GSPT1在膀胱癌組織中的表達及對STAT3信號的影響研究

程琳 貝雨峰 李荷云 李成俊 李向東 畢瑞杰 劉建琳 張建

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年約有430 000例新發(fā)病例和165 000例死亡病例。盡管治療方法最近取得了進展，但晚期膀胱癌患者的預(yù)后仍然較差，其5年總生存率僅為20%[1,2]。膀胱癌的發(fā)展包括腫瘤抑制基因的遺傳變化,許多基因的分子改變與膀胱癌的發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。因此，迫切需要闡明膀胱癌的潛在分子機制，并找到治療該疾病的新分子靶標。腫瘤發(fā)生與細胞周期、增殖相關(guān)的某些特定蛋白有關(guān)。真核肽鏈釋放因子(eRF)是新生肽鏈釋放的一組重要蛋白質(zhì)，包括型eRF1、eRF3。eRF3a是哺乳動物蛋白質(zhì)翻譯終止過程中的主要因素，eRF3a主要由G1到S相變1蛋白(GSPT1)編碼。研究確定，胃癌、肺癌、前列腺患者中的GSPT1顯著增加[3]。最近的研究表明，GSPT1是骨髓惡性腫瘤增殖和分化的介體，其降低可導(dǎo)致急性髓細胞白血病(AML)中的細胞周期停滯和細胞凋亡[4]。此外，GSPT1可以重新排列以形成融合基因，GSPT1在慢性粒細胞白血病的疾病進展中起重要作用；還與肝細胞癌(HCC)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)[5]。生物信息學(xué)表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)是GSPT1的下游靶分子，積累的證據(jù)表明，STAT3作為癌基因起作用，并且是炎癥和癌癥之間的關(guān)鍵紐帶[6]。 STAT3誘導(dǎo)了鞘氨醇-1-磷酸受體1(S1PR1)的上調(diào)，后者相互激活STAT3，導(dǎo)致持續(xù)的IL-6釋放，從而促進B16黑色素瘤和MB49膀胱癌模型的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[7]。目前筆者尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于GSPT1/STAT3信號通路與膀胱癌關(guān)系的研究，本研究擬探討GSPT1在膀胱癌組織中的表達及對STAT3信號的影響，為膀胱癌的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015至2021年張家口市第一醫(yī)院泌尿外科通過全膀胱切除術(shù)獲取的69例癌組織標本和69例相鄰的非惡性組織標本(癌旁組織)。所有組織標本經(jīng)確認并歸類為TCCB。 通過組織學(xué)檢查。 根據(jù)UICC指南評估組織學(xué)等級和分期，包括低分化21例，中分化23例，高分化25例。切除后立即將樣品冷凍在液氮中。所有患者已獲得知情同意，并且研究方案已得到機構(gòu)研究倫理委員會的批準。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化法測定GSPT1表達及判定標準:將組織標本用10%中性甲醛固定，包埋在石蠟中，并準備5 mm厚的切片。將石蠟包埋的組織切片在檸檬酸鈉緩沖液中脫蠟，重新水化并微波處理30 min，以修復(fù)抗原表位。將組織切片與3%H2O2孵育并用山羊血清封閉，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后，將組織切片與靶向GSPT1(稀釋度1∶100，美國Abcam，批號：TY-526363.36)的一級單克隆抗體在4℃孵育過夜。然后與大鼠或兔抗山羊IgG抗體在37℃孵育45 min，然后與鏈霉親和素過氧化物酶孵育15 min。將切片用發(fā)色劑二氨基聯(lián)苯胺(DAB，中國中山金橋)染色，直到出現(xiàn)棕色。用蘇木精對細胞核染色。用顯微鏡觀察所有圖像，并用IPP 6.0(Intel?)分析。通過結(jié)合陽性染色的腫瘤細胞的比例和染色強度來確定分數(shù)。 將染色的細胞的強度半定量地分為四個等級：0(不染色)； 1(弱染色=淺黃色)； 2(中等染色=黃棕色)和3(強染色=棕色)；得分為：0:負數(shù)；1:<10%； 2:11%～50%；3:51%～80%；4:>80%的陽性細胞。 每個標記的陽性細胞分數(shù)的強度和分數(shù)相乘，因此評分系統(tǒng)被定義為分數(shù)為0～3的陰性表達，分數(shù)為4～12的陽性表達。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及其分組設(shè)計:T24細胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，并在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(中國碧云天生物，批號：AX-4585.36)中培養(yǎng)(含有10%的胎牛血清，100 U/ml的青霉素和100 mg/ml的鏈霉素)，并在在37℃、5%CO2的濕潤氣氛中生長。通過將PCR擴增的全長人GSPT1 cDNA亞克隆到pReceiver-Lv121質(zhì)粒(購自Genecopoeia，目錄號EX-T2560-Lv121)中，生成GSPT1表達構(gòu)建體。GSPT1開放閱讀框(ORF)的長度為987 bp。為過表達/低表達GSPT1，Ribobio(廣州市銳博生物科技有限公司)合成并純化了兩個靶向GSPT1的人siRNA序列，使用的siRNA序列如下：GSPT1 inhibitor組：5 ’-GGTGCGATCGATCGTCAGAAAGUCUGUGAGAUUdTdT-3’;GSPT1mimics：5’-CAAUGCUGAUCGTAGCTGAUCUGUUUGAUAAdTdT-3’。通過慢病毒感染產(chǎn)生表達GSPT1 inhibitor、GSPT1 mimics的穩(wěn)定細胞系。 對于慢病毒生產(chǎn)，使用Lipofectamine Reagent(美國Invitrogen，批號：UY-56963.36)，將慢病毒表達載體與慢病毒包裝載體共轉(zhuǎn)染到T24細胞中。用1.0 mg/ml嘌呤霉素選擇表達GSPT1的穩(wěn)定細胞系3 d。72 h后，收集細胞并進行處理以進行進一步的體外研究。

