硒對子癇前期合并膽汁淤積患者內(nèi)皮祖細胞的作用

王新玲 侯慧卿 肖玲 張紫鈺 李麗

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)存在于機體外周血、臍血、骨髓中，在修復受損血管、促進血管新生及生長中發(fā)揮直接的關(guān)鍵作用[1]；而微量元素作為機體維持正常生理功能不可或缺的元素，亦充當部分酶、激素的重要組成部分而直接參與機體細胞代謝，調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝；也被稱之為機體內(nèi)的抗氧化劑。硒作為一種必需微量元素，是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活化中心的一部分，可提高GSH-Px的活性，提升谷胱甘肽(GSH)的水平，抑制活性氧的產(chǎn)生，進而減輕血管內(nèi)皮損傷[2]。本研究對硒對在癇前期合并膽汁淤積患者內(nèi)皮祖細胞的作用進行研究，為臨床進一步的診療、疾病預防和檢測提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年6月至2022年4月在我院住院的子癇前期合并膽汁淤積的患者34例，年齡25～37歲，平均年齡(30.12±4.37)歲；孕次1～2歲，平均(1.41±0.62)次；產(chǎn)次0～2歲，平均(1.33±0.57)次；身高152～167 cm，平均(157.69±5.32)cm；體重55～73 kg，平均(158.32±10.19)kg。采集其晨間空腹靜脈血60 ml，加入肝素抗凝。

1.2 納入與排除標準

1.2．1 納入標準：①患者均符合中華醫(yī)學會婦產(chǎn)科學分會產(chǎn)科學組和妊娠期高血壓疾病學組發(fā)布的“妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥診療指南(2015)”[3]， “妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)”相關(guān)診斷標準[4]；②患者出現(xiàn)皮膚瘙癢或其他提示有膽汁淤積癥的癥狀，且經(jīng)實驗室檢查確診；③患者和(或)家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①病歷資料不完整，未在我院進行系統(tǒng)產(chǎn)檢者；②原發(fā)性高血壓、糖尿病患者；③肝腎功能異常者；④合并其他影響本實驗結(jié)果的疾病者；⑤有精神障礙不能配合本研究者。

1.3 主要試劑及材料 肝素結(jié)合蛋白(中翰盛泰生物有限公司)；人纖維連接蛋白(Fn，Gibco公司)；全培養(yǎng)液RPMI1640(lonza公司)；淋巴細胞分離液Histopaque 1077、FITC-UEA-I均來自Sigma公司；Dil-AcLDL(Molecular probes公司)；胎牛血清Fetal Bovine Serun(FBS，Gibco公司)；流式細胞儀(Beck Man Coulter)；MTT試劑盒(Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSo，江蘇Beyotime碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒；預染蛋白質(zhì)分子標準(Fermentas公司)；PE標記的VEGFR-2、CD133單克隆抗體均來自abcam公司；PE直標CD34單克隆抗體來自艾美捷科技；化學發(fā)光成像儀器ChemiDoc XRS(Bio-Rad，Canada)；Corning Transwell小室Transwell板(24孔，0.4 μm；濾膜直徑：6.5 mm；濾膜孔徑0.4 μm)為costar品牌，來自北京萌壯科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 內(nèi)皮祖細胞分離、培養(yǎng)、鑒定：①置于5%CO2飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)﹥2 h；②應(yīng)用PBS按比例稀釋靜脈血，再加入淋巴細胞分離液進行密度梯度離心處理后吸取白膜層(中間厚1～2 mm)，并收集單個核細胞(MNCs)；③將收集到的單個核細胞用l-dmem培養(yǎng)基離心洗滌1～2次，收集細胞，用egm-2培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)；所述egm-2培養(yǎng)基含有體積百分比為10%的胎牛血清、100 U/ml雙抗以及血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素樣生長因子-1；分別將單個核細胞種植于用50 μg/ml濃度的鼠尾膠原蛋白預先包被過的6孔細胞培養(yǎng)板中，置39℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)；每24小時半量換液1次；5 d后每24小時換液1次，7 d后每48小時換液一次直到傳代。④待細胞貼壁完全后用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定。細胞在培養(yǎng)液中避光孵育，然后以固定，液漂洗后再避光孵育。PBS液漂洗后在熒光顯微鏡下觀察，紅色為ac-LDL陽性細胞，綠色為UEA-1陽性細胞，顯示雙熒光陽性(黃色)的細胞被認為是EPC，隨機計數(shù)10個非重疊視野，計算雙陽性細胞比例。

