獸用消毒劑申報資料中殺滅微生物效力試驗探討

郭桂芳，溫 芳，劉自揚，徐 倩，王學(xué)偉，蘇富琴，梁先明

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

從動物的禽流感、豬瘟到人的重癥急性呼吸綜合征(SARS)、埃博拉疫情及新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)，不斷出現(xiàn)的新型傳染病和爆發(fā)流行，使得傳染病的防治受到前所未有的重視?；瘜W(xué)消毒劑因其殺菌作用迅速、效果明顯、價格低廉，使用方便等特點，使其在控制和預(yù)防傳染病傳播方面得到廣泛的應(yīng)用。因此，化學(xué)消毒劑是實現(xiàn)由被動治療到主動防治的一種重要手段。由于食品動物治療用藥的限制、微生物的耐藥性等因素，臨床對獸用消毒劑的需求越來越大。因此，探討獸用化學(xué)消毒劑的效力評價試驗，對規(guī)范和促進環(huán)保高效的獸用化學(xué)消毒劑開發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。

1 獸用消毒劑概念、分類及管理類型及評審機構(gòu)

1.1 獸用消毒劑 系指用于殺滅動物體表、畜舍、運輸車輛、獸用手術(shù)器械等傳播媒介上的微生物使其達到消毒或滅菌的制劑[1]。消毒(disinfection)系指殺滅或清除傳播媒介上病原微生物，使其達到無害化的處理。滅菌(sterilization)系指殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的處理[2]。

1.2 消毒劑分類、管理類型及評審機構(gòu) 在美國，將化學(xué)消毒劑分為兩種，用于處理低風(fēng)險醫(yī)療器械和醫(yī)療器械表面的普通消毒劑(中、低水平消毒劑)；用于處理高、中度風(fēng)險醫(yī)療器戒的高水平消毒劑。中、低水平消毒劑作為農(nóng)藥—抗菌殺蟲劑(Antimi-crobial Products)進行管理，評審機構(gòu)為美國國家環(huán)境保護局(FPA)，高水平消毒劑作為醫(yī)療器械(Ⅱ)進行管理[3-5]，評審機構(gòu)為美國食品和藥物管理局(FDA)，在加拿大，消毒劑按消毒藥品(Disnfectantl Drugs)管理[6]，評審機構(gòu)為衛(wèi)生部-健康產(chǎn)品與食品檢驗局(Health Products and Food Branch)下屬的藥物理事會(TPD)；在歐洲管理類別為Ⅱa和Ⅱb類，評審機構(gòu)為第三方認(rèn)證機構(gòu)；在澳大利亞管理類別為Ⅱb類[7]，評審機構(gòu)為衛(wèi)生和老齡部治療藥物管理局(Department of Health and Ageing Therapeutic Goods Administration)；墨西哥和厄瓜多爾(Ⅱ類)等國家和地區(qū)作為醫(yī)療器械管理；在中國消毒劑上市審批是由國家衛(wèi)生和計劃生育委員會負責(zé)。

依據(jù)《獸藥管理條例》和《獸藥注冊辦法》，在我國獸用消毒劑是完全按照獸藥進行管理[8-9]。1992年農(nóng)業(yè)部頒布了《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》，詳細介紹了獸用消毒劑對細菌、芽孢、病毒等微生物作用效果評價的試驗方法。其中獸用消毒劑效力評價的試驗方法與衛(wèi)生部頒布的《消毒劑技術(shù)規(guī)范》(2017年修訂版)基本相同。下面將針對獸用化學(xué)消毒劑(簡稱消毒劑)殺滅微生物的效力試驗所必須進行的實驗室殘留消毒劑(化學(xué)因子)的去除試驗、定性及定量殺菌試驗要求進行探討。

2 殺滅微生物效力試驗的依據(jù)

微生物殺滅試驗是評價各種用途的消毒劑對微生物的殺滅效果，是對消毒劑的殺菌能力進行驗證，《獸藥注冊辦法》規(guī)定，所有消毒劑均應(yīng)進行殺滅微生物效力試驗。

