抗大片形吸蟲Cat L1單克隆抗體的制備及其雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

王樂銘，王瑜瑞，曾子軒，饒國順，吳正姣，靳緯坤，王冬英

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004)

大片形吸蟲(Fasciolagigantica，F(xiàn)g)是片形吸蟲病(fascioliasis)的病原之一，屬于食源性人獸共患寄生蟲。主要宿主是地處熱帶及亞熱帶地區(qū)的奶牛、水牛、山羊等家畜[1-2]。據(jù)估計，全世界畜牧業(yè)每年因片形吸蟲病造成的損失超過32億美元[3]。另外在全球范圍內(nèi)，已有至少240萬人感染片形吸蟲病，并同時威脅著1.8億人的健康安全，被世界衛(wèi)生組織認定為最受忽視的熱帶病之一[4-5]。針對該疾病的診斷主要包括臨床診斷、分子生物學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷，其中免疫學(xué)抗原診斷因具備靈敏性高、特異性強、低成本等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于該疾病檢測的開發(fā)研究中[5-6]。Abdolahi等[7]針對肝片形吸蟲排泄-分泌產(chǎn)物(ESP)抗原制備特異性單克隆抗體和多克隆抗體，并建立了針對機體糞便中片形吸蟲抗原的ELISA檢測方法。經(jīng)驗證，該方法陽性樣本檢出率為90%，特異性達89.7%，具備應(yīng)用于臨床片形吸蟲病診斷要求。Anuracpreeda等[8]針對大片形吸蟲脂肪酸結(jié)合蛋白構(gòu)建了特異性單克隆抗體及ELISA抗原檢測方法，在符合基礎(chǔ)診斷要求的同時，在早期診斷方面也呈現(xiàn)出較好的潛力。

組織蛋白酶L1(cathepsin L1,Cat L1) 是一種半胱氨酸蛋白酶，在許多寄生蟲體內(nèi)均有表達，主要由幼蟲和成蟲的消化道真皮上皮細胞分泌[9]，在蟲體寄生定植等過程中起到重要的作用[10-13]。此外，Cat L1也被證明可抑制機體的Th1型免疫反應(yīng)，從而提高外界病原感染風(fēng)險[14-15]。王曉旭[16]成功對肝片形吸蟲Cat L1進行了原核重組表達，獲得了rFhCat L1并建立了間接ELISA診斷方法，經(jīng)檢測該方法特異性為97.3%，敏感性為94.0%，最早可以檢出人工感染肝片形吸蟲28 d后的綿羊血清。證明Cat L1在片形吸蟲病診斷方面是具備相關(guān)潛力的。

近年來關(guān)于片形吸蟲免疫與防治的研究一直在不斷深化，但是現(xiàn)有的商業(yè)化診斷試劑盒存在成本較高、功能不夠全面的缺點，且國內(nèi)尚未有商品化試劑盒生產(chǎn)。本研究以前期所制備的rFgCat L1原核表達蛋白及抗rFgCat L1多克隆抗體[17]為基礎(chǔ)，制備抗rFgCat L1單克隆抗體并構(gòu)建大片形吸蟲病雙抗體夾心ELISA檢測方法，以期為開發(fā)大片形吸蟲病快速抗原檢測診斷試劑盒提供重要的理論依據(jù)及物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司；SP2/0細胞株、rFgCat L1蛋白、抗rFgCat L1多克隆抗體：廣西大學(xué)動物科技學(xué)院動物寄生蟲疾病與免疫學(xué)實驗室制備，液氮中保存；試驗所用血清樣本均采自廣西地區(qū)某養(yǎng)殖廠。

細胞融合試劑盒購自GENMED公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT均購自Biological Industry公司；青-鏈霉素混合液(雙抗)購自Solarbio公司；山羊抗鼠IgG抗體亞型鑒定試劑盒購自Southern Biotech公司；特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)酶標二抗均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司公司；Protein L 抗體純化試劑盒購自金斯瑞生物科技有限公司。倒置顯微鏡(AE31)購自Nikon公司；超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購自蘇凈設(shè)備有限公司；CO2培養(yǎng)箱(3111)購自Forma Scientific公司；電熱恒溫水箱HH-S6型購自北京長風(fēng)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)購自上海躍進醫(yī)療器械公司；-80 ℃超低溫冰箱(DW-HL778)購自Forma公司；細胞計數(shù)儀(TC20)購自Bio-Rad公司；液氮罐(XK02-201)購自四川亞西橡塑機器有限公司。