1.2.3 T24細胞細胞活力的檢測及癌細胞單克隆形成數(shù)目檢測:在指定的時間點，將培養(yǎng)結(jié)束的細胞與100 ml無菌MTT染料(0.5 mg/ml，美國Sigma生物科技，批號：DX-47856.36)一起接種到96孔板中，在37℃下放置4 h，然后除去培養(yǎng)基，并加入150 μl二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma生物科技，批號：OP-458993.3)添加。 在570 nm下以655 nm作為參考波長測量吸光度。所有實驗均重復(fù)3次。將細胞接種在60 mm培養(yǎng)皿上(每板0.5×103個細胞)并在5%CO2中37℃培養(yǎng)。10 d后，用10%甲醛固定5 min后，用1.0%結(jié)晶紫染色30 s。

1.2.4 T24細胞細胞凋亡測定:Annexin V-FITC/PI雙重染色試劑(美國塞默非世生物科技，批號：DR-485963.36)結(jié)合FC500MCL流式細胞儀(美國伯樂生物科技)檢測細胞凋亡。 將培養(yǎng)結(jié)束細胞以3×105細胞/孔的密度接種在6孔板中，用0.25%胰蛋白酶消化，消化后用PBS洗滌2次，加入100 μl結(jié)合緩沖液，依次制成1×106細胞/ml懸浮液。加入膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI，在室溫下于黑暗中孵育5 min，并用流式細胞儀系統(tǒng)檢測。重復(fù)實驗3次并取平均值。

1.2.5 T24細胞侵襲水平測定:分別使用Matrigel Tranwell評估細胞的侵襲。通過使用具有8 μm孔膜的24孔腔室(Corning LifeSciences，目錄號353097)和下部腔室中含有10%FBS的培養(yǎng)基作為化學(xué)吸引劑來評估細胞的侵襲水平。將細胞(1×105)的無血清培養(yǎng)基接種到上腔室中，并向含10%FBS的下腔室侵襲。24 h后，固定侵襲細胞并用0.1%結(jié)晶紫染色。通過使用圖像分析軟件ImagePro Plus 6.0(美國Media Cybernetics)測量侵襲細胞。

1.2.6 T24細胞遷移水平測定：將細胞(每孔1×104)接種到12孔板中，使其生長至匯合。使用200 μl無菌移液器吸頭在每個鋪滿的單層上劃傷(傷口)后，將細胞在無血清培養(yǎng)基中于恒溫和CO2控制的培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)下培養(yǎng)24 h。通過測量傷口相對邊緣之間的距離來研究傷口閉合情況。至少進行了3個獨立的實驗。

