DHEA誘導(dǎo)小鼠PCOS模型過程中性激素的變化規(guī)律

翁 鈺，王 琴，趙玉芬，于 凱，郝紹瑜，于泊洋，杜晨光，蘇布登格日勒，李海軍

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種高度異質(zhì)性疾病，也是育齡女性最常見的一種生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病。PCOS被定義為卵巢功能異常綜合征，其最顯著的臨床表現(xiàn)為卵泡發(fā)育障礙、稀發(fā)排卵或不排卵、高雄激素表現(xiàn)和卵巢多囊性改變[1]，同時(shí)也與肥胖、2型糖尿病和心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)[2]。PCOS造成的排卵障礙機(jī)制一直是生殖醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。盡管PCOS病因迄今仍沒有完全闡明，但是當(dāng)前理論公認(rèn)，雄激素異常升高是PCOS病理診斷中最為恒定的特征，也是造成患者卵泡發(fā)育阻滯的核心因素[3-4]。值得注意的是，雄激素對(duì)于正常卵巢卵泡發(fā)育也至關(guān)重要。研究表明，睪酮可通過刺激卵泡刺激素受體表達(dá)及提高顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡刺激素的敏感性，成為發(fā)情周期中正常卵泡募集與優(yōu)勢(shì)卵泡選擇發(fā)生的一種關(guān)鍵性調(diào)控因素[5]。在此過程中，睪酮作為底物，可被芳香化酶催化為雌二醇[6]，后者不僅通過刺激卵泡顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞的增殖分化，參與對(duì)正常卵泡發(fā)育的調(diào)控過程，而且優(yōu)勢(shì)卵泡合成大量雌二醇也是誘導(dǎo)排卵前促黃體生成素峰出現(xiàn)與排卵發(fā)生的必要前提[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清睪酮水平顯著高于常人，且伴隨著雌二醇水平的顯著下降與排卵失敗[8-9]。因此，從性激素在PCOS發(fā)生過程中的階段性變化入手展開研究，可能是探明其發(fā)病機(jī)理的一個(gè)新思路。

構(gòu)建小鼠疾病模型是研究PCOS發(fā)病機(jī)制的較佳方式[10]。在眾多建模方式中，脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)最為常用，其作為合成雄激素的前體物質(zhì)，通過向未性成熟雌鼠長(zhǎng)期注射可模擬生成大量的囊性卵泡及造成較高的血清雄激素水平，進(jìn)而產(chǎn)生PCOS樣小鼠模型[11]。在建模過程中，DHEA常溶解在200 μL油性溶劑中，但對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間小鼠皮下注射而言，這種溶解方式可能會(huì)出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)藥物溶解不完全或因注射體積過大而易造成藥物外滲與小鼠應(yīng)激的情況。因此，本研究對(duì)現(xiàn)有DHEA建模方式稍作改進(jìn)，將DHEA(6 mg/100 g)溶解在0.09 mL芝麻油與0.01 mL 95%乙醇混合的溶劑中，嘗試構(gòu)建3周齡昆明白小鼠的PCOS模型，并對(duì)該P(yáng)COS模型構(gòu)建過程中的血清雌二醇和睪酮瞬時(shí)水平進(jìn)行測(cè)定，以期從性激素相應(yīng)變化角度來重新審視PCOS發(fā)病過程。

1 材料與方法

1.1 材料

使用90只3周齡SPF級(jí)昆明白小鼠進(jìn)行建模，在12/12 h循環(huán)的光照條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過程遵循內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科研倫理要求(批準(zhǔn)編號(hào)：NND2021025)。

1.2 主要試劑及儀器

DHEA購(gòu)自源葉生物公司；結(jié)晶紫粉末和多聚甲醛粉末均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；睪酮ELISA試劑盒購(gòu)自Cayman Chemical公司；雌二醇ELISA試劑盒購(gòu)自Enzo公司；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純商品。