1.2 小鼠免疫

調(diào)整rFgCat L1蛋白濃度為1 mg/mL，分4次對5只BALB/c小鼠進行免疫。前3次免疫采用50 μL蛋白液與弗氏佐劑等體積混合，皮下多點注射免疫。第3次免疫結(jié)束7 d后，尾靜脈采小鼠血清。通過間接ELISA法測定血清中抗體效價，未免疫小鼠血清作為陰性對照，對抗體反應(yīng)最高的小鼠采用100 μL抗原蛋白腹腔注射進行沖擊免疫。

1.3 雜交瘤細胞株構(gòu)建

提前24 h制備飼養(yǎng)層細胞，用HAT培養(yǎng)基重懸，按104/孔平鋪在96孔板中；在超凈臺內(nèi)分離小鼠脾細胞，采用細胞篩研磨并用含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸計數(shù)。將SP2/0細胞及小鼠脾細胞按1∶5的比例(SP2/0：2×106個，小鼠脾細胞：1×107個)加入至50 mL離心管中，300×g離心10 min，洗滌3次；加入37 ℃預(yù)熱細胞融合劑，常溫靜置1 min，加入終止液，300×g離心10 min，洗滌3次；吸棄上清，利用2% HAT培養(yǎng)基重懸細胞，加至預(yù)先制備含飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細胞融合后培養(yǎng)24 h后，觀察細胞狀態(tài)；待細胞團達肉眼可見后取上清，采用間接ELISA法進行鑒定，SP2/0細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照；對陽性孔進行放大培養(yǎng)，并對強陽性孔采用有限稀釋法進行亞克隆，期間及時凍存細胞；亞克隆3次以后，選取陽性值較高且穩(wěn)定的雜交瘤細胞株為最終的陽性雜交瘤細胞株。

1.4 單克隆抗體制備及鑒定

1.4.1 單克隆抗體制備 準備6～8周齡BALB/c小鼠20只，注射前提前1周腹腔注射滅菌液體石蠟，500 μL/只；將所制備陽性雜交瘤細胞株按1×106/只注入小鼠腹腔；14 d后，待小鼠腹部明顯膨大，精神狀態(tài)不佳時開始逐步抽取腹水；用Protein L 抗體純化試劑盒對小鼠腹水中抗rFgCat L1單克隆抗體進行純化，并進行SDS-PAGE電泳。

1.4.2 單克隆抗體效價鑒定 將雜交瘤細胞株上清(按1∶2、1∶22、1∶23至1∶212稀釋)及小鼠腹水(按1∶10、1∶102、1∶103至1∶108稀釋)通過間接ELISA法檢測抗體效價。

1.4.3 單克隆抗體亞型Western blotting鑒定 利用Goat Anti-Mouse Ig抗體亞型鑒定試劑盒鑒定抗體亞型。具體步驟：PBS稀釋rFgCat L1至濃度為2 μg/mL，每孔100 μL加入ELISA酶標板中，4 ℃孵育12 h；PBST洗滌3次，加入1% BSA，100 μL/孔，室溫下放置1 h，阻斷自由結(jié)合位點；PBST洗滌3次，每孔加入100 μL雜交瘤細胞上清，室溫下輕搖孵育1 h或4 ℃過夜；PBST洗滌3次，將檢測抗體，用1% BSA按1∶250～1∶500稀釋，100 μL/孔，輕搖孵育1 h；PBST洗滌5次，加入顯色液，室溫靜置20 min；酶標儀讀取各孔D450 nm值。

1.4.4 單克隆抗體特異性鑒定 采用常規(guī)Western blotting法驗證抗rFgCat L1單克隆抗體特異性：將FgESP、前后盤吸蟲抗原、伊式錐蟲抗原、弓形蟲抗原進行SDS-PAGE電泳；一抗為抗rFgCat L1雜交瘤細胞上清，二抗為兔抗鼠-IgG酶標二抗；通過Image Lab軟件查看結(jié)果。

1.4.5 單克隆抗體識別抗原表位鑒定 參考萬文徽[18]方法進行疊加ELISA試驗，對7G6及5D5抗原識別表位進行鑒定。具體方案為：按2 μg/mL 濃度稀釋天然FgESP包被酶標板；分別孵育2株單克隆抗體，所測得D450 nm值記為A1及A2；后將2株抗體等比例混合后孵育，所測D450 nm值記為A12；根據(jù)公式：AI(%)=(A12-A1)/A2×100%；AI(%)>30%,證明2株抗體具有相加作用，識別不同抗原表位。AI(%)<30%，證明2株抗體呈競爭作用，識別相同表位。

