miR-27b-3p調(diào)控OPA1表達(dá)對心力衰竭模型心肌細(xì)胞線粒體融合的影響

郝春媛 李同華 任洋 張譽(yù)洋

心力衰竭，是不同類型心血管疾病的終末階段，其發(fā)病率和死亡率高，且有逐年增加的趨勢，對人類健康威脅極大[1]。研究表明線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常與心力衰竭的發(fā)展有關(guān)，而線粒體融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡是線粒體發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)[2]。心力衰竭的主要病理過程是心肌重構(gòu)，而線粒體分裂時(shí)氧化能力及三磷酸腺苷(ATP)的降低是導(dǎo)致心肌重構(gòu)發(fā)生的主要原因[3]。文獻(xiàn)顯示微小RNA(miRNA)不僅能夠參與調(diào)控心肌細(xì)胞的生物學(xué)行為，還能影響心血管疾病的進(jìn)程[4]。miR-27b-3p是miR-27家族的一員，其在癌細(xì)胞中研究較多，只有袁淑菁等[5]發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p過表達(dá)可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞纖維化。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy protein-1，OPA1)與miR-27b-3p可能存在靶向關(guān)系。OPA1是線粒體融合蛋白的一種，研究表明OPA1在心力衰竭模型心肌細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)[6]。因此，本研究通過建立心力衰竭模型，觀察miR-27b-3p的表達(dá)情況，并探討其對心肌細(xì)胞線粒體融合的影響及可能的作用機(jī)制，以期為心力衰竭的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 miR-27b-3p antagomir及陰性對照antagomir NC、miR-27b-3p inhibitor及陰性對照inhibitor NC、miR-27b-3p mimics及陰性對照mimics NC、OPA1 siRNA及其對照siRNA NC由上海生工生物公司提供；戊巴比妥鈉購自海江萊生物科技有限公司；臺氏液、無鈣臺氏液購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自北京索萊寶生物公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自上海篤瑪生物科技有限公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自上海翌圣生物公司；ATP、ROS、JC-1試劑盒購自上海懋康生物科技有限公司；OPA1、線粒體融合蛋白(mitofusion，MFN)1、MFN2、電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1，VDAC-1)、細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ亞型(Cytochrome C oxidase Ⅳ subtype，COXⅣ)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Mitochondrial transcription factor A，Tfam)、過氧化物酶體增殖物激活受體Y輔激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)、自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(B lymphocytoma-2 gene/adenovirus E1B interaction protein 3，Bnip3)一抗及對應(yīng)二抗購自美國ABCam公司。透射電鏡購自北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司；超薄切片機(jī)購自沈陽恒松科技有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自山東博科科學(xué)儀器有限公司；qRT-PCR儀購自美國ABI公司；小型動(dòng)物呼吸機(jī)購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀購自北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；熒光分光光度計(jì)購自上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級健康SD雄性大鼠60只，體重為(200.14±10.37)g，由康泰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)河北有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號為SYXK(冀)2021-006。大鼠均飼養(yǎng)于我院清潔級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。本研究通過醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.3 動(dòng)物分組、造模與干預(yù)方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分成Sham組、model組、antagomir NC組和miR-27b-3p antagomir組，每組15只。Sham組除外，其他3組大鼠均按照Lu等[7]的研究方法制備心力衰竭大鼠模型：將麻醉后的大鼠與心電圖連接進(jìn)行肢體導(dǎo)聯(lián)，然后打開左側(cè)胸腔，于左心耳根部結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，心電監(jiān)測顯示ST段弓背型抬高，說明模型制備成功。手術(shù)后為預(yù)防感染，所有大鼠每天肌內(nèi)注射15×104U/kg青霉素，連續(xù)3 d。Sham組大鼠僅開胸但不結(jié)扎，其他操作與上述方法一致。造模完成后，antagomir NC組和miR-27b-3p antagomir組大鼠于尾靜脈分別注射antagomir NC和miR-27b-3p antagomir，而Sham組和model組大鼠注射等量的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為9%的氯化鈉溶液，2次/周，連續(xù)4周。

