大鯢源遲緩愛(ài)德華菌的生物學(xué)特性及其感染的病理?yè)p傷

向 菲，郭向輝，康振亞，馮 楊，歐陽(yáng)萍，陳德芳，黃小麗，耿 毅*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130）

大鯢(Andrias davidianus)俗名“娃娃魚”，屬兩棲綱（Amphibian）有尾目（Caudata）隱鰓鯢科（Crypto?branchidae）大鯢屬(Andrias)，為國(guó)家瀕危二級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物，已被列入瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約(CITES公約)附錄Ⅰ中[1]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值，同時(shí)也是研究生物進(jìn)化機(jī)制的好材料[2]。隨著大鯢繁殖技術(shù)的成熟，人工養(yǎng)殖在我國(guó)華中、西南及西北等地區(qū)快速發(fā)展,并逐步成為地方優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)，但在大鯢養(yǎng)殖的發(fā)展過(guò)程中疾病的制約作用也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，以大鯢蛙病毒（CGSRV）[3-4]、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[5]、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)[6]和類志賀鄰單胞菌(Plesiomo?nas shigelloides)[7]等生物性病原的危害較大。

遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda）隸屬于腸桿菌科的愛(ài)德華菌屬，是一種革蘭氏陰性、短桿狀、能運(yùn)動(dòng)的機(jī)會(huì)致病菌[8]，通常在水溫高、水質(zhì)差和有機(jī)物含量高等條件下引發(fā)疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害[9]。該菌可感染鰻鱺（Anguilla japonica）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、黃顙魚（Pelteobagrus ful?vidraco）、大菱鲆（Scophthatmus maximus）、中華鱉(Trionyx sinensis)和牛蛙(Rana catesbiana)等多種水生動(dòng)物[10]。本研究從四川雅安與都江堰兩養(yǎng)殖場(chǎng)的患病大鯢體內(nèi)分離到兩株優(yōu)勢(shì)菌（XY01、XY02），根據(jù)形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析鑒定為遲緩愛(ài)德華菌，并對(duì)分離菌的藥物敏感性、毒力基因及其感染的病理?yè)p傷進(jìn)行測(cè)定分析，以期為大鯢遲緩愛(ài)德華菌感染的防治提供參考，同時(shí)也為闡釋其致病機(jī)制提供資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 患病大鯢

患病大鯢來(lái)自四川雅安和都江堰兩養(yǎng)殖場(chǎng)，體重(1.8±0.3)kg。

1.1.2 主要試劑

LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 DNA marker和PCR master mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與形態(tài)學(xué)觀察

在無(wú)菌條件下，從病死大鯢的肝、腎、腹水取樣接種LB瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24～48 h，挑取形態(tài)大小一致的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落在LB平板上再次劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株，并觀察其菌落與菌體形態(tài)特征，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌生理生化特性與藥物敏感性測(cè)定

生理生化特性測(cè)定采用微量生化法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]進(jìn)行。藥敏試驗(yàn)采用K-B法，將菌液均勻涂布平板，28℃培養(yǎng)24 h測(cè)定抑菌圈的直徑并判定結(jié)果，根據(jù)杭州微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行判定。

1.2.3 分離菌16S rDNA基因序列分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液，離心收集菌體，提取細(xì)菌基因組DNA作為模板。采用一對(duì)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物[13]（F：5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGCTACCTTGTTACG AC-3′）PCR擴(kuò)增16S rDNA基因，預(yù)期擴(kuò)增片段大小 約 1 500 bp。 PCR 反 應(yīng) 體 系 ：12.5 μL mix，8.5 μL ddH2O，2 μL primer，2 μL 模板DNA。循環(huán)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后測(cè)序。將測(cè)序獲得序列在GenBank中經(jīng)Blast比對(duì)，選取相似性較高的序列，采用Clustal M進(jìn)行多序列同源性比對(duì)(Multiple alignments)，按鄰接法(Neighbor-joining method)用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 分離菌毒力基因的PCR檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[14]，合成遲緩愛(ài)德華菌的citC、fimA、gadB、katB、mukF和esrB毒力基因的PCR檢測(cè)引物（表1），檢測(cè)分離菌相關(guān)毒力基因攜帶情況。

表1 PCR檢測(cè)毒力相關(guān)基因的引物Table.1 The primers of PCR detection for virulence-related genes

1.2.5 組織病理學(xué)觀察

取患病大鯢心、肝、脾、腎、腸和肌肉等組織，10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并照相記錄。

