HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉中磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的含量

梁勁康，張桂君，黎健業(yè)，吳志玲，黎乃添，方炳虎

(廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東云浮 527400)

復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉是由磺胺間甲氧嘧啶鈉、甲氧芐啶和葡萄糖等輔料混合配制成的粉劑，主要用于革蘭氏陽(yáng)性和陰性敏感菌引起的感染，如呼吸道、消化道、泌尿道感染及球蟲病等。根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017年版)中復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)分別采用永停滴定法和紫外可見分光光度法測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的含量[1]。但與高效液相色譜法相比，上述兩種檢測(cè)方法操作較為繁瑣，而且測(cè)定結(jié)果誤差較大。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，已有研究學(xué)者報(bào)道了利用高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉溶液和注射液中磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的含量[2-4]。本文在上述文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化其色譜條件，建立了可同時(shí)測(cè)定復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉中磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的高效液相色譜方法。該方法快速簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)方法提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)配置2489 UV/Vis檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；CPA225D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品(含量：99.5%，批號(hào)：C0031610，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；甲氧芐啶對(duì)照品(含量：99.8%，批號(hào)：H0161704，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉(規(guī)格為100 g：磺胺間甲氧嘧啶鈉10 g +甲氧芐啶2 g，批號(hào):20180701，廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司新興化藥分公司生產(chǎn)技術(shù)部自制)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；磷酸(分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)；超純水(實(shí)驗(yàn)室自制，符合GB/T 6682-1992規(guī)定的一級(jí)水要求)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 精密稱取12.66 mg磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品和12.57 mg甲氧芐啶對(duì)照品，置于25 mL容量瓶中，加入適量乙腈，超聲使藥物完全溶解后，補(bǔ)加乙腈至刻度，搖勻，制得磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(磺胺間甲氧嘧啶的濃度為503.87 μg/mL；甲氧芐啶的濃度為501.79 μg/mL)。

1.3.2 供試品溶液的配制 精密稱取0.25 g復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉樣品于50 mL容量瓶中，加入適量流動(dòng)相，超聲使樣品全部溶解后，補(bǔ)加流動(dòng)相至刻度，搖勻；精密移取1 mL至10 mL容量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻后，制得供試品溶液。供試品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液用于液相色譜分析。另取0.25 g不含藥物的空白輔料樣品，同法處理，制得空白輔料溶液。

1.3.3 色譜條件 色譜條件為：ECOSIL 120-5-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80，V/V)為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。以磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的色譜峰計(jì)算，理論塔板數(shù)應(yīng)在3000以上。

1.3.4 專屬性試驗(yàn) 取1.3.1項(xiàng)磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行適量稀釋后，按1.3.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。另分別取1.3.2項(xiàng)的供試品溶液以及空白輔料溶液，同法操作，記錄色譜圖。

1.3.5 靈敏度試驗(yàn) 分別精密移取一定體積1.3.1項(xiàng)的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL的容量瓶中，流動(dòng)相定容，進(jìn)行逐級(jí)稀釋。稀釋液按1.3.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比(S/N)為3的檢測(cè)濃度為檢測(cè)限(LOD)，以信噪比(S/N)為10的檢測(cè)濃度為定量限(LOQ)。

1.3.6 磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶線性范圍 分別精密移取一定體積的1.3.1項(xiàng)的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，流動(dòng)相稀釋，配得磺胺間甲氧嘧啶的質(zhì)量濃度分別為100.77、50.387、10.077、5.0387、1.0077、0.10077 μg/mL以及甲氧芐啶的的質(zhì)量濃度分別為100.36、50.179、10.036、5.0179、1.0036、0.10036 μg/mL混合對(duì)照品稀釋液。上述稀釋液分別經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液按1.3.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。

1.3.7 精密度試驗(yàn) 分別精密移取一定體積的1.3.1項(xiàng)下的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋至磺胺間甲氧嘧啶的質(zhì)量濃度分別為50.387、40.310和25.194 μg/mL以及甲氧芐啶的質(zhì)量濃度分別為50.179、40.143、25.090 μg/mL的高、中、低3種混合對(duì)照品溶液。3種濃度的混合對(duì)照品溶液按1.3.3項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5針，記錄峰面積。