1.4 透射電鏡觀察心肌組織線粒體結(jié)構(gòu)變化 4周后，4組大鼠實(shí)施安樂死，把心臟取出，剪取心尖位置的心肌組織，快速進(jìn)行固定，備成70 nm左右的石蠟切片，分別用2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行染色，室溫下晾干，最后在透射電鏡下觀察各組大鼠心肌組織線粒體結(jié)構(gòu)并拍照保存。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.5.1 大鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：將大鼠心臟取出，去除心包膜的心臟主動(dòng)脈與離體心臟灌流裝置進(jìn)行插管連接，依次進(jìn)行臺氏液、無鈣臺氏液灌流，待心臟跳動(dòng)停止后使用膠原酶Ⅱ和含胎牛血清的無鈣臺氏液對膠原組織進(jìn)行消化，等到心臟顏色變淡時(shí)，取其左心室組織并放置在KB液中，通過移液槍吸打?qū)蝹€(gè)心肌細(xì)胞分離出來。在37℃下，將心肌細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基上，在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.2 心力衰竭細(xì)胞模型構(gòu)建與分組：在心肌細(xì)胞中加入100 μl體積分?jǐn)?shù)為0.8%的戊巴比妥鈉[8](用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基溶解)，培養(yǎng)10 min，顯微鏡下觀察，細(xì)胞停止搏動(dòng)說明心力衰竭細(xì)胞模型制備成功。將模型構(gòu)建成功的心肌細(xì)胞隨機(jī)分成model組(不轉(zhuǎn)染)、inhibitor NC組(轉(zhuǎn)染inhibitor NC)、miR-27b-3p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-27b-3p inhibitor組)、miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組(共轉(zhuǎn)染miR-27b-3p inhibitor和siRNA NC)和miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組(共轉(zhuǎn)染miR-27b-3p inhibitor和OPA1 siRNA)，另取正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Control組。

1.5.3 qRT-PCR檢測miR-27b-3p和OPA1 mRNA水平：分別提取1.3中大鼠心肌組織與1.5.2中大鼠心肌細(xì)胞的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒和儀器的使用說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-27b-3p正向引物5’-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，反向引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6引物序列為：正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；OPA1正向引物5’-TCACTGCGGGTACACCTGG-3’，反向引物5’-CTGACACCTTCCTATAGTGCTTGT-3’；GAPDH引物序列為：正向引物5’-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3’，反向引物5’-CGCCAGTAGACTCCACGACAT-3’。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-27b-3p和OPA1 mRNA的相對表達(dá)量，U6或GAPDH為內(nèi)參基因。

1.5.4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測miR-27b-3p和OPA1的靶向關(guān)系：Targetscan 7.2在線網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)OPA1是miR-27b-3p的潛在靶基因。構(gòu)建野生型(WT-OPA1)和突變型(MUT-OPA1)載體，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將其分別與mimics-NC或miR-27b-3p mimics共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，孵育48 h。然后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測其酶活。

1.5.5 熒光素酶發(fā)光法檢測線粒體ATP合成活力：差速離心法分離4組心肌細(xì)胞線粒體，制備成懸液，根據(jù)試劑盒的說明書方法處理，并使用熒光分光光度計(jì)檢測其熒光強(qiáng)度，并計(jì)算ATP合成活力。

1.5.6 DCFH-DA熒光染料檢測線粒體ROS水平：按照ROS試劑盒方法處理線粒體懸液，加入DCFH-DA試劑，分別在488 nm和525 nm波長處檢測其熒光強(qiáng)度，以其熒光強(qiáng)度的比值代表ROS水平。

1.5.7 JC-1熒光探針法檢測線粒體膜電位：將JC-1染色液與線粒體懸液均勻混合，10 min后分別檢測590 nm及527 nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算膜電位變化(ΔΨm)值，以兩處波長處的熒光強(qiáng)度比值表示。

1.5.8 Western blot檢測線粒體動(dòng)力蛋白及心肌相關(guān)蛋白表達(dá)：各組心肌細(xì)胞裂解后，提取其中總蛋白，定量后經(jīng)凝膠電泳將蛋白分離，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封閉，分別加入稀釋后的OPA1、MFN1、MFN2、VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α、Beclin-1、Bnip3一抗，次日再加入稀釋后的二抗，靜置1 h，添加化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，最后使用Image J軟件分析蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 miR-27b-3p antagomir對大鼠線粒體結(jié)構(gòu)的影響 與Sham組相比，model組大鼠線粒體呈不規(guī)則排列，且有明顯的腫脹，大多數(shù)線粒體嵴出現(xiàn)模糊、斷裂或者缺失的現(xiàn)象，antagomir NC組大鼠線粒體的形態(tài)與model組大鼠類似；與model組和antagomir NC組相比，miR-27b-3p antagomir組大鼠線粒體明顯增多，線粒體膜和嵴的結(jié)構(gòu)均恢復(fù)完整。見圖1。