Nikon YS100成像系統(tǒng)購(gòu)自Nikon公司；CM1900型石蠟切片機(jī)購(gòu)自Leica公司；CYT-100多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 PCOS模型構(gòu)建 90只昆明白小鼠被隨機(jī)均分為3組：對(duì)照組、空載組(Vehicle)與DHEA組(DHEA)，對(duì)照組注射0.1 mL的生理鹽水；空載組僅注射0.09 mL芝麻油與0.01 mL 95%乙醇的混合溶劑；處理組按體重計(jì)算所需注射的DHEA劑量，并將其溶解于等體積的芝麻油+95%乙醇混合的溶劑中。所有組別均連續(xù)皮下給藥20 d。注射后使用75%酒精進(jìn)行皮膚表面的消毒，隨后放回到籠中，自由活動(dòng)和采食。建模過程中的昆明白小鼠體重增量數(shù)據(jù)來自于建模第20與0天的差值(n=9)。

1.3.2 性周期鑒定 DHEA連續(xù)注射20 d后，于每天上午11:00-12:00使用20～50 μL生理鹽水對(duì)昆明白小鼠的陰道進(jìn)行沖洗并收集陰道上皮細(xì)胞，共持續(xù)8 d。將陰道上皮細(xì)胞涂抹在防脫載玻片上用95%乙醇固定10 min，使用0.1%結(jié)晶紫染色1 min。待玻片自然風(fēng)干后，使用Nikon YS100成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。根據(jù)陰道上皮細(xì)胞種類(是否角質(zhì)化)、白細(xì)胞占比(主要為淋巴細(xì)胞)評(píng)估昆明白小鼠所處的性周期階段[12]。

1.3.3 HE染色 使用4%多聚甲醛固定24 h后，自來水沖洗過夜。經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋與切片等處理，獲取厚度為5 μm的組織切片。利用HE染色對(duì)卵巢組織學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并對(duì)昆明白小鼠卵巢是否產(chǎn)生PCOS樣癥狀加以鑒定。

1.3.4 ELISA測(cè)定血清睪酮和雌二醇濃度 經(jīng)眼球采血收集昆明白小鼠血液于非抗凝管中，室溫放置2 h，4 ℃過夜。4 ℃、3 000 r/min多次離心分離血清，隨后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血清睪酮和雌二醇濃度的測(cè)定參照試劑盒說明書進(jìn)行。使用多功能酶標(biāo)儀分別在412和405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)睪酮和雌二醇樣本D值。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別代入待測(cè)樣本D值以計(jì)算對(duì)應(yīng)濃度。其中，睪酮數(shù)據(jù)來自DHEA處理的第5、10、15、20及21天(n=45)，而雌二醇數(shù)據(jù)來自DHEA處理的第5、10、15及20天(n=36)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)組之間的對(duì)比使用方差分析并配合Tukey檢驗(yàn)共同進(jìn)行。 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 昆明白小鼠性周期鑒定

利用結(jié)晶紫染液對(duì)昆明白小鼠陰道黏液涂片進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，在發(fā)情前期，陰道上皮細(xì)胞以有核和角質(zhì)化上皮為主(圖1A)；發(fā)情期階段則只會(huì)出現(xiàn)角質(zhì)化的上皮細(xì)胞(圖1B)；發(fā)情后期則存在有核、無核上皮細(xì)胞及一定數(shù)目的淋巴細(xì)胞(圖1C)；間情期則以大量的淋巴細(xì)胞為主，同時(shí)散在分布有核和無核上皮細(xì)胞(圖1D)。

①A，發(fā)情前期；B，發(fā)情期；C，發(fā)情后期；D，間情期。②NEC，有核上皮細(xì)胞；CEC，角質(zhì)化上皮細(xì)胞；L，淋巴細(xì)胞

2.2 注射DHEA對(duì)昆明白小鼠正常性周期的影響

對(duì)照組和空載組均在建模完成后的8 d內(nèi)經(jīng)歷了2個(gè)完整的性周期循環(huán)(圖2A、2B)，而DHEA組則長(zhǎng)時(shí)間處于發(fā)情或發(fā)情后期，即產(chǎn)生了性周期停滯現(xiàn)象(圖2C)。值得注意的是，雖然在昆明白小鼠處理的20 d內(nèi)空載組體重增量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但與DHEA組相比并無顯著變化(P>0.05，圖3)。鑒于芝麻油注射后昆明白小鼠性周期依然正常運(yùn)轉(zhuǎn)，提示DHEA所引起的性周期變化與芝麻油引起的肥胖無關(guān)，說明注射DHEA使昆明白小鼠出現(xiàn)了PCOS樣的性周期停滯現(xiàn)象，昆明白小鼠的生殖內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)發(fā)生了顯著改變。

