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    犬細(xì)小病毒YA-16-C66株紙片載體培養(yǎng)工藝優(yōu)化及其與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的比較分析

    2021-01-04 09:34:12朱明媛李艷玲董建偉
    中國(guó)獸藥雜志 2020年12期
    關(guān)鍵詞:細(xì)小紙片反應(yīng)器

    朱明媛,劉 靜,李艷玲,董建偉,黃 韜,李 潤(rùn)

    (唐山怡安生物工程有限公司,河北唐山 063020)

    犬細(xì)小病毒病(Canine parvovirus disease,CPVD)是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的犬的一種急性高度接觸性傳染病,與病犬接觸后100%感染,致死率高達(dá)70%[1]。該病既嚴(yán)重威脅家養(yǎng)寵物的健康,又對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)構(gòu)成較大危害。犬細(xì)小病毒病目前沒(méi)有特效藥物,除依靠動(dòng)物自身的免疫系統(tǒng)抵抗外,接種疫苗是預(yù)防犬細(xì)小病毒感染的最有效方法?;钜呙纭缁钜呙?、弱毒疫苗均有報(bào)道能一定程度預(yù)防犬細(xì)小病毒病[2-4],目前國(guó)內(nèi)常用弱毒疫苗預(yù)防犬細(xì)小病毒病,但弱毒疫苗通常因母源抗體干擾發(fā)生免疫失敗,接種后動(dòng)物可長(zhǎng)期排毒,存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)。犬細(xì)小滅活疫苗具備免疫原性而不具有致病性,接種后動(dòng)物能產(chǎn)生免疫應(yīng)答,達(dá)到保護(hù)作用,越來(lái)越受到科研工作者的青睞,但制備滅活疫苗對(duì)抗原的滴度要求很高,所以獲得高產(chǎn)量、高質(zhì)量的抗原是實(shí)現(xiàn)犬細(xì)小滅活疫苗產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。

    目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的獲得犬細(xì)小病毒的方法主要有轉(zhuǎn)瓶法、雞胚法,鮮見(jiàn)有利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)犬細(xì)小病毒的報(bào)道。傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝培養(yǎng)病毒普遍存在病毒滴度低、批間差大、勞動(dòng)力成本高、易污染等問(wèn)題[5-6],因此找到一種新的培養(yǎng)犬細(xì)小病毒的方法頗為急切。本文利用微型生物反應(yīng)器及NBS反應(yīng)器摸索培養(yǎng)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株最佳工藝,并將利用該工藝生產(chǎn)的抗原同傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品做對(duì)比,以期為犬細(xì)小病毒的高產(chǎn)、高質(zhì)培養(yǎng)提供一種新的可行方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞與病毒 F81細(xì)胞,唐山怡安生物工程有限公司馴化、保藏;犬細(xì)小病毒YA-16-C66株,唐山怡安生物工程有限公司篩選、保藏。

    1.1.2 主要溶液與試劑 199培養(yǎng)基,天信合生物科技有限公司;新生牛血清,武漢三利生物科技有限公司;β-丙內(nèi)酯(BPL),德國(guó)SERVA;MONTANIDE GEL 02,賽彼科(上海)特殊化學(xué)品有限公司。

    1.1.3 載體 聚酯纖維紙片載體,上海楚怡生物科技有限公司。

    1.1.4 儀器設(shè)備 微型轉(zhuǎn)管生物反應(yīng)器,杭州安普生物工程有限公司;CO2培養(yǎng)箱,三洋MCO-15AC;BioFlo 310型生物反應(yīng)器(5L),美國(guó)NBS生物工程公司;SBA生化分析儀,濟(jì)南延和生物科技有限公司。

    1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 比格犬,北京瑪斯生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 F81細(xì)胞的最佳接種密度確定 利用微型生物反應(yīng)器,內(nèi)含0.6 g聚酯纖維紙片載體。培養(yǎng)條件為:37.0 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基為1%新生牛血清的199培養(yǎng)基,分別按照0.5×107/g、1.5×107/g、2.5×107/g密度接種細(xì)胞。每個(gè)密度平行設(shè)置9支。為了確保細(xì)胞增殖不受營(yíng)養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的影響,培養(yǎng)基每24 h更換一次,并測(cè)定殘?zhí)菨舛取C?4 h取一支轉(zhuǎn)管,將載體用0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù),分析細(xì)胞密度與葡萄糖消耗之間的關(guān)系。