1.4.2 實驗分組設(shè)計：①將微量元素與PBS配置成濃度為4、8、16 mmol/L的3組；②實驗分為對照組(常規(guī)RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng))、4 mmol/L、8 mmol/L、16 mmol/L微量元素組，將對應(yīng)計量的微量元素加入RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，再移除含微量元素的RPMI 1640培養(yǎng)基)，37℃培養(yǎng)24 h后觀察細胞形態(tài)。

1.4.3 MTT比色法檢測微量元素硒對內(nèi)皮祖細胞增殖的影響：將5×103個內(nèi)皮祖細胞與100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液充分混勻后接種于96孔細胞培養(yǎng)板(每組6個復孔及空白對照組)，待細胞貼壁生長后，將實驗組更換RPMI 1640培養(yǎng)液，劑量100 μl，分別加入含不同劑量的微量元素硒的100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h后加入含20 μl MTT(5 g/L)4 h后棄上清，再加入100 μl二甲基亞砜充分振蕩溶解結(jié)晶物，37℃恒溫孵育3 h后顯微鏡下觀察，以對照組凋零，測定各孔在波長450 mm下的吸光度值，采用酶標儀(波長490 nm)測定各孔吸光度(A)值。

1.4.4 Corning Transwell小室檢測微量元素硒對內(nèi)皮祖細胞黏附及遷移功能的影響：將600 μl 內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基加入下室培養(yǎng)24 h，加入濃度為140 μmol/L的3% H2O2或終濃度為4 ml的微量元素，對照孔不作處理，經(jīng)過培養(yǎng)-洗滌-固定-結(jié)晶紫染色-洗滌-晾干-封片，按9個視野/膜在高倍光學顯微鏡下觀察，并計數(shù)細胞，重復實驗3次，取3次平均值作為最終細胞計數(shù)。

1.4.5 微量元素對caspase-3 mRNA、caspase-3蛋白的影響：①RT-PCR法檢測微量元素對caspase-3 mRNA的影響：將孵育結(jié)束后的細胞經(jīng)過洗滌-吹打裂解-振蕩-離心-冰浴-離心-沉淀-離心-沉淀棄上清-晾干-吹打沉淀，充分溶解RNA，檢測RNA濃度，參照RT-PCR試劑盒(Promegag公司)說明書去進行檢測，Caspase-3/GAPDH比值即為Caspase-3 mRNA表達水平；②Western blot法檢測Caspase-3蛋白表達量：取處理好的內(nèi)皮祖細胞，經(jīng)洗滌-消化細胞-離心-裂解-離心-保存，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白質(zhì)濃度，再經(jīng)過電泳-轉(zhuǎn)膜-洗滌，采用化學發(fā)光法(試劑盒Promegag公司)檢測抗體反應(yīng)及顯色。

2 結(jié)果

2.1 微量元素硒對內(nèi)皮祖細胞增殖的影響 與對照組比較，隨著微量元素硒濃度增加，A值逐漸上升，且16 mmol/L微量元素組﹥8 mmol/L微量元素組﹥4 mmol/L微量元素組﹥對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 H2O2、微量元素硒對內(nèi)皮祖細胞增殖的影響