①A，對(duì)照組；B，空載組；C，DHEA組。②P，發(fā)情前期；E，發(fā)情期；M，發(fā)情后期；D，間情期

*，差異顯著。圖5～7同

2.3 DHEA對(duì)昆明白小鼠卵泡發(fā)育及血清睪酮水平的影響

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和空載組卵巢中卵泡形態(tài)正常，且存在部分黃體細(xì)胞(圖4A、4B)；DHEA組卵巢組織切片中出現(xiàn)了帶有巨大空腔的囊狀卵泡，且未見到黃體組織(圖4C)。ELISA結(jié)果顯示，隨著建模的進(jìn)行，0 d對(duì)照組與21 d對(duì)照組之間的血清睪酮水平無顯著差異(P>0.05)；建模結(jié)束后，21 d對(duì)照組和21 d空載組昆明白小鼠體內(nèi)血清睪酮水平無顯著差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，DHEA組血清睪酮水平顯著升高(P<0.05)(圖5)。說明昆明白小鼠PCOS模型構(gòu)建成功。

①A，對(duì)照組；B，空載組；C，DHEA組。②TCL，顆粒細(xì)胞層；GCL，顆粒細(xì)胞層；O，卵母細(xì)胞；L，黃體；CF，囊狀卵泡

圖5 昆明白小鼠血清睪酮水平測(cè)定

2.4 PCOS建模過程中血清睪酮和雌二醇濃度水平變化

睪酮水平測(cè)定結(jié)果顯示，自DHEA處理的第5天起，DHEA組昆明白小鼠體內(nèi)血清睪酮水平顯著升高，且于第15天達(dá)到峰值，并持續(xù)至第20天(P<0.05，圖6)。雌二醇水平檢測(cè)結(jié)果顯示，DHEA處理10 d后，血清雌二醇水平顯著升高(P<0.05)，為同時(shí)期對(duì)照組的19.723倍；第15天時(shí)血清雌二醇水平仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；但在建模的第20天，DHEA組血清雌二醇水平開始下降并低于同時(shí)期對(duì)照組，但無顯著差異(P>0.05)(圖7)。

圖6 PCOS模型構(gòu)建過程中昆明白小鼠血清睪酮水平變化

圖7 PCOS模型構(gòu)建過程中昆明白小鼠血清雌二醇水平變化

3 討 論

PCOS患者常伴隨著高雄激素水平和較低的雌二醇水平，但目前對(duì)于PCOS發(fā)生過程中睪酮和雌二醇的變化卻鮮有研究。本研究在對(duì)常規(guī)DHEA溶解方式進(jìn)行改良的基礎(chǔ)上，選擇昆明白小鼠進(jìn)行DHEA注射；隨后對(duì)各試驗(yàn)組進(jìn)行性周期鑒定、卵巢組織形態(tài)觀察及血清睪酮水平測(cè)定，以判定PCOS模型構(gòu)建是否成功，并在此基礎(chǔ)上探討了PCOS建模過程中的睪酮與雌二醇水平的變化規(guī)律。