    1.2.2 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量確定 利用微型生物反應(yīng)器,以1.5×107/g密度接種細(xì)胞,同時(shí)以不同感染復(fù)數(shù)(MOIs:0.05、0.1、0.2、0.4)接種病毒。每個(gè)接毒劑量平行設(shè)置9支,將微型反應(yīng)器置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接毒后每24 h完全換液,測(cè)定葡萄糖消耗和上清液的病毒含量TCID50,TCID50測(cè)定方法參照《中國(guó)獸藥典》[7]。每24 h取一支轉(zhuǎn)管,將載體用0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù),直到紙片載體上細(xì)胞幾乎全部脫落時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。結(jié)合病毒含量和細(xì)胞病變情況,確定犬細(xì)小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量。

    1.2.3 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝優(yōu)化 按照工藝流程,將150 g紙片載體裝入5L NBS生物反應(yīng)器中,經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用。將生長(zhǎng)成良好致密單層的F81細(xì)胞制成懸液,以1.5×107/g密度接種,犬細(xì)小病毒YA-16-C66株用培養(yǎng)基稀釋后,以感染復(fù)數(shù)0.05 MOI接種。培養(yǎng)基為含1%新生牛血清的199培養(yǎng)基,培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置為37 ℃,pH7.2,溶氧50%,攪拌速度50 r/min,24 h后開(kāi)啟灌流。1#反應(yīng)器溫度維持在37.0 ℃;2#反應(yīng)器培養(yǎng)溫度在接種細(xì)胞48 h后降至35.0 ℃。24 h開(kāi)始每天取樣測(cè)定葡萄糖消耗,根據(jù)糖耗及細(xì)胞病變清情況調(diào)整灌流速度,使反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖濃度控制在0.5 g/L以上。48 h開(kāi)始收獲并每天測(cè)定病毒含量TCID50,直到紙片載體上細(xì)胞幾乎全部脫落時(shí)結(jié)束培養(yǎng),測(cè)定總病毒含量TCID50。經(jīng)過(guò)3批次驗(yàn)證,比較兩種不同溫度培養(yǎng)對(duì)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株產(chǎn)毒質(zhì)量的影響,確定利用F81細(xì)胞生產(chǎn)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株的紙片載體培養(yǎng)工藝。

    1.2.4 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株工藝比較

    1.2.4.1 紙片載體培養(yǎng)工藝 按照1.2.3確定的工藝,在5L生物反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)3批病毒。當(dāng)糖耗降低,紙片載體上細(xì)胞幾乎全部脫落時(shí)結(jié)束培養(yǎng),收獲上清液,測(cè)定病毒含量TCID50。

    1.2.4.2 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝 將生長(zhǎng)成致密單層的F81細(xì)胞消化成懸液,與稀釋過(guò)的犬細(xì)小病毒YA-16-C66株同步接入3L轉(zhuǎn)瓶,每批次使用10個(gè)3L轉(zhuǎn)瓶。病毒接種劑量為0.05 MOI,培養(yǎng)溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為10 r/h。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%~90%(CPE)以上時(shí),收獲病毒液,測(cè)定病毒含量TCID50。

    1.2.4.3 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株HI效價(jià)測(cè)定將反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶獲得的犬細(xì)小病毒YA-16-C66株分別經(jīng)濃縮、β-丙內(nèi)酯滅活,加入10%比例的MONTANIDE GEL 02,依據(jù)濃縮液TCID50結(jié)果制成抗原含量為107.0TCID50/100μL、符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的犬細(xì)小病毒滅活疫苗,產(chǎn)品名稱(chēng)依據(jù)抗原生產(chǎn)批次依次命名為CPV-C1910-001、CPV-C1911-002、CPV-C1912-003。

    將6~8周齡的犬細(xì)小病毒抗體陰性、健康的比格犬分為6組,每組7只。取5只按0、7日免疫程序免疫,每只1 mL/次,作免疫組;2只不免疫,作對(duì)照組。首免后28日采血,依據(jù)《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[8]進(jìn)行血清抗體效價(jià)測(cè)定。

    2 結(jié) 果

    2.1 F81細(xì)胞最佳接種密度 以不同密度接種,F(xiàn)81細(xì)胞最大密度差異較小,但達(dá)到最大密度的時(shí)間不同,如圖1所示。按0.5×107/g接種時(shí),細(xì)胞增長(zhǎng)較慢,到168 h細(xì)胞達(dá)到最大量。按2.5×107/g接種細(xì)胞比按1.5×107/g接種細(xì)胞提前一天達(dá)到最大密度,但達(dá)到最大密度后糖耗下降較快。按1.5×107/g接種時(shí),F(xiàn)81細(xì)胞在紙片載體上生長(zhǎng)和糖耗關(guān)系如圖2所示,細(xì)胞生長(zhǎng)與糖耗呈正相關(guān),培養(yǎng)120 h后,細(xì)胞從9.0×106增加到8.92×107,糖耗最大達(dá)到3.58 mg/mL。因此,確定F81細(xì)胞最佳接種密度為1.5×107/g。