2 結(jié)果

2.1 患病大鯢的病理剖檢

患病大鯢腹部膨脹，肛門紅腫，腹部及尾部皮膚灶性褪色、發(fā)白，黏液減少，甚至壞死形成潰爛，后肢腿部腫大，趾間出血，發(fā)紅(圖1a)；腹腔內(nèi)充滿大量含血腹水(圖1b)；肝臟血管擴(kuò)張淤血，腫大，呈土黃色(圖1c)；脾臟腫脹、淤血呈暗紅色，表面見(jiàn)大小不等的白色結(jié)節(jié)(圖1d)；腎臟腫大，淤血，偶見(jiàn)出血點(diǎn)(圖1e)；腸道充血，腸腔內(nèi)無(wú)食物，充滿多量黏液，腸壁變薄(圖1f)。

圖1 患病大鯢剖檢變化Figure 1 Necropsy changes of diseased giant salamander

2.2 病原菌分離與形態(tài)特征

從兩地患病大鯢體內(nèi)分別分離到一株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（XY01、XY02），在LB平板上呈灰白色、光滑、濕潤(rùn)、圓形的半透明狀。菌體呈革蘭陰性、無(wú)莢膜，直徑 1 μm，長(zhǎng)2～3 μm的短桿菌（圖2）。

圖2 細(xì)菌革蘭染色結(jié)果Figure 2 Gram stain result of bacteria

2.3 分離菌生理生化特性及藥物敏感性

分離菌XY01、XY02的生理生化特性見(jiàn)表2，與E.tarda[11]的生理生化特性基本一致。藥敏結(jié)果（表3）顯示：兩分離菌株對(duì)羅紅霉素、阿莫西林、萬(wàn)古霉素、卡那霉素和復(fù)方新諾明等耐藥；對(duì)氧氟沙星、頭孢西丁、氟苯尼考、慶大霉素和多黏菌素-B等敏感，但兩分離株在多西環(huán)素、四環(huán)素與頭孢他啶等藥物的敏感性上存在一定差異,詳見(jiàn)表2。

表2 分離株XY01、XY02生理生化特性Table 2 Biochemical and physiological characteristics of the isolated strain XY01 and XY02

表3 XY01、XY02藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of isolated strain XY01 and XY02

2.4 分離菌16S rDNA基因序列分析

PCR擴(kuò)增出兩分離菌株XY01和XY02的16S rDNA基因片段，測(cè)序后序列提交至NCBI，登錄號(hào)為MW672113和MW694894。在GenBank中經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩分離菌株XY01、XY02與遲緩愛(ài)德華菌的同源性最高，再以兩分離菌及Genbank中愛(ài)德華菌屬相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，分離菌株XY01和XY02與遲緩愛(ài)德華菌聚為一簇。

圖3 基于分離菌基與相關(guān)菌株16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree based on16SrDNA sequence of isolates(XY01、XY02)and other related species in Edwardsiella genus

2.5 致病性相關(guān)毒力基因的PCR檢測(cè)

對(duì)兩分離株XY01、XY02進(jìn)行6種毒力基因（citC、fimA、gadB、katB、mukF、esrB）的PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4，表明兩分離菌均攜帶6種毒力基因。

圖4 兩分離菌株（XY01、XY02）毒力基因的PCR檢測(cè)電泳圖Figure 4 The electropherogram of PCR detection virulence genes in two isolates(XY01、XY02)

2.6 組織病理學(xué)觀察

肝細(xì)胞廣泛性空泡變性，并發(fā)生壞死形成壞死灶，大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5a）；脾臟紅白髓界限不清，毛細(xì)血管與脾竇擴(kuò)張淤血，脾髓淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，散在大小不等的壞死灶（圖5b）；腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小囊內(nèi)大量淡紅染滲出物及一定量炎癥細(xì)胞；腎小管上皮細(xì)胞腫脹，顆粒變性甚至發(fā)生壞死；腎間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血，出血，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5c）；腸黏膜上皮細(xì)胞壞死，脫落，固有膜裸露，固有膜、黏膜下層及肌層大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5d）；心肌纖維顆粒變性、空泡變性，甚至壞死，形成壞死灶，并在一些壞死灶內(nèi)見(jiàn)藍(lán)染的細(xì)菌團(tuán)塊；肌間隙增寬，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5e）；骨骼肌間隙增寬，水腫，間隙內(nèi)充滯大量淡紅染的水腫液，肌纖維變性、壞死，橫紋消失，肌漿凝固，均質(zhì)紅染（圖5f）。