1.3.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 分別精密移取一定體積的1.3.1項(xiàng)下的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液以及1 mL 1.3.2項(xiàng)下的空白輔料溶液于10 mL容量瓶中，流動(dòng)相稀釋定容，搖勻，配得磺胺間甲氧嘧啶的質(zhì)量濃度分別為50.387、40.310、25.194 μg/mL以及甲氧芐啶的質(zhì)量濃度分別為50.179、40.143、25.090 μg/mL的高、中、低3種混合對(duì)照品溶液。每一濃度平行配制3份。上述溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液按1.3.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.3.7項(xiàng)下的高、中、低3種磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按1.3.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.3.10 樣品含量測(cè)定 平行稱取5份復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉供試品，按1.3.2項(xiàng)下的供試品溶液的配制方法同法操作，所得供試品溶液按1.3.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的含量。另外，平行稱取5份供試品，按照《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017年版)中復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉項(xiàng)下的測(cè)定方法[1]，分別采用永停滴定法和紫外可見分光光度法測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化及確定 參考文獻(xiàn)的色譜方法[2-5]，在前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)選用0.2%冰醋酸溶液以不同比例與乙腈組成的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)，磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的色譜峰均出現(xiàn)了不同程度的拖尾現(xiàn)象；而當(dāng)流動(dòng)相組成為乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80，V/V)時(shí)，磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的色譜峰峰型較好，因此，選擇了乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80，V/V)作為磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶液相檢測(cè)的流動(dòng)相。此外，當(dāng)選用長(zhǎng)度為150 mm的色譜柱進(jìn)行洗脫時(shí)，甲氧芐啶和磺胺間甲氧嘧啶的保留時(shí)間分別是1.5 min和4.5 min左右。為了提高兩種藥物色譜峰的分離度，本文最終選擇了長(zhǎng)度為250 mm的C18柱進(jìn)行洗脫。

經(jīng)優(yōu)化后，確定了磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的高效液相色譜檢測(cè)條件為采用ECOSIL 120-5-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱，在柱溫為30 ℃條件下以乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80，V/V)為流動(dòng)相按1.0 mL/min流速進(jìn)行等度洗脫。在上述色譜條件下，磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶能得到更充分的分離，峰型更理想。

2.2 專屬性試驗(yàn) 磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見圖1。由圖1中可以看出，空白輔料在該色譜條件下并不會(huì)干擾磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的色譜峰。甲氧芐啶的出峰時(shí)間為5.6 min，而磺胺間甲氧嘧啶的出峰時(shí)間為13.6 min。兩種藥物的峰型較好，且分離度良好。

(A：磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)混合溶液；B：空白輔料溶液，C：供試品溶液。A for the mixed standard solution of the sulfamonomethoxine and trimethoprim；B for the blank excipient solution；C for the sample solution)圖1 空白輔料、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液的高效液相色譜圖Fig 1 The HPLC spectrum of sulfamonomethoxine and trimethoprim blank, mixture standard and sample solution

2.3 靈敏度試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磺胺間甲氧嘧啶的LOD可達(dá)20.155 μg/L，LOQ則為50.387 μg/L；而甲氧芐啶LOD可達(dá)10.036 μg/L，LOQ則為100.36 μg/L。

2.4 磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶線性范圍 利用1.3.3項(xiàng)下的高效液相色譜方法測(cè)得磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的峰面積后，分別以峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明磺胺間甲氧嘧啶在0.10077～100.77 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A1= 69756C1- 16072(R2=0.9998)；甲氧芐啶在0.10036～100.36 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A2= 24183C2- 2830.4(R2=0.9998)。

2.5 精密度試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磺胺間甲氧嘧啶在質(zhì)量濃度為50.387、40.310和25.194 μg/mL時(shí)連續(xù)進(jìn)樣5針后，峰面積的RSD分別為0.19%、0.65%和0.20%。甲氧芐啶在質(zhì)量濃度為50.179、40.143、25.090 μg/mL時(shí)連續(xù)進(jìn)樣5針后，峰面積的RSD分別為0.28%、0.87%和0.21%。上述結(jié)果均符合方法學(xué)要求，表明本方法精密度良好。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 加標(biāo)回收率試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見表1和表2。結(jié)果表明，磺胺間甲氧嘧啶在50.387、40.310、25.194 μg/mL等3種水平濃度下的平均加標(biāo)回收率為100.03%、99.46%和98.68%，RSD分別為0.69%、0.46%和0.41%。甲氧芐啶在50.179、40.143、25.090 μg/mL等3種水平濃度下的平均加標(biāo)回收率為99.95%、99.40%和98.86%，RSD分別為0.12%、0.85%和0.32%。上述結(jié)果均能滿足方法學(xué)的要求，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

表1 磺胺間甲氧嘧啶加標(biāo)回收率結(jié)果Tab 1 The average recovery results of sulfamonomethoxine