2.1 殘留消毒劑(化學(xué)因子)的去除方法和中和劑的選擇 在開展微生物殺滅試驗前，必須先按受試微生物的種類分別進行相應(yīng)的化學(xué)中和劑或其它殘留消毒劑去除法的鑒定試驗，以選出適宜的中和劑。需要說明的是試驗前細菌混懸液的制備及菌種的選擇至關(guān)重要。一般情況下，金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)作為細菌繁殖體中化膿菌的代表、綠膿桿菌(ATCC15442)作為感染最常分離的細菌繁殖體的代表；大腸桿菌(8099)作為細菌繁殖體中腸道菌的代表；枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)作為細菌芽孢的代表、白色葡萄球菌(8032)作為空氣中細菌的代表。在上述規(guī)定的菌株基礎(chǔ)上，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗特殊需要，還可增選其他菌株。在這里對細菌混懸液的制備不做詳細的介紹。

消毒劑殺菌效力評價試驗中，消毒劑與靶微生物作用終止后，消毒體系中殘留的消毒劑，可能對微生物的生長繁殖具有一定的抑制作用，從而導(dǎo)致對殺菌效果偏高的錯誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。因此在化學(xué)消毒劑的消毒試驗中，當(dāng)達到規(guī)定的消毒時間終點時，應(yīng)立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準(zhǔn)確檢測出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。殘留消毒劑的去除，可排除殘留消毒劑對微生物的抑制，從而使試驗獲得正確的結(jié)果。

2.2 去除殘留消毒劑方法的原則要求 可有效去除殘留的消毒劑；對微生物無害，不減少微生物應(yīng)有的回收量；不破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份，不影響其透明度；必須按規(guī)定方法進行鑒定試驗，并認(rèn)為合格者方可在相應(yīng)的消毒試驗中使用。

2.3 去除殘留消毒劑的方法 化學(xué)中和法，又稱中和劑法，是指在消毒劑與微生物作用到達規(guī)定時間的終點時，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)殺滅和抑制微生物的方法[10]。本方法同時含有稀釋作用效果(至少1∶1稀釋，常用1∶10稀釋)，是最普遍使用的方法。去除殘留消毒劑的方法還有吸附法、連續(xù)轉(zhuǎn)種法、稀釋法、離心沉淀法或濾膜過濾法[11]。

2.4 中和劑選擇 選擇中和劑時，要根據(jù)微生物的敏感性來選擇，既要考慮微生物對中和劑的耐受能力，同時也要考慮消毒劑有效成分的濃度。中和劑選擇試驗中應(yīng)選擇適宜濃度的消毒劑。當(dāng)消毒劑濃度過高時，中和劑無法完全中和，或者在完全中和前殘留的消毒劑已經(jīng)將微生物全部殺滅，無法正確鑒定中和劑；而當(dāng)消毒劑濃度過低時，則不足以將高濃度消毒劑全部中和。所以，在選擇一種合適的中和劑時，要從消毒劑的性質(zhì)、活性成分組成、試驗微生物、消毒試驗種類等多方面進行考慮。如含碘消毒劑常用的中和劑硫代硫酸鈉，當(dāng)含量超過0.5%時對微生物特別是細菌的生長有明顯抑制作用。而復(fù)方含碘消毒劑由于含有多種活性物質(zhì)，單一成分的中和劑可能難以滿足要求，需要采用復(fù)合中和劑，以中和所有活性物質(zhì)[12]。

3 中和劑的鑒定試驗

3.1 中和劑的鑒定試驗設(shè)計原則 通過所設(shè)各組試驗結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗用細菌及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響；在確定用何種中和劑進行鑒定試驗有困難時，可對多個中和劑進行初選以確定。所用試劑，培養(yǎng)基及其它材料都應(yīng)一致；試驗中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗中使用的最高濃度為準(zhǔn)。濃度過低，則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和；鑒定試驗中，消毒后去除殘留消毒劑組無菌生長，不能表明中和后細菌是否復(fù)蘇。此時可適當(dāng)縮短作用時間再試，但作用時間最短不得少于30秒。否則難以控制試驗的準(zhǔn)確性。若縮短作用時間后仍無菌生長，在排除其他原因的基礎(chǔ)上，可適當(dāng)下調(diào)殺菌試驗中消毒劑的濃度，再次進行中和劑鑒定試驗；同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時，所用中和劑應(yīng)按微生物種類分別進行鑒定試驗，不得取代。對細菌繁殖體的試驗，在大腸桿菌(8099)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、綠膿桿菌(ATCC15442)中任選其一進行試驗即可；對細菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)芽孢進行。當(dāng)用其特定微生物進行殺滅試驗時，均應(yīng)以該特定微生物進行中和劑的鑒定試驗；鑒定時根據(jù)所用殺菌試驗方法，使用相應(yīng)的懸液或載體定量試驗。

