日糧精粗比對青海黑藏羊小腸營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體基因表達水平的影響

周 力，張峰碩，張春梅，楊葆春，桂林生*，王志有*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

反芻動物對小肽、氨基酸和單糖的吸收起始于小腸，并由小腸上皮細胞中相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)載體轉(zhuǎn)運到血液循環(huán)供應(yīng)機體新陳代謝的需要。小腸主要由十二指腸、空腸和回腸組成，雖然不同區(qū)段小腸組織形態(tài)學(xué)的特征較為相近，但對營養(yǎng)素分子的消化吸收能力卻有所不同[1]。小腸消化吸收能力主要取決于其組織形態(tài)發(fā)育、轉(zhuǎn)運載體的數(shù)量以及活性等[2]。

適宜的營養(yǎng)物質(zhì)攝入水平不僅可以促進小腸的生長發(fā)育[3]，同時還能調(diào)節(jié)相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體的表達量來促進對氨基酸與小肽的轉(zhuǎn)運[4]。小肽轉(zhuǎn)運載體1（Peptide transporter 1,PEPT1）基因主要在小腸中高度表達，在小肽的吸收過程中起著關(guān)鍵作用[5]。鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 1（Sodium-dependent glucose transporters 1,SGLT1）不僅在葡萄糖的吸收方面發(fā)揮著重要作用，還能參與細胞自救，防止細胞凋亡等[6-7]。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（Glucose transporter,GLUTs）作為哺乳動物細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要載體，其中以葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）在機體內(nèi)的分布最為廣泛[8]。蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2（Januskinase 2,JAK2）主要負責(zé)參與細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程[9]。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)黑藏羊腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體相關(guān)基因mRNA表達規(guī)律研究的報道，一定程度上制約了肉羊產(chǎn)業(yè)向集約化、現(xiàn)代化方向發(fā)展。黑藏羊作為藏羊品種中一個重要的經(jīng)濟類群，同時也是寶貴的高原種質(zhì)資源，具有體格強健、繁殖性能好以及生長發(fā)育快等特點，肉質(zhì)以高蛋白、低脂肪、營養(yǎng)價值全面以及微量元素豐富等而深受消費者青睞[10]。因此，研究黑藏羊腸道組織中PEPT1、SGLT1、GLUT1及JAK2基因的mRNA表達模式對于了解營養(yǎng)物質(zhì)吸收以及推動青海特色畜牧業(yè)的發(fā)展都具有重要意義。

為此，本試驗擬以平均海拔3 100 m地區(qū)的青海貴南黑藏羊作為試驗對象，通過對比小腸組織中營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體相關(guān)基因mRNA表達水平的差異，有助于進一步了解小腸對氨基酸、小肽以及葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)吸收的分子機理，可為今后生產(chǎn)實踐中有關(guān)綿羊營養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗選用發(fā)育良好、體重（10.45±0.96）kg相近的青海貴南黑藏羊公羔60只，按完全隨機區(qū)組設(shè)計分為3組，每組20只，單欄飼養(yǎng)。分別飼喂70%精料補充料+30%粗料（HC組）、50%精料補充料+50%粗料（MC組）和30%精料補充料+70%粗料（LC組）的基礎(chǔ)日糧。試驗共計128 d，其中預(yù)試期8 d，正試期120d。日糧配方參考中國《肉羊飼養(yǎng)標準》（NY/T 816-2004）進行配制[11]，具體配方組成見表1。粗飼料由燕麥青貯和燕麥青干草按干物質(zhì)各占1/2組成。試驗期間每天08:00和17:30將精料與粗料攪拌均勻后飼喂2次，自由采食和自由飲水，其他飼養(yǎng)管理按照羊場的規(guī)定嚴格執(zhí)行。

表1 飼料配方組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Feed formula composition and nutritional level（dry matter basis）

1.2 樣品采集

試驗結(jié)束時，每組中隨機選取5只試驗羊在禁食12 h、禁水2 h后按照頸靜脈放血方式進行屠宰，屠宰1 h內(nèi)沿縱向剖開腹腔，準確找到十二指腸、空腸和回腸的黏膜層組織，剪開腸段，然后用4℃預(yù)冷的無菌生理鹽水將內(nèi)容物沖洗掉，分別裝入1.5 mL離心管中，經(jīng)液氮速凍后帶回實驗室移到-80℃冰箱保存待檢。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA的提取及檢測

按照Trizol法提取動物組織中總RNA，采用超微量核酸蛋白測定儀測定的總RNA濃度和純度A260 nm/A280 nm）。根據(jù)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的完整性，根據(jù)5 S rRNA、18 S rRNA和28 S rRNA的亮度判斷樣品RNA是否存在降解現(xiàn)象。

以黑藏羊腸道不同區(qū)段的cDNA為模板，在羅氏LightCyler 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)。反應(yīng)體系：正、反向引物（50 μmol/L）各0.1 μL，cDNA 模板 2 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，RNase free ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)條件:95 ℃10 min,95℃15 s,60℃30 s,循環(huán)數(shù)為40。

1.3.2 cDNA合成

常規(guī)組患者予以常規(guī)的治療,主要針對患者禁食嚴格控制,實施腹腔引流,減輕患者腸胃負擔(dān),并對患者予以腸胃營養(yǎng)供給。觀察組患者則予以手術(shù)治療,針對患者粘連和感染程度確定手術(shù)方案,并加強患者術(shù)后切口的護理和感染預(yù)防工作?；颊咴谥委熎陂g予以優(yōu)質(zhì)、綜合性和針對性的護理方案,提高患者治療效果。

總RNA經(jīng)質(zhì)檢合格后，使用第一鏈cDNA Syn?thesis Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。試驗在冰上進行，取RNase free ddH2O、5×RT Buffer、RT Enzyme Mix、dNTPs（10 mmol/L,each）、Oligo（dT）15（50 μmol/L）、Random hexamers（50 μmol/L）和 模 板 RNA 組 成50 μL反應(yīng)體系，具體操作步驟按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，將所得cDNA保存于-20℃冰箱待測。

根據(jù)GenBank中的基因序列，通過Primer 6.0軟件設(shè)計PCR引物，引物序列由上海生工進行合成。引物序列、產(chǎn)物長度及退火溫度如表2所示。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作為內(nèi)參基因，以PEPT1、SGLT1、GLUT1和JAK2作為目的基因進行相對定量分析。

1.3.3 引物序列及合成

通過函數(shù)調(diào)用，