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 穩(wěn)定性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磺胺間甲氧嘧啶在濃度為25.194、40.310和50.387 μg/mL時(shí)24 h內(nèi)峰面積RSD分別為0.19%、0.11%和1.16%；甲氧芐啶在濃度為25.090、40.143、50.179 μg/mL時(shí)24 h內(nèi)峰面積RSD分別為0.22%、0.39%和和1.08%，表明磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品含量測(cè)定 供試品中磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的測(cè)定結(jié)果可見表3和表4。5份供試品中磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的含量均在標(biāo)示量的90.0%～110.0%范圍內(nèi)，因此，5份供試品中磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的含量均符合要求。分別將表2和表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，利用高效液相色譜法和永停滴定法測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉含量的結(jié)果并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而利用高效液相色譜法和紫外分光光度法測(cè)定甲氧芐啶含量的結(jié)果也并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表2 甲氧芐啶加標(biāo)回收率結(jié)果Tab 2 The average recovery results of trimethoprim

表3 磺胺間甲氧嘧啶鈉的含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 Results of the determined content of sulfamonomethoxine sodium

表4 甲氧芐啶的含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 Results of the determined content of trimethoprim

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)方法的比較 雖然國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了分別采用永停滴定法和紫外可見分光光度法測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的含量，但這兩種測(cè)定方法操作繁瑣復(fù)雜，極易引入測(cè)量誤差。在采用永停滴定法測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉的含量時(shí)，亞硝酸鈉滴定液濃度及其消耗體積、移液管和滴定管校準(zhǔn)、稱量和基準(zhǔn)物純度等因素均是測(cè)量結(jié)果不確定度的主要來(lái)源，而且這些因素在實(shí)際操作中也很難以規(guī)避[6]。而高效液相色譜法測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉含量引入不確定度影響因素主要是稱量、對(duì)照品含量、溶液定容和重復(fù)進(jìn)樣等[7]。與永停滴定法相對(duì)擴(kuò)展不確定度(U=0.8)相比，高效液相色譜法的相對(duì)擴(kuò)展不確定度更小(U=0.5)，也就說明了高效液相色譜法測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶鈉含量的準(zhǔn)確度更高[6-7]。同樣，采用紫外分光光度法測(cè)定甲氧芐啶的含量時(shí)，需先后使用三氯甲烷和稀醋酸進(jìn)行提取后才能測(cè)定藥物的含量。在提取過程中，極易造成藥物的損失。而高效液相色譜法克服了原方法操作繁瑣復(fù)雜的缺點(diǎn)，避免了操作過程人為因素對(duì)結(jié)果造成的影響[1,8]。因此，高效液相色譜法是較理想的檢測(cè)磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶含量的方法之一。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 為了進(jìn)一步優(yōu)化其高效液相色譜條件，本文也對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相組成等因素進(jìn)行了篩選。楊學(xué)武等選擇了230 nm作為磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的液相檢測(cè)波長(zhǎng)[4]。但是，230 nm波長(zhǎng)處接近于紫外末端吸收，容易引起基線漂移等問題。分別采用磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶對(duì)照品溶液在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描后發(fā)現(xiàn)，磺胺間甲氧嘧啶的紫外最大吸收波長(zhǎng)為273 nm，甲氧芐啶紫外最大吸收波長(zhǎng)為 271 nm，而二者在270 nm下均有較強(qiáng)吸收，因此，本文最終選擇了檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道所選擇檢測(cè)波長(zhǎng)一致[2-3]。

3.3 流動(dòng)相的選擇 張志美和郭時(shí)金等在磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的液相分析檢測(cè)中，采用了甲醇作為有機(jī)相進(jìn)行洗脫[2-3]。但與甲醇相比，乙腈的極性更低，更有利于改善磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶分離度。此外，乙腈的紫外吸光度值比甲醇更低，能夠避免溶劑的基質(zhì)效應(yīng)；而且等比例的乙腈與水混合后柱壓也比甲醇更穩(wěn)定，能夠避免基線的波動(dòng)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此，本文優(yōu)先選擇了乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相。由于磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶結(jié)構(gòu)中均含有氨基基團(tuán)，在流動(dòng)相中加入適量的酸可避免峰型的拖尾現(xiàn)象。在前期實(shí)驗(yàn)中，本文也比較了冰醋酸、磷酸及其不同濃度對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的分離效果和對(duì)藥物峰型的影響，其中以乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80，V/V)時(shí)，磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的色譜峰峰型更好，分離度也更優(yōu)。

3.4 色譜柱的選擇 除了檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相等因素外，色譜柱的長(zhǎng)度對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶的分離效果也具有較顯著的影響。經(jīng)篩選后，本文選擇了長(zhǎng)度為250 mm的C18柱進(jìn)行洗脫，以提高兩種藥物色譜峰的分離度。

本文建立的高效液相色譜法能夠使磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶充分分離，而且該方法簡(jiǎn)便有效，線性關(guān)系良好，精確度和靈敏度高，可作為復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉中磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶同時(shí)定量的分析方法。