能性，抵制該病的大規(guī)模發(fā)生[24]。由于地方或國(guó)家使用抗生素的政策不同，產(chǎn)氣莢膜梭菌的抗生素耐藥模式也不相同。因此，在對(duì)家禽進(jìn)行疾病治療時(shí)應(yīng)考慮其耐藥性，以確保快速治療。同時(shí)也應(yīng)及時(shí)尋找抗生素替代品，以避免產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生新的耐藥性[33]。

5 結(jié)論

根據(jù)16SrRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)從20只患病蛋雞體內(nèi)共分離出7株產(chǎn)氣莢膜梭菌，同源性均在99.86%～100%之間。將產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株進(jìn)行多重PCR鑒定后顯示均為A型。因此，認(rèn)為引起該雞場(chǎng)發(fā)生大規(guī)模壞死性腸炎的可能是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。