    圖1 不同接種密度葡萄糖消耗曲線(xiàn)Fig 1 Glucose consumption curve of different inoculation densities

    圖2 初始接種密度為1.5×107/g時(shí)的糖耗與細(xì)胞總量關(guān)系Fig 2 The relationship between glucose consumption and cell density with the initial concentration densities was 1.5×107/g

    2.2 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株最佳接種劑量不同感染復(fù)數(shù)(MOIs:0.05、0.1、0.2、0.4)接毒對(duì)生物反應(yīng)器中犬細(xì)小病毒YA-16-C66株擴(kuò)增的影響如圖3所示,按0.05 MOI與0.1 MOI接毒,病毒達(dá)最大增殖能力的時(shí)間分別為96 h和72 h,且維持時(shí)間較長(zhǎng);高于0.1 MOI接種病毒時(shí),細(xì)胞病變過(guò)快,細(xì)胞維持時(shí)間短,導(dǎo)致最終病毒滴度下降較快。由圖4、圖5可知,犬細(xì)小病毒YA-16-C66株病毒含量與糖耗呈正相關(guān),四種接毒劑量的收獲液病毒含量均能達(dá)到106.0TCID50/100μL以上。綜合考慮,確定犬細(xì)小病毒YA-16-C66株接毒劑量為0.05 MOI。

    圖3 按不同MOI接種病毒的糖耗曲線(xiàn)Fig 3 Glucose consumption curve of virus inoculation according to different MOI

    圖4 按0.05 MOI接種病毒時(shí)的糖耗與病毒含量關(guān)系Fig 4 The relationship between glucose consumption and lgTCID50 with the virus inoculated at 0.05 MOI

    圖5 按不同MOI接種時(shí)收獲液的病毒含量Fig 5 The lgTCID50 in harvest fluid inoculated with different MOI

    2.3 生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝優(yōu)化 兩種溫度不同時(shí)間收獲液病毒含量TCID50結(jié)果如圖6所示,1#反應(yīng)器收獲液病毒含量在72 h達(dá)到峰值,為107.7TCID50/100μL,但病毒含量下降較快,96 h降為106.8TCID50/100μL。2#反應(yīng)器收獲液病毒含量達(dá)到峰值的時(shí)間為96 h,且到120 h病毒含量仍能維持在107.4TCID50/100μL,溫度適當(dāng)降低能維持細(xì)胞較長(zhǎng)存活時(shí)間,對(duì)總病毒含量的提升更有利。綜合分析,確定犬細(xì)小病毒YA-16-C66株反應(yīng)器培養(yǎng)工藝為:采用同步接毒法,培養(yǎng)基為含1%新生牛血清的199溶液,細(xì)胞接種密度為1.5×107/g,接毒劑量為0.05 MOI,在pH 7.2條件下,37.0 ℃培養(yǎng)48 h后降溫到35.0 ℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h,且待細(xì)胞病變達(dá)到80%~90%時(shí)收獲上清液。

    圖6 不同溫度下犬細(xì)小病毒YA-16-C66株增值曲線(xiàn)Fig 6 Proliferation curve of YA-16-C66 strain of Canine Parvovirus at different temperatures

    2.4 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株工藝比較 3批次反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量和總量結(jié)果如表1:接毒后反應(yīng)器中細(xì)胞能維持4~5 d,收獲液病毒含量在107.6~107.8TCID50/100μL之間,收獲液體積約為10.5 L;轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)能維持4 d,收獲液產(chǎn)量約為3 L,收獲液病毒含量在105.9~106.5TCID50/100μL之間。反應(yīng)器比轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量高1.1~1.9 lgTCID50/100μL;相同培養(yǎng)面積,反應(yīng)器所得病毒總量是轉(zhuǎn)瓶所得病毒總量的2.8~18.5倍。

    表1 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量和產(chǎn)量Tab 1 The content and yield of virus in the reactor and the spinner harvester

    2.5 犬細(xì)小病毒YA-16-C66株HI抗體效價(jià)測(cè)定 3批次反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品HI抗體效價(jià)結(jié)果如表2:所有試驗(yàn)犬只免疫28 d的血清凝集效價(jià)均≥1∶896,能達(dá)到有效保護(hù),同時(shí)對(duì)照組犬只的血清HI效價(jià)均顯示為1∶10,即無(wú)抗體產(chǎn)生。