Sham組model組antagomir NC組miR-27b-3p antagomir組

2.2 miR-27b-3p、OPA1 mRNA在4組大鼠心肌組織中的表達(dá)水平 與Sham組比較，model組大鼠心肌組織中miR-27b-3p表達(dá)明顯增加，OPA1 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與model組和antagomir NC組比較，miR-27b-3p antagomir組大鼠心肌組織中miR-27b-3p表達(dá)明顯減少，OPA1 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 miR-27b-3p、OPA1 mRNA在4組大鼠心肌組織中的表達(dá)水平

2.3 miR-27b-3p、OPA1 mRNA在4組大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平 model組大鼠心肌細(xì)胞中miR-27b-3p表達(dá)低于Control組高，OPA1 mRNA表達(dá)比Control組低(P<0.05)；miR-27b-3p inhibitor組大鼠心肌細(xì)胞中miR-27b-3p表達(dá)高于model組和inhibitor NC組明顯變低，OPA1 mRNA表達(dá)比model組和inhibitor NC組(P<0.05)。見表2。

表2 miR-27b-3p、OPA1 mRNA在4組大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.4 miR-27b-3p靶向調(diào)節(jié)OPA1蛋白表達(dá) Targetscan 7.2在線網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，miR-27b-3p和OPA1存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，與mimics NC+WT-OPA1組相比，miR-27b-3p mimics+WT-OPA1組相對熒光素酶活性明顯變低(P<0.05)；與mimics NC+MUT-OPA1組相比，miR-27b-3p mimics+MUT-OPA1組相對熒光素酶活性變化不大(P>0.05)。與mimics NC組比較，miR-27b-3p mimics組OPA1蛋白顯著上調(diào)(P<0.05)；與inhibitor NC組比較，miR-27b-3p inhibitor組OPA1蛋白顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖2、3，表3、4。

圖2 miR-27b-3p和OPA1的作用位點(diǎn)

圖3 4組大鼠心肌細(xì)胞中OPA1蛋白表達(dá)比較；A mimics NC組；B miR-27b-3p mimics組；C inhibitor NC組；D miR-27b-3p inhibitor組

表3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

表4 miR-27b-3p靶向調(diào)節(jié)OPA1蛋白表達(dá)

2.5 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細(xì)胞中ATP、線粒體ROS及ΔΨm的影響 與Control組相比，model組線粒體ROS水平顯著上升，ATP和ΔΨm顯著下降(P<0.05)；與model組和inhibitor NC組比較，miR-27b-3p inhibitor組線粒體ROS水平明顯下降，ATP和ΔΨm明顯上升(P<0.05)；與miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組和miR-27b-3p inhibitor組相比，miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組線粒體ROS水平明顯增加(P<0.05)，ATP和ΔΨm明顯減小(P<0.05)。見表5。

表5 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細(xì)胞中ATP、線粒體ROS及ΔΨm的影響

2.6 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細(xì)胞中線粒體動(dòng)力蛋白表達(dá)的影響 model組OPA1、MFN1、MFN2蛋白水平均顯著低于Control組(P<0.05)；miR-27b-3p inhibitor組OPA1、MFN1、MFN2蛋白水平顯著高于model組和inhibitor NC組(P<0.05)；miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組OPA1、MFN1、MFN2蛋白水平明顯比miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組低(P<0.05)，而miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組和miR-27b-3p inhibitor組間蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4，表6。

圖4 6組心肌細(xì)胞中線粒體動(dòng)力蛋白表達(dá)比較；A Control組;B model組;C inhibitor NC組;D miR-27b-3p inhibitor組;E miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組；F miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組

2.7 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細(xì)胞中心肌相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Control組相比，model組VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Beclin-1、Bnip3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與model組和inhibitor NC組比較，miR-27b-3p

表6 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細(xì)胞中線粒體動(dòng)力蛋白表達(dá)的影響

inhibitor組VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Beclin-1、Bnip3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；與miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組和miR-27b-3p inhibitor組相比，miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Beclin-1、Bnip3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖5，表7。

圖5 6組心肌細(xì)胞中心肌相關(guān)蛋白表達(dá)比較;A Control組;B model組;C inhibitor NC組;D miR-27b-3p inhibitor組;E miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組；F miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組

表7 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細(xì)胞中心肌相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

心力衰竭是心血管疾病發(fā)展至嚴(yán)重階段的一種臨床綜合征，主要由呼吸道感染、心律失常等引起，臨床上的癥狀為呼吸困難、乏力、咳嗽等。目前臨床上常通過手術(shù)或者藥物治療緩解心力衰竭患者的病癥，但無法將其治愈。因此，尋找合適的靶點(diǎn)、降低心力衰竭患者的病死率是臨床上治療心力衰竭的關(guān)鍵。