對(duì)于小鼠而言，除非處于懷孕、假孕或性成熟前，其發(fā)情周期通常包括4個(gè)階段：發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期，并以每4～5 d為一次循環(huán)[12]?，F(xiàn)已證明，PCOS小鼠模型的特征之一為性周期的停滯與異常[13]。 本試驗(yàn)將常規(guī)200 μL芝麻油注射改為100 μL混合溶劑(90 μL芝麻油+10 μL 95%乙醇)，以便更好地溶解DHEA并減少試驗(yàn)動(dòng)物的皮下注射應(yīng)激。與對(duì)照組相比，DHEA注射能夠成功使昆明白小鼠性周期停滯在發(fā)情或發(fā)情后期，且長(zhǎng)期注射DHEA(20 d)沒有影響到其體重指標(biāo)。PCOS的另一個(gè)典型特征為卵巢的囊泡樣變化[11]。通過20 d的DHEA處理，昆明白小鼠卵巢呈現(xiàn)出比對(duì)照組更大的囊泡樣卵泡，提示其卵巢發(fā)生PCOS樣改變。此外，研究者將DHEA刺激動(dòng)物模型后產(chǎn)生的高水平睪酮作為判斷PCOS模型構(gòu)建成功的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHEA處理組昆明白小鼠血清睪酮水平高達(dá)116.633 ng/mL，顯著高于對(duì)照組(0.805 ng/mL)。綜上，DHEA處理不僅造成了昆明白小鼠發(fā)情周期的停滯，而且卵巢卵泡也呈現(xiàn)出PCOS樣典型特征，同時(shí)也伴隨著血清睪酮濃度的顯著升高。表明改良后的DHEA處理方式能夠成功構(gòu)建昆明白小鼠PCOS模型。

DHEA作為雄激素的前體物質(zhì)，可體內(nèi)轉(zhuǎn)化為睪酮[17]?，F(xiàn)已證明，PCOS患者體內(nèi)的睪酮水平顯著高于對(duì)照組的年輕女性[18]；同時(shí)長(zhǎng)期暴露于高雄激素環(huán)境下的動(dòng)物易形成PCOS樣病變[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHEA注射20 d后，未性成熟的昆明白小鼠血清睪酮濃度顯著升高，這與Singh等[11]關(guān)于PCOS模型小鼠體內(nèi)高水平睪酮的報(bào)道相一致。另外，連續(xù)注射5～20 d，昆明白小鼠體內(nèi)睪酮持續(xù)處于較高水平，驗(yàn)證了異常升高的睪酮水平是誘導(dǎo)PCOS發(fā)生的一個(gè)核心因素的觀點(diǎn)；同時(shí)建模成功后的血清睪酮濃度為對(duì)照組的200倍以上，可以為PCOS患者的臨床鑒定提供參考。

在正常生理狀態(tài)下，DHEA刺激所增加的睪酮會(huì)經(jīng)由芳香化酶途徑被轉(zhuǎn)化為雌二醇，進(jìn)而促使血清雌二醇水平升高[20]。此外，PCOS患者或動(dòng)物模型的臨床特征為卵巢發(fā)育活動(dòng)停滯在大量囊泡狀卵泡時(shí)期，該時(shí)期卵泡顆粒細(xì)胞較為活躍，但雌二醇水平較低[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHEA組昆明白小鼠血清雌二醇水平在第10和15天顯著高于對(duì)照組，且第10天出現(xiàn)了血清雌二醇濃度最大值，約為同時(shí)期對(duì)照組的19.723倍，推測(cè)雌二醇水平升高可能來自高濃度睪酮轉(zhuǎn)化。值得注意的是，在高水平雄激素誘導(dǎo)的PCOS卵泡內(nèi)，雌二醇水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同期卵泡的正常水平[22-23]。本研究也發(fā)現(xiàn)，DHEA注射10 d以后，昆明白小鼠血清雌二醇水平迅速降低，20 d后雌二醇水平降至正常水平以下，與上述報(bào)道相一致。研究證明，在PCOS模型小鼠中，高水平雄激素通過激活抗繆勒管激素轉(zhuǎn)錄，抑制芳香化酶P450活性，促使雌激素水平下降[24-26]。推測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)的建模后期雌二醇水平降低的現(xiàn)象可能與睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化途徑受阻有關(guān)，但是建模過程中雌二醇瞬時(shí)升高是否具有其他病理意義，還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

皮下注射混合溶劑溶解的6 mg/100 g DHEA可成功構(gòu)建昆明白小鼠PCOS模型，該過程中睪酮水平在5 d后顯著升高并持續(xù)至20 d，雌二醇水平整體呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，但雌二醇在建模中期瞬時(shí)升高的病理意義還需進(jìn)一步研究。