圖5 患病大鯢組織病理?yè)p傷Figure 5 Histopathological lesions of diseased giant salamander

3 討論

遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda）1965年由W.H.Ewing等命名[15]，廣泛存在于自然界，尤其是水環(huán)境中，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物重要的病原菌[10,16]，感染的水生動(dòng)物超過(guò)25種，給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也是鳥類、兩棲類、爬行類以及人類的病原菌[17-18]。本研究中，從患病大鯢體內(nèi)分離鑒定了2株遲緩愛(ài)德華菌，進(jìn)一步的毒力基因檢查發(fā)現(xiàn)兩分離菌株citC、fimA、gadB、katB、mukF和esrB均為陽(yáng)性，而毒力基因（citC、fimA、gadB、katB、mukF和esrB）的存在與否被認(rèn)為是判定該菌為致病株或非致病株的重要依據(jù)[19]，由此可見(jiàn)，分離菌株XY01、XY02是致病菌株，臨床上感染的大鯢不僅出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，同時(shí)發(fā)生死亡也證明了這一點(diǎn)。本研究表明遲緩愛(ài)德華可自然感染大鯢，并引起死亡，因此，在大鯢的養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)重視該菌的危害，加強(qiáng)防控。

現(xiàn)有研究表明，遲緩愛(ài)德華菌感染魚類的主要組織病理?yè)p傷為化膿性間質(zhì)性腎炎與化膿性肝炎[8]，但本研究中發(fā)現(xiàn)感染大鯢的組織病理?yè)p傷主要表現(xiàn)為變質(zhì)肝炎、滲出性腎小球腎炎與間質(zhì)性腎炎，與魚類的組織病理?yè)p傷特點(diǎn)存在差異，同時(shí)感染大鯢還表現(xiàn)出明顯的腸炎與壞死性脾炎等與魚類存在明顯的差異，這可能與宿主的種屬差異有關(guān)。吳中明等[20]研究發(fā)現(xiàn)遲緩愛(ài)德華菌感染大鯢在多組織器官均有細(xì)菌團(tuán)塊的聚集，表明該菌可在大鯢體內(nèi)多組織、器官定殖，從而引起病理?yè)p傷，甚至導(dǎo)致死亡，在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)感染大鯢全身多組織出現(xiàn)明顯的損傷與炎癥反應(yīng)，尤其是肝、脾、腎和腸的病理?yè)p傷較為嚴(yán)重，并在損傷的心肌中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌團(tuán)塊，進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。感染大鯢在臨床上出現(xiàn)明顯的腹水與后肢腫大等臨床特征，可能是由于肝、腎嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)損傷引起蛋白合成障礙、腎小球?yàn)V過(guò)性增強(qiáng)、腎小管重吸收能力降低等致血管內(nèi)外液體交換及球-管失衡，從而使鈉、水在體內(nèi)潴留出現(xiàn)水腫所致。

盡管大菱鲆遲緩愛(ài)德華菌活疫苗在我國(guó)已獲批上市，但目前還未開展該疫苗對(duì)其他水生動(dòng)物遲緩愛(ài)德華菌感染預(yù)防的免疫效應(yīng)評(píng)價(jià)[21-22]，抗菌藥物的使用仍是目前防治大鯢等水生動(dòng)物遲緩愛(ài)德華菌感染的重要手段。本研究中發(fā)現(xiàn)兩地的分離株對(duì)氧氟沙星、頭孢西丁、氟苯尼考、慶大霉素和多黏菌素-B等敏感，據(jù)此采用氟苯尼考內(nèi)服進(jìn)行治療，很好地控制了疫情。值得注意的是兩地分離的菌株在頭孢他啶、頭孢呋辛、多西環(huán)素與新霉素等藥物的敏感性上存在一定差異，因此，在治療該菌感染時(shí)應(yīng)根據(jù)藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果選擇用藥，避免藥物濫用，確保有效用藥，同時(shí)降低細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，Peng B.等[23]通過(guò)對(duì)具有耐藥性的遲緩愛(ài)德華菌代謝狀態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)外源性丙氨酸或葡萄糖可使細(xì)菌恢復(fù)對(duì)卡那霉素的敏感性；Zeng Z.H.等[24]發(fā)現(xiàn)葡萄糖通過(guò)代謝重編程增強(qiáng)了羅非魚抵抗遲緩愛(ài)德華菌侵襲的能力；G.P.Richards[25]也闡述了噬菌體被用于治療遲緩愛(ài)德華菌病及其他細(xì)菌病的有效性，這些環(huán)境友好型防控方法的不斷探索，有望為今后愛(ài)德華菌感染的有效防控提供新的策略。