3.2 中和劑的鑒定試驗分組 在進行正式的中和劑的鑒定試驗前可進行中和劑的初選試驗，選中的中和劑95%以上均能通過正式的鑒定試驗。如果初選出多種中和劑，則應(yīng)依次進行正式鑒定試驗，選其中效果最好者進行殺菌試驗。

以大腸桿菌8099和金黃色葡萄球菌C83707為指示菌，中和劑擬采用硫代硫酸鈉、吐溫-80的營養(yǎng)肉湯，使用前高壓滅菌。消毒劑用無菌硬水稀釋為一定濃度，稀釋液用0.03 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液，試驗一般分六組進行(表1)。根據(jù)試驗分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進行編號。各組分別用適宜大小的無菌定量吸管按規(guī)定程序吸取或添加試劑盒試驗樣本。

表1 選擇適宜中和劑及其濃度實驗方法Tab 1 Test methods for the selection of the neutralizers and concentrations

第1組：吸取1.0 mL試驗菌懸液與4.0 mL消毒劑置于試管內(nèi)，旋渦20 s，混勻，作用至預(yù)定時間，吸此樣液0.5 mL加入含有4.5 mL稀釋液的試管內(nèi)，混勻。吸取該最終樣液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。

第2組:吸取1.0 mL試驗菌懸液與4.0 mL消毒劑置于試管內(nèi)，混勻，作用至預(yù)定時間，吸此樣液0.5 mL加入含有4.5 mL稀釋液的試管內(nèi)，旋渦20 s，混勻。作用10分鐘。吸取該最終樣液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。

第3組：吸取0.1 mL試驗菌懸液與4.9 mL中和劑試管內(nèi)，旋渦20 s，混勻，作用10分鐘。吸取該最終樣液0.5 mL，用中和劑做10倍系列稀釋，分別吸取每個倍數(shù)的稀釋液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。

第4組：吸取0.1 mL試驗菌懸液與4.9 mL中和產(chǎn)物溶液(0.4 mL消毒劑+4.5 mL中和劑，作用10 min)置試管內(nèi)，混勻，作用10分鐘。吸取該最終樣液0.5 mL，用中和劑做10倍系列稀釋，分別吸取每個倍數(shù)的稀釋液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。

第5組：吸取0.1 mL試驗菌懸液與4.9 mL中和劑試管內(nèi)，作用10分鐘。吸取該最終樣液0.5 mL，用稀釋液做10倍系列稀釋，分別吸取每個倍數(shù)的稀釋液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。

第6組：分別取中和劑、稀釋液、無菌硬水0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)。

表2 中和劑鑒定試驗合格標(biāo)準(zhǔn)對第1組與第2組菌落數(shù)的要求Tab 2 The requirements of eligibility criteria for the numbers of bacterical colonies in groupl and group 2 in the identification test of neutralizers

3.4 注意事項 試驗所分各組均有其特定意義，不得任意刪減;嚴(yán)守?zé)o菌操作，保持試液和器材的無菌，注意更換吸管，以防止沾染影響試驗的準(zhǔn)確性;在計算微生物濃度時，須考慮其稀釋倍數(shù);試驗組序應(yīng)按本規(guī)范所列排列。

4 消毒劑效果鑒定試驗

4.1 定性殺菌試驗 是測定受消毒劑作用后的樣本有無細菌生長的試驗方法，用于對消毒劑滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細菌效果的初步評價。

4.1.1 試驗步驟 將制備的菌液進行活菌計數(shù)，然后用0.03 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液稀釋，使試驗菌液的含菌量為5×105cfu/mL～5×106cfu/mL。消毒劑用無菌硬水稀釋為所需濃度待用。將中號試管10支編好號排列于試管架上。第2至第10的試管中分別加入無菌硬水2.5 mL。于第1管加入稀釋并混勻的5 mL消毒劑，由第1管取2.5 mL至第2管，旋渦混勻后，再從第2管吸2.5 mL至第3管，以此類推，直至第9管，混勻后取出2.5 mL棄去，第10管不加消毒液作為對照。以每半分鐘加1管的速度將菌液2.5 mL置于每管內(nèi)，使每管含菌量為106cfu/mL，旋渦混勻。在室溫條件下(20 ℃左右)作用5、10、15、30、60 min，至規(guī)定時間后，每管各取0.5 mL加入含4.5 mL中和劑的試管中旋渦混勻，中和10 min，再吸取出最終反應(yīng)液0.5 mL加入4.5 mL液體培養(yǎng)基試管中。將接種最終反應(yīng)液的液體培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況，若發(fā)生渾濁即表示有細菌生長。必要時，可移植到固體培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)，或進行涂片染色鏡檢，以判斷生長的是否為試驗菌，以排除污染。若肉湯不變渾濁，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至第七天，若仍不渾濁方可判為無菌生長。