1.2.7 T24細胞GSPT1、STAT3、JAK2 mRNA表達水平測定:首先，將細胞系制備成細胞懸液。然后，添加TRIzol試劑以提取總RNA?？俁NA的濃度和純度通過Nanodrop 1000顯微分光光度計(Gene Company Limited，中國)測量。根據(jù)制造商的說明，通過RT-PCR試劑盒(日本Takara，批號：5856.36)獲得cDNA。用于GSPT1擴增的引物是正向5’-CATGTGCTAGCTGATCGTACGCGTTGGT-3’和反向5’-CCCACGTAGCTGATCGTCGATCGTGTTAAGA-3’。用于STAT3擴增的引物是正5’-GAGCACTCGTAGCTAGTCGATGCTAGATCC-3’和反向5’-CGACGTAGCTAGTCGATCGTATGACTGCC-3’。JAK2擴增用引物為正向5’-GGCCGTAGCTAGCTGATGATCGAAACAACC-3’和反向5’-GCACGTAGCTGATCGTAGCTATTGAATCC-3’。 GAPDH擴增的引物是正向5’-TAGCTAGCTGTCAGTCGCTCGAGGCACAAG-3’和反向5’-GTTTTGTCGATGCTAGCTAGTCGGCTTCA-3’。PCR反應(yīng)條件如下：在94℃預(yù)變性45 s，在94℃變性10 s，在60℃退火30 s，共40個循環(huán)。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本Takara，批號：XS-52636.36)進行實時定量PCR。將基因表達標準化為GAPDH表達。

1.2.8 T24細胞GSPT1、STAT3、JAK2表達水平測定:將培養(yǎng)結(jié)束的細胞在RIPA裂解緩沖液中裂解，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Thermo Scientific，批號：XI-4589636.32)檢測蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，批號：DS-569696.37)上。在室溫下將印跡在5%牛奶中封閉1 h。將PVDF膜與抗GSPT1、STAT3、JAK2、GAPDH一抗(英國Abcam，目錄號:ab76148、ab108596、ab32101、ab68153)在4℃的冷藏室中孵育過夜。隨后，將膜與生物素化的山羊抗小鼠IgG(1∶3 000，中山金橋生物技術(shù)有限公司，批號：VB-58965.69)在室溫下孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(美國Amersham Pharmacia Biotech.批號：VB-26985.36)檢測了免疫反應(yīng)帶強度，并通過AS-98 LabWorks Image(美國Scion Corporation)確定每個條帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織、膀胱癌組織中GSPT1表達的相關(guān)性分析 膀胱癌組織中GSPT1蛋白表達陽性率高于癌旁組織(P<0.01)。見表1，圖1。

表1 癌旁組、膀胱癌組中GSPT1表達的相關(guān)性分析 n=69，例(%)

圖1 GSPT1在癌旁組織、膀胱癌組織的表達(結(jié)晶紫染色×40)；A 癌旁組織;B 膀胱癌組織

2.2 GSPT1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 GSPT1蛋白表達與年齡的相關(guān)性并不明顯(P>0.05)；與TMN分期、病理學(xué)分級、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)性明顯，且TMN分級越高、病理學(xué)分期越高、有復(fù)發(fā)、有轉(zhuǎn)移的患者中， GSPT1蛋白陽性表達率越高(P<0.01)。見表2。

表2 GSPT1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 3組T24膀胱癌細胞OD值、存活率水平的表達 與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組OD值、存活率水平降低(P<0.01)，GSPT1 mimics組OD值、存活率水平升高(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組OD值、存活率水平升高(P<0.01)。見表3。

表3 3組T24膀胱癌細胞OD值、存活率水平的表達

2.4 3組T24膀胱癌細胞單克隆形成數(shù)目的表達 與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組單克隆形成數(shù)目降低(P<0.01)，GSPT1 mimics組單克隆形成數(shù)目升高(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組單克隆形成數(shù)目升高(P<0.01)。見表4。