    表2 反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品HI抗體效價(jià)Tab 2 HI antibody titer of the reactor and spinner technology products

    3 分析與討論

    3.1 F81細(xì)胞培養(yǎng)載體 對(duì)于貼壁細(xì)胞而言,傳統(tǒng)的小型培養(yǎng)容器有培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠、轉(zhuǎn)瓶等,利用反應(yīng)器培養(yǎng)貼壁細(xì)胞一般借助于微載體和紙片載體。相比于培養(yǎng)瓶和細(xì)胞工廠的靜置培養(yǎng),轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟的特點(diǎn),而且細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓柱狀瓶中,培養(yǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)瓶不停旋轉(zhuǎn),使細(xì)胞交替接觸營(yíng)養(yǎng)液并進(jìn)行空氣交換,更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。因?yàn)橹貜?fù)性好,放大只需要簡(jiǎn)單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量,轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)常用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過(guò)渡階段,或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞的一種途徑。

    紙片載體是順應(yīng)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)而發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)載體,相對(duì)于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng),利用反應(yīng)器進(jìn)行紙片載體培養(yǎng)細(xì)胞具有節(jié)省勞動(dòng)力、占地空間小,單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積大,細(xì)胞生長(zhǎng)密度高,培養(yǎng)時(shí)能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并控制環(huán)境條件等優(yōu)點(diǎn)。紙片載體多層張力結(jié)構(gòu)能保證培養(yǎng)基與細(xì)胞充分接觸,培養(yǎng)基流過(guò)載體層,攪拌剪切力和通氣氣泡對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響,更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。在5L NBS反應(yīng)器中,150 g紙片載體能提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積為2.25×105cm2,相當(dāng)于150個(gè)3L轉(zhuǎn)瓶提供的表面積,根據(jù)糖耗與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系,F(xiàn)81細(xì)胞在5L反應(yīng)器中生長(zhǎng)的最大量能達(dá)到3.02×1010/g,而具有同樣生長(zhǎng)面積的轉(zhuǎn)瓶中F81細(xì)胞最多能達(dá)4.90×109,相差6倍。

    3.2 F81細(xì)胞培養(yǎng)犬細(xì)小病毒工藝 利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)病毒屬于勞動(dòng)密集型方法,需要眾多人員,步驟繁瑣,比較容易發(fā)生污染,而且轉(zhuǎn)瓶單位體積產(chǎn)量較低,培養(yǎng)過(guò)程中環(huán)境差異及人員操作誤差常導(dǎo)致不同批次毒價(jià)不穩(wěn)定[10]。

    利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)F81細(xì)胞,可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與調(diào)控溫度、pH、溶氧等參數(shù),細(xì)胞密度和活力高于轉(zhuǎn)瓶或者固定的平面等培養(yǎng)系統(tǒng)。隨著細(xì)胞灌流技術(shù)的發(fā)展,對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)與病毒生產(chǎn)條件不一致的工藝,降低培養(yǎng)溫度,提高代謝所需物質(zhì),最終能有效提高病毒的產(chǎn)量與質(zhì)量[11-12]。利用5L反應(yīng)器與3L轉(zhuǎn)瓶同時(shí)培養(yǎng)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株,生物反應(yīng)器收獲液病毒含量均在107.0TCID50/100μL以上,而轉(zhuǎn)瓶收獲液病毒含量從105.9TCID50/100μL到106.5TCID50/100μL;相同培養(yǎng)面積,反應(yīng)器所得病毒總量是轉(zhuǎn)瓶所得病毒總量的2.8~18.5倍;相同抗原含量的滅活苗,反應(yīng)器與轉(zhuǎn)瓶工藝產(chǎn)品無(wú)顯著性差異,血凝抑制效價(jià)均為1∶896。

    4 結(jié) 語(yǔ)

    本試驗(yàn)確定了NBS生物反應(yīng)器培養(yǎng)F81細(xì)胞生產(chǎn)犬細(xì)小病毒YA-16-C66株的工藝,屬于該毒株在NBS生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的初步探索。利用該工藝培養(yǎng)的犬細(xì)小病毒YA-16-C66株,抗原滴度達(dá)到107.8TCID50/100μL,工藝產(chǎn)品血凝抑制效價(jià)HI在1∶768以上,完全達(dá)到犬細(xì)小滅活苗制備的要求[13],且比轉(zhuǎn)瓶工藝抗原產(chǎn)量高,極大的節(jié)約了生產(chǎn)成本,為犬細(xì)小病毒YA-16-C66株的產(chǎn)業(yè)化提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。

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