1.5 雙抗體夾心ELISA方法的構(gòu)建

1.5.1 單抗包被濃度及抗rFgCat L1多克隆抗體稀釋度篩選 采用包被緩沖液稀釋單克隆抗體，分別用 0.4、2、10和50 μg/mL共4個濃度的單抗包被96孔酶標板，包被96孔板；37 ℃孵育2.5 h，4 ℃過夜；采用PBST洗滌3次，加入封閉液，37 ℃孵育2 h；PBST洗滌3次，加入陰/陽性對照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌4次，抗rFgCat L1多克隆抗體[17]按1.56、3.12、6.25、12.5和25 μg/mL稀釋，棋盤法加樣，37 ℃孵育1 h；加入顯色液37 ℃孵育25 min；加入終止液，50 μL/孔，用酶標儀測定D450 nm值；計算陰性/陽性(P/N)值，最大值所對應(yīng)條件為最佳檢測條件。

1.5.2 酶標二抗最佳稀釋度篩選 步驟同1.5.1，將山羊抗兔IgG(H+L)酶標二抗按1∶125、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000和1∶8 000倍比稀釋，計算P/N值，最大值所對應(yīng)條件為最佳檢測條件。

1.5.3 最適封閉液篩選 步驟同1.5.1，用10%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、5% BSA和1%明膠分別進行封閉，計算P/N值，最大值所對應(yīng)的為最佳封閉液。

1.5.4 顯色時間篩選 步驟同1.5.1，加入顯色液，37 ℃孵育10、15、20、25、30和60 min。 計算P/N最大值所對應(yīng)時間為最佳顯色時間。

1.6 雙抗體夾心ELISA方法的驗證

1.6.1 敏感性 步驟同1.5.1，將rFgCat L1從10 μg/mL倍比稀釋至0.078 μg/mL作陽性樣品，PBS作為陰性對照。通過所構(gòu)建雙抗體夾心ELISA法檢測各濃度下的D450 nm值并計算P/N值(P/N>2.1即為陽性)，得到最低抗原檢測濃度，驗證該方法敏感性。

1.6.2 特異性 步驟同1.5.1，利用所構(gòu)建雙抗體夾心ELISA法對rFgCat L1、FgESP抗原、前后盤吸蟲ESP抗原、伊氏錐蟲體表蛋白抗原、弓形蟲蟲體抗原進行檢測，并以PBS為陰性對照，P/N>2.1判定為陽性，驗證方法特異性。

1.6.4 臨床樣本驗證 步驟方法同1.5.1，利用所構(gòu)建雙抗體夾心ELISA法檢測本實驗室保存的47份山羊大片形吸蟲病陽性血清及47份奶牛大片形吸蟲病陽性血清的陽性符合率。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠免疫結(jié)果

終免后小鼠狀態(tài)良好，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。三免后小鼠血清間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，4只小鼠血清抗體效價均>104，達到細胞融合要求。 四免后剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟組織較未免疫小鼠有明顯增大。

2.2 陽性雜交瘤細胞株構(gòu)建

雜交瘤細胞株培養(yǎng)25 d時肉眼即可觀察到細胞團，細胞長勢良好，融合細胞孔達116個(總孔數(shù)為384個)；間接ELISA法檢測細胞上清結(jié)果顯示：共有8株雜交瘤細胞上清呈陽性反應(yīng)，其中5D5及7G6呈現(xiàn)強陽性反應(yīng)(表1)；亞克隆培養(yǎng)結(jié)果顯示，5D5及7G6 2株細胞上清陽性反應(yīng)穩(wěn)定，可進行擴大培養(yǎng)并凍存(表2)；5D5及7G6經(jīng)傳代培養(yǎng)和凍存后，細胞上清檢測陽性值趨于穩(wěn)定(表3)，可用于大量制備抗體。

表1 rFgCat L1陽性克隆篩選結(jié)果

表2 連續(xù)亞克隆后雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定性(D450 nm值)

表3 連續(xù)傳代后雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定性(D450 nm值)

2.3 單克隆抗體制備及鑒定

2.3.1 抗體制備結(jié)果 小鼠腹水純化后，可見除抗體外無明顯雜蛋白，抗體重鏈在50 ku左右，輕鏈約為20 ku(圖1)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1，純化后5D5；2，純化后7G6