據(jù)報(bào)道，miR-27b-3p可作為生物標(biāo)志物，在腎纖維化[9]、心肌梗死后血管再生[10]、心房纖維化[11]等方面起調(diào)控作用。相關(guān)研究顯示，線粒體結(jié)構(gòu)改變和功能障礙不僅對心臟功能有損害作用，還能加速心力衰竭發(fā)展[12]。線粒體融合能使受損的線粒體得到修復(fù)，從而恢復(fù)心臟功能，減緩心力衰竭過程。本研究結(jié)果顯示，心力衰竭模型大鼠心肌組織中miR-27b-3p顯著上調(diào)，線粒體結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重；通過miR-27b-3p antagomir下調(diào)miR-27b-3p表達(dá)后，線粒體形態(tài)得到恢復(fù)，數(shù)量也明顯增加，提示miR-27b-3p下調(diào)表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞線粒體融合，從而保護(hù)心臟功能。

線粒體是向心肌細(xì)胞提供能量和產(chǎn)生ROS的重要場所，心力衰竭時(shí)線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，功能也受到阻礙，導(dǎo)致ROS過度聚集，ATP大量流失，進(jìn)而刺激心肌細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞線粒體跨膜電位的降低能夠使心臟功能受損，從而促進(jìn)心力衰竭[13]。本研究通過構(gòu)建心力衰竭細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，model組miR-27b-3p表達(dá)明顯升高，該結(jié)果與miR-27b在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中的結(jié)果[14]類似；miR-27b-3p inhibitor處理能夠顯著降低model組心肌細(xì)胞線粒體ROS水平，升高ATP和ΔΨm(P<0.05)，揭示抑制miR-27b-3p表達(dá)可通過恢復(fù)線粒體功能保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。VDAC-1定位于線粒體外膜，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、線粒體凋亡等過程。研究發(fā)現(xiàn)VDAC-1在急性心肌梗死大鼠模型中明顯降低[15]。牟連偉等[16]發(fā)現(xiàn)COXIV上調(diào)表達(dá)有助于改善阿爾茲海默病模型小鼠中樞神經(jīng)元線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔功能。PGC-1α參與調(diào)節(jié)線粒體生物合成，能夠激活下游靶基因表達(dá)。Bnip3、Beclin-1是調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白，二者表達(dá)升高，自噬水平增強(qiáng)[17]。本研究結(jié)果顯示，model組OPA1、MFN1、MFN2、VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白顯著降低，Beclin-1、Bnip3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；miR-27b-3p inhibitor干預(yù)后，上述蛋白水平均得到逆轉(zhuǎn)，說明miR-27b-3p沉默能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)保護(hù)線粒體功能，抑制自噬，進(jìn)而緩解心力衰竭。

Targetscan 7.2網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示OPA1是miR-27b-3p的靶基因。有研究發(fā)現(xiàn)OPA1表達(dá)提高有助于改善線粒體功能，對壓力過載誘導(dǎo)的心力衰竭有保護(hù)作用[18]。本研究結(jié)果顯示，心力衰竭模型心肌細(xì)胞中OPA1均顯著下調(diào)表達(dá)，這可能使導(dǎo)致線粒體斷裂的原因之一，提示OPA1對線粒體融合有非常重要的作用。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimics和WT-OPA1至心肌細(xì)胞時(shí)相對熒光素酶活性顯著降低；此外，上調(diào)或下調(diào)miR-27b-3p時(shí)，OPA1蛋白表達(dá)明顯降低或升高(P<0.05)，提示miR-27b-3p直接負(fù)向調(diào)控OPA1蛋白表達(dá)。在抑制miR-27b-3p表達(dá)的基礎(chǔ)上沉默OPA1表達(dá)，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞OPA1、MFN1、MFN2、VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α下調(diào)，Beclin-1、Bnip3上調(diào)，線粒體ROS升高，ATP和ΔΨm降低(P<0.05)，上述各項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示抑制miR-27b-3p對心力衰竭模型心肌細(xì)胞線粒體融合的促進(jìn)作用與靶向負(fù)調(diào)控OPA1蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-27b-3p在心力衰竭模型心肌組織中高表達(dá)，抑制miR-27b-3p促進(jìn)心肌細(xì)胞線粒體融合，其機(jī)制與負(fù)向調(diào)節(jié)OPA1蛋白水平有關(guān)，為心力衰竭的臨床治療提供參考依據(jù)。