表4 3組T24膀胱癌細胞克隆形成數(shù)目的表達

2.5 3組T24膀胱癌細胞凋亡率的表達 與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組細胞凋亡率升高(P<0.01)，GSPT1 mimics組細胞凋亡率降低(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組單細胞凋亡率降低(P<0.01)。見表5。

表5 3組T24膀胱癌細胞凋亡率的表達

2.6 3組T24膀胱癌細胞遷移能力比較 與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組遷移率降低(P<0.01)，GSPT1 mimics組遷移率升高(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組遷移率升高(P<0.01)。見表6。

表6 3組T24膀胱癌細胞遷移能力比較

2.7 3組T24膀胱癌細胞遷移能力比較 與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組穿膜數(shù)降低(P<0.01)，GSPT1 mimics組穿膜數(shù)升高(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組穿膜數(shù)升高(P<0.01)。見表7，圖2。

表7 3組T24膀胱癌細胞穿膜數(shù)比較

圖2 3組膀胱癌T24細胞穿膜數(shù)數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色×40);A T24膀胱癌細胞組；B GSPT1 inhibitor組；C GSPT1 mimics組

2.8 3組T24膀胱癌細胞GSPT1、STAT3、JAK2mRNA表達水平比較 與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組細胞GSPT1、STAT3、JAK2mRNA降低(P<0.01)，GSPT1 mimics組細胞GSPT1、STAT3、JAK2mRNA升高(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組GSPT1、STAT3、JAK2mRNA升高(P<0.01)。見圖3，表8。

圖3 3組T24膀胱癌細胞STAT3蛋白比較;A T24膀胱癌細胞組；B GSPT1 inhibitor組；C GSPT1 mimics組

表8 3組T24膀胱癌細胞GSPT1、STAT3、JAK2 mRNA表達水平比較

2.9 3組T24膀胱癌細胞GSPT1、STAT3、JAK2蛋白表達水平比較 與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組細胞GSPT1、STAT3、JAK2蛋白降低(P<0.01)，GSPT1 mimics蛋白升高(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組GSPT1、STAT3、JAK2蛋白升高(P<0.01)。見表9。

表9 3組T24膀胱癌細胞GSPT1、STAT3、JAK2蛋白表達水平比較

3 討論

許多細胞的腫瘤發(fā)生與GSPT1的異常表達有關(guān)，這表明失調(diào)的GSPT1可能在癌變或腫瘤進展中起關(guān)鍵作用。GSPT1由單個基因位點加工而成，該基因位點由必需的造血轉(zhuǎn)錄因子GATA-1調(diào)控。最近的研究表明，GSPT1在許多人類癌癥中起著重要作用，包括鼻咽癌、大腸癌和濾泡性甲狀腺癌[8]。在各種癌癥類型的30項研究中，GSPT1被廣泛上調(diào)。據(jù)報道，mTOR是GSPT1的直接靶標，GSPT1的上調(diào)促進了CRC細胞系HT29的增殖[9]。盡管GSPT1在多種癌癥中均明顯過表達，但尚未完全了解GSPT1在惡性腫瘤中的作用機制。在本研究中，我們研究了T24膀胱癌細胞中GSPT1的致癌性，發(fā)現(xiàn)GSPT1在T24膀胱癌細胞中被上調(diào)，從而推斷出GSPT1參與了膀胱癌的發(fā)展。通過生物信息學(xué)分析，將STAT3基因指示為理論GSPT1靶基因。本研究的熒光素酶報告基因分析表明，GSPT1通過STAT3 3’UTR介導(dǎo)了STAT3下調(diào)。 qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析表明，GSPT1的過表達顯著升高了STAT3 mRNA和蛋白質(zhì)的水平。這些結(jié)果表明，STAT3是GSPT1的真正靶標。