2.3.2 單克隆抗體效價測定結(jié)果 間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，5D5和7G6 2株細胞上清抗體效價分別達到29和210；5D5小鼠腹水抗體效價達107，7G6小鼠腹水抗體效價可達108(表4)。

表4 間接ELISA測定抗體敏感性結(jié)果

2.3.3 抗體亞型鑒定結(jié)果 單克隆抗體鑒定試劑盒鑒定結(jié)果顯示，5D5和7G6 2株細胞制備的抗體的亞型均為IgG1型，輕鏈均為Kappa型(圖2)。

圖2 單克隆抗體亞型鑒定

2.3.4 單克隆抗體特異性檢測結(jié)果 Western blotting檢測結(jié)果顯示，2株單抗均可與天然FgESP抗原反應(yīng)，而不與前后盤吸蟲抗原、伊式錐蟲抗原、弓形蟲抗原反應(yīng)(圖3)。

1,大片吸蟲分泌-排泄產(chǎn)物；2，前后盤吸蟲抗原；3，伊氏錐蟲抗原；4，弓形蟲抗原

2.3.5 單克隆抗體識別抗原表位鑒定結(jié)果 間接ELISA法檢測5D5及7G6的抗原識別表位結(jié)果顯示，A12<30%，5D5和7G6識別相同表位。根據(jù)結(jié)果2.3.2可知，7G6抗體效價高于5D5，因此確定用7G6作為捕獲抗體、抗rFgCat L1多克隆抗體作為檢測抗體進行大片形吸蟲病雙抗體夾心ELISA法的構(gòu)建。

2.4 雙抗體夾心ELISA方法構(gòu)建

2.4.1 7G6包被濃度及抗rFgCat L1多克隆抗體稀釋度的篩選結(jié)果 棋盤法篩選7G6抗體包被濃度及抗rFgCat L1多克隆抗體檢測濃度結(jié)果顯示，當7G6包被濃度在2 μg/mL、抗rFgCat L1多克隆抗體濃度為25 μg/mL時，所得結(jié)果P/N值最高，且此時陰性對照值<0.1，有利于更好地區(qū)分陰陽性(表5)。因此，以此結(jié)果為后續(xù)檢測條件。

表5 7G6和抗rFgCat L1多克隆抗體最佳稀釋度

2.4.2 酶標二抗稀釋度篩選結(jié)果 通過倍比稀釋山羊抗兔IgG(H+L)酶標二抗，結(jié)果顯示，當稀釋度為1∶4 000時，P/N值最高(表6)。因此，選擇1∶4 000為最佳稀釋度。

表6 酶標二抗稀釋度選擇

2.4.3 封閉液篩選結(jié)果 經(jīng)對比5% BSA、5%脫脂奶粉、10%脫脂奶粉及1%明膠的包被效果，結(jié)果顯示5%脫脂奶粉作為封閉液時P/N值最高，此條件下本底值較低，更易區(qū)分陰陽性，所以選擇5%脫脂奶粉為最終封閉液(表7)。

表7 最佳封閉液選擇

2.4.4 顯色時間篩選結(jié)果 孵育不同時間的結(jié)果表明，在孵育20 min時，D450 nm值開始趨于穩(wěn)定，且25 min時P/N值達到最高(圖4)。因此，確定最終的底物顯色時間為25 min。

圖4 最佳顯色時間測定

2.5 雙抗體夾心ELISA方法的驗證

2.5.1 敏感性檢測結(jié)果 通過梯度稀釋rFgCat L1，并以 PBS 做陰性對照驗證雙抗體夾心ELISA方法的敏感性， 結(jié)果顯示： 雙抗體夾心ELISA方法所能測的最低抗原濃度為0.625 μg/mL(表8)。

表8 敏感性檢測結(jié)果

2.5.2 特異性檢測結(jié)果 驗證結(jié)果顯示，所構(gòu)建雙抗體夾心ELISA方法檢測FgESP、前后盤吸蟲抗原、伊氏錐蟲抗原以及弓形蟲抗原的P/N值分別為4.27、0.85、1.33和1.26，證明該方法具備較好的特異性。

2.5.4 臨床樣本驗證結(jié)果 通過所構(gòu)建雙抗體夾心ELISA方法對實驗室所保留的47份山羊及47份奶牛感染性血清樣本進行抗原檢測，結(jié)果顯示山羊血清共檢出抗原陽性37份，抗原檢出率為78.7%；奶牛血清共檢出抗原陽性34份，抗原檢出率率為72.3%(表9)。