2.2 微量元素硒對內(nèi)皮祖細胞遷移活性的影響的影響 高倍鏡視野下，16 mmol/L微量元素組遷移細胞數(shù)﹥8 mmol/L微量元素﹥4 mmol/L微量元素﹥對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示隨著微量元素硒濃度的增加，內(nèi)皮祖細胞遷移能力增強。見表2。

表2 微量元素硒對內(nèi)皮祖細胞遷移能力的影響

2.3 RT-PCR法檢測微量元素硒對caspase-3 mRNA的影響 對照組比較，不同濃度條件下，caspase-3 mRNA表達均顯著下降，且隨濃度增加，caspase-3 mRNA表達逐漸降低，16 mmol/L微量元素組Caspase-3 mRNA﹤8 mmol/L微量元素組﹤4 mmol/L微量元素組﹤對照組，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)。見表3。

表3 RT-PCR法檢測微量元素硒對caspase-3 RNA的影響

2.4 硒對caspase-3蛋白的影響 與對照組比較，不同劑量的硒均使caspase-3 蛋白表達量顯著下降，且隨劑量增加，caspase-3 蛋白表達量逐漸降低。16 mmol/L微量元素組Caspase-3 蛋白表達量﹤8 mmol/L微量元素﹤2 mmol/L微量元素﹤對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 微量元素對caspase-3蛋白的影響

3 討論

3.1 子癇前期與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥 子癇前期和妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥是在妊娠中、晚期兩種常見的并發(fā)癥[5，6]。說明妊娠期膽汁淤積癥與先兆子癇風險增加有關(guān)，建議加強對妊娠期膽汁淤積癥女性先兆子癇的隨訪，尤其是那些早期妊娠期膽汁淤積癥表現(xiàn)和雙胞胎妊娠的女性[7]。子癇前期患者易發(fā)生早產(chǎn)、羊水過多、產(chǎn)后出血及胎死宮內(nèi)等不良結(jié)局[8，9]。子癇前期患者大多會合并糖脂代謝異常，可誘導大量的活性氧(ROS)產(chǎn)生，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成血管內(nèi)皮功能障礙。妊娠期膽汁淤積癥患者累積的膽汁酸也可導致氧化應(yīng)激，使血管內(nèi)皮生長因子水平失衡，血管內(nèi)皮受損[10]。有研究表明,子癇前期患者和妊娠期膽汁淤積癥患者外周血中的內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和血管內(nèi)皮生長因子水平均下降[11,12]。因此，減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮細胞功能，值得探究。

3.2 內(nèi)皮祖細胞與子癇前期的關(guān)系 血管重構(gòu)是妊娠的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，當血管內(nèi)皮損傷時，骨髓中的內(nèi)皮祖細胞可遷移、黏附至缺血部位，分泌血管生長因子并分化成血管內(nèi)皮細胞，促進血管新生及血管修復[13]。內(nèi)皮祖細胞在血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起重要作用，因此測量正常妊娠和先兆子癇中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量十分重要。一般來說，在正常妊娠中，隨著胎齡的增加，母體循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量會增加。在發(fā)生先兆子癇的情況下，臍帶血中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量會減少。Xia等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，先兆子癇組的胎盤/胎兒循環(huán)EPC數(shù)量顯著降低(P< 0.001)，在體外培養(yǎng)后，先兆子癇組的EPC數(shù)量也有所減少(P< 0.001)，循環(huán)EPC和培養(yǎng)的 EPC 都與可溶性 fms 樣酪氨酸激酶 1 (sFlt-1) 的臍帶血水平呈負相關(guān)，且先兆子癇患者的 EPC 的增殖、遷移和血管生成能力明顯受損。其原因是在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，GSH-Px等對ROS具有清除能力的酶活性降低，使ROS積聚，導致內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量減少，功能受損[15]。