在人類中，先前的研究表明，腸型胃腫瘤和乳腺癌中GSPT1 mRNA的水平升高，在人類軟骨細胞分化過程中GSPT1 mRNA的水平則顯著升高。GSPT1表達與血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。GSPT1表達與AML患者的預(yù)后呈負相關(guān)，而NUMB的表達在體外和體內(nèi)均受GSPT1負調(diào)控[10]；GSPT1可能是成人B細胞急性淋巴細胞白血病的預(yù)后不良因素。最近，研究揭示了實體瘤(肝癌)患者GSPT1表達與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GSPT1表達與EMT相關(guān)，并且是HCC預(yù)后的預(yù)測生物標志物。與上述的報告一致，本研究表明GSPT1表達在人膀胱癌組織上調(diào)，并且患者GSPT1表達水平與TNM分期、病理學(xué)分級、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)性明顯，且TNM分期越高、病理學(xué)分期越高、有復(fù)發(fā)、有轉(zhuǎn)移，GSPT1蛋白陽性表達率越高(P<0.01)。這些研究表明GSPT1是膀胱癌診斷預(yù)后的新型預(yù)測因子。進一步解釋GSPT1的促癌機制，我們測試了GSPT1過/低表達后，癌細胞增殖、侵襲、凋亡水平的改變結(jié)果發(fā)現(xiàn)T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組OD值、存活率、穿膜數(shù)、遷移率水平降低(P<0.01)，GSPT1 mimics組OD值、存活率、穿膜數(shù)、遷移率水平升高(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組OD值、存活率、穿膜數(shù)、遷移率水平升高(P<0.01)。與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組細胞凋亡率升高(P<0.01)，GSPT1 mimics組細胞凋亡率降低(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1 mimics組單細胞凋亡率降低(P<0.01)。這表明，GSPT1能促進T24膀胱癌細胞增殖、侵襲、抑制其凋亡。

STAT3是增殖信號的重要靶標，在細胞增殖中起著重要作用。越來越多的證據(jù)表明，STAT3表達升高，它是介導(dǎo)癌癥進展的轉(zhuǎn)錄因子，其在60%的結(jié)直腸癌、胃癌中高度過量表達，這表明STAT3也是腫瘤發(fā)生的標志[11,12]。此外，癌基因JAK2是凋亡蛋白的抑制劑，在控制細胞增殖和生長中具有重要意義。先前研究表明，STAT3、JAK2存在相互作用[13-15]。STAT3的下表達降低了JAK2的蛋白水平，這表明STAT3可能通過JAK2參與細胞凋亡的調(diào)控。

作為一種腫瘤癌基因，JAK2是癌癥治療的重要靶點，是線粒體凋亡途徑的重要調(diào)節(jié)劑，并通過阻止細胞色素c從線粒體膜間空間釋放到細胞質(zhì)中來發(fā)揮其抗凋亡功能[16]。研究表明，STAT3/Jak2信號在上皮-間充質(zhì)向癌細胞的轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用，這暗示了STAT3/Jak2信號在膀胱癌進展中的重要性[17]；膀胱癌細胞中STAT3/Jak2的激活驅(qū)動了EMT和腫瘤的侵襲；Jak2抑制劑AG490可以抑制膀胱癌細胞的生存能力和細胞遷移，并同時降低STAT3信號傳導(dǎo)[18-20]。這些研究證明STAT3在膀胱癌進展中具有致癌作用，但是GSPT1和STAT3/Jak2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在膀胱癌轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)關(guān)系尚不清楚。本研究中，與T24膀胱癌細胞組比較，GSPT1 inhibitor組細胞GSPT1、STAT3、JAK2mRNA蛋白降低(P<0.01)，GSPT1 mimics組細胞GSPT1、STAT3、JAK2mRNA蛋白升高(P<0.01)；與GSPT1 inhibitor組比較，GSPT1、STAT3、JAK2mRNA蛋白升高(P<0.01)。這表明，GSPT1促進STAT3、JAK2mRNA蛋白表達進而激活STAT3/JAK2通路。本研究顯示人類膀胱細胞中GSPT1的過度表達與Jak2和STAT3的表達以及STAT3/Jak2基因的激活相關(guān)，表明GSPT1可能通過STAT3/Jak2信號通路誘導(dǎo)膀胱癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。這為膀胱癌的發(fā)生提供了新的見解。

綜上所述，GSPT1在膀胱癌組織上調(diào)，與TNM分期、病理學(xué)分級、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)；GSPT1可能通過STAT3/Jak2信號通路誘導(dǎo)膀胱癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。