3 討 論

免疫學(xué)抗原診斷的關(guān)鍵在于需要制備具備高特異性及敏感性的單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)發(fā)明于20世紀70年代，由于其針對免疫疾病方面檢測的優(yōu)越性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病診斷及治療等多個領(lǐng)域[19]。為篩選優(yōu)質(zhì)抗體，本試驗在亞克隆階段采用傳統(tǒng)有限稀釋法培養(yǎng)。任瑞敏等[20]利用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞。半固體培養(yǎng)基優(yōu)勢在于同一個孔中的不同細胞株不易混合，在亞克隆階段，可借助顯微鏡從細胞團中挑出單個細胞，減少了傳統(tǒng)細胞稀釋的工作量，提高篩查效率。但同時增加了細胞污染的幾率。其次，在細胞培養(yǎng)過程中，由于固體培養(yǎng)基所含水分較少，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中加速了液體流失的速度，若不能每天及時補充水分，細胞可因缺水而死亡[21]。而傳統(tǒng)的有限稀釋法在亞克隆階段雖然需要更大的工作量，但是對于細胞的培養(yǎng)更加穩(wěn)妥及安全。多項報道[22-24]表明，利用有限稀釋法可成功獲得穩(wěn)定的陽性雜交瘤細胞株。本試驗利用該方法成功篩選出具備高效價的強陽性株5D5和7G6。經(jīng)驗證，2株抗體效價可達29和210，對于后續(xù)所構(gòu)建方法的敏感性是具備優(yōu)勢的。李雪等[25]利用抗FgESP復(fù)合抗原單克隆抗體7D1、7D2構(gòu)建了大片形吸蟲雙抗體夾心ELISA方法，結(jié)果顯示該方法可特異性識別大片形吸蟲抗原，不與胰闊盤吸蟲抗原、前后盤吸蟲抗原、伊氏錐蟲抗原及弓形蟲抗原反應(yīng)。而本實驗所構(gòu)建單克隆抗體針對的是單一蛋白，理論上更具特異性。經(jīng)驗證2株抗體均可特異性結(jié)合大片形吸蟲ESP抗原，具備作為檢測抗體的潛力。但在對抗體的識別表位鑒定試驗中發(fā)現(xiàn)，2株單克隆抗體本身存在識別抗原位點方面存在競爭關(guān)系，同時為了使所構(gòu)建方法檢測靈敏度更高，本試驗未選擇雙單克隆抗體夾心，而是選擇實驗室前期所構(gòu)建的抗FgCat L1特異性多克隆抗體與單克隆抗體結(jié)合的方式，使得該方法可同時兼具敏感性及特異性的優(yōu)點。李超等[26]利用多克隆抗體及單克隆抗體結(jié)合的方法，構(gòu)建雙抗夾心ELISA法，結(jié)果顯示該方法對檢測牛γ-干擾素呈現(xiàn)出理想的效果。

利用7G6和rFgCat L1多克隆抗體所構(gòu)建的雙抗體ELISA檢測方法，對47份山羊及47份奶牛大片吸吸蟲感染性樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)，抗原檢出率達78.7%及72.3%，與間接ELISA法檢測結(jié)果有所出入，原因可能是通過間接ELISA法檢測抗體判定疾病的發(fā)生不易區(qū)分既往感染及當癥感染，易出現(xiàn)假陽性，而本方法檢測的目的分子為循環(huán)抗原，對于疾病的確診及病程的判斷更具敏感性[25]。后續(xù)試驗除利用血清樣品外，可同時收集機體糞便、乳液和唾液等臨床樣本，進一步驗證其檢測效果，為商業(yè)化檢測試劑盒的研制提供新的思路及依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究成功制備抗rFgCat L1特異性單克隆抗體5D5和7G6，并結(jié)合rFgCat L1多克隆抗體構(gòu)建了大片形吸蟲病雙抗體夾心ELISA檢測方法。經(jīng)驗證，該方法抗原最低識別濃度為0.625 μg/mL，可特異性識別FgESP抗原；另外，該方法對山羊及奶牛大片形吸蟲病陽性血清的抗原檢出率為78.7%及72.3%，說明其具備構(gòu)建大片形吸蟲病商業(yè)化試劑盒的潛力。