4.1.2 結(jié)果判定 以無菌生長管消毒液的最低濃度為最低殺菌有效濃度，以無菌生長管的最短消毒時間為該濃度殺菌最快有效時間。

4.2 定量殺菌試驗 在試驗室內(nèi)測定消毒劑殺滅懸液中或載體上細菌繁殖體和細菌芽孢所需劑量，作為制定實用消毒劑量的參考。以殺滅率表示結(jié)果，用于對消毒劑殺滅效果的評價。

制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和枯草桿菌黑色變種芽孢懸液或菌片。此外，根據(jù)消毒藥物特定用途或試驗特殊需要，準(zhǔn)備其他菌種的懸液或菌片。

消毒劑溶液除有特殊規(guī)定者外，應(yīng)使用無菌硬水配制。消毒劑溶液濃度應(yīng)以所含有效成份為準(zhǔn)。例如，含氯消毒劑以所含有效氯濃度為準(zhǔn)，碘伏以所含有效碘為準(zhǔn)，過氧乙酸以所含過氧乙酸量為準(zhǔn)，復(fù)方消毒劑濃度以主要殺菌有效成分的量為準(zhǔn)。各組消毒劑溶液有效成分濃度的計算，應(yīng)以菌藥混合液中有效成分的最終濃度為準(zhǔn)。

4.2.1 試驗步驟 將制備的菌液進行活菌計數(shù)，然后用0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋成含菌106～107個/mL的試驗菌液。消毒劑用無菌硬水稀釋至所需濃度。吸取0.5 mL試驗菌液加到4.5 mL待測濃度的消毒劑溶液中。置20 ℃水浴中5 min。立即吸取上述菌藥混合液0.5 mL，加入4.5 mL中和劑試管中旋渦混勻。中和10分鐘后，取最終反應(yīng)液0.1 mL涂布于瓊脂平板，置37 ℃培養(yǎng)計數(shù)，進行活菌計數(shù)，計算殺菌率和殺菌指數(shù)。以0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖液替代消毒液，同時進行上述各步驟，作為對照組。

4.2.2 結(jié)果判斷 殺菌率的計算：根據(jù)活菌計數(shù)的結(jié)果，計算殺菌率(Pt)。消毒t時的殺菌率(Pt)=【(N0-Nt)/N0】×100%，式中N0為消毒前或?qū)φ战M的活菌數(shù)。Nt為消毒后或?qū)嶒灲M的活菌數(shù)。殺滅指數(shù)的計算：殺滅指數(shù)(KI)=N0/Nt。

4.2.3 注意事項 在殺菌試驗中，每次均應(yīng)設(shè)置陽性對照。試驗中所使用的中和劑、稀釋液和培養(yǎng)基等，各批次均應(yīng)進行無菌檢查，發(fā)現(xiàn)有菌生長，則全部試驗需換用未污染試劑或培養(yǎng)基重做。懸液定量殺菌試驗時，有機干擾物質(zhì)一般采用3%(g/100 mL)牛血清白蛋白貯存溶液，取0.5 mL加入到消毒體系中(稀釋10倍)，進行消毒試驗。

4.2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 目的為試驗消毒效能，殺菌率應(yīng)達99.9%以上，當(dāng)?shù)陀诖酥笜?biāo)時，則應(yīng)提高消毒劑的濃度或延長作用時間。

5 討論與結(jié)論

定量殺菌試驗的消毒劑濃度設(shè)置是建立在定性殺菌試驗的基礎(chǔ)上的。由定性殺菌試驗結(jié)果，可得知將細菌或者芽孢完全殺滅的濃度范圍，也就是最低殺菌濃度與其后一個濃度之間。再在這個范圍內(nèi)設(shè)置濃度梯度，做定量殺菌試驗，將目標(biāo)濃度確定，準(zhǔn)確找到殺菌率在99.9%以上的那個最低濃度[13]。但是在試驗過程中發(fā)現(xiàn)細菌數(shù)量變化對于結(jié)果的影響較大，為了保證結(jié)果準(zhǔn)確性，需進行多次重復(fù)試驗，并棄去誤差率(平板間、稀釋度間)超過10%的結(jié)果，選擇可信結(jié)果再求其平均數(shù)，為最終結(jié)果[14]。