3.3 硒的作用 硒的生物學功能由硒蛋白執(zhí)行，以催化和抗氧化活性而著稱。硒作為必需微量元素之一，是GSH-Px的重要活性組分。據(jù)報道，硒可調(diào)控ROS的含量，清除體內(nèi)自由基，發(fā)揮抗氧化作用，維持機體氧化還原的平衡[16]。在脊椎動物和無脊椎動物中，硒是一種必需的微量營養(yǎng)素，硒缺乏或過量與雄性和雌性的性腺功能不全和配子功能障礙有關(guān)，導致著床失敗、胚胎發(fā)育改變并最終導致不育。Silva等[17]系統(tǒng)評價的證據(jù)表明，較低的硒水平可增加妊娠期高血壓的發(fā)生風險。Xu等[18]報道硒與子癇前期之間呈負相關(guān)。與血壓正常的孕婦相比，子癇前期患者血液中的硒水平較低。早前的臨床觀察類實驗也提示孕婦體內(nèi)硒的含量與子癇前期的發(fā)生風險密切相關(guān)[19，20]。Dahabiyeh等[21]發(fā)現(xiàn)子癇前期婦女血漿中氧化AGT的比例高于匹配的血壓正常的孕婦對照組(P=0.006)，在子癇前期組，血壓與氧化AGT比例相關(guān);血漿GSH-Px與氧化AGT呈負相關(guān)，血清硒濃度與氧化AGT比例呈負相關(guān)。Shoeibi[22]的研究表明，硒具有抗氧化和抗炎活性，可有效預防氧化損傷和改善生理過程，可被視為可以改善血管問題的有效藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，硒可促進子癇前期合并膽汁淤積患者外周內(nèi)皮祖細胞的增殖并提高其遷移活性。提示硒提高了細胞的抗氧化能力，減緩了氧化應(yīng)激反應(yīng)。鑒于此，推薦妊娠期以65 μg/d為標準補充硒元素，以提高內(nèi)皮祖細胞的活性，預防子癇前期、妊娠期膽汁淤積癥的發(fā)生和發(fā)展。

3.4 硒與Caspase的關(guān)系 氧化應(yīng)激還可導致線粒體功能障礙，啟動細胞凋亡的線粒體途徑，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導致細胞凋亡[23]。Caspase-3作為細胞凋亡的執(zhí)行者，當其被激活，標志著細胞進入凋亡階段，可導致蛋白質(zhì)降解，引發(fā)細胞死亡?；A(chǔ)研究顯示，硒缺乏可通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，上調(diào)caspase-3mRNA的表達[24]。Zhu等[25]通過無定形硒納米粒子(A-SeQDs)對異卡磷誘導的血管功能障礙本研究，發(fā)現(xiàn)A-SeQDs可以減少大鼠體內(nèi)的總二氧化碳、MDA、VCAM-1、ICAM-1、IL-1 和 IL-6，同時增加氧飽和度、NO含量和SOD活性。A-SeQDs 還導致大鼠血管形態(tài)相對正常，鈉氫交換器 1 (NHE1)和caspase-3 的表達降低。此外，在用異卡磷處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC中，A-SeQD 可以維持線粒體膜電位，抑制裂解的caspase-3 表達，并將細胞色素c從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，說明A-SeQDs可通過線粒體途徑抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡，有效治療NHE1依賴性異卡磷引起的血管內(nèi)皮功能損傷。本結(jié)果顯示，與對照組相比，不同劑量的硒均使caspase-3 蛋白表達量顯著下降，蛋白表達量16 mmol/L微量元素組Caspase-3 ﹤8 mmol/L微量元素﹤4 mmol/L微量元素﹤對照組(P<0.05)。提示補充硒元素可通過其抗氧化作用，減少氧化應(yīng)激損傷，促進血管內(nèi)皮的恢復，對內(nèi)皮祖細胞凋亡具有保護作用。

綜上所述，硒對子癇前期合并膽汁淤積患者的內(nèi)皮祖細胞增殖及遷移活性、Caspase-3表達有重要影響。重視對微量元素的監(jiān)測，并指導孕婦注重營養(yǎng)均衡，按需補充，有利于防治妊娠并發(fā)癥和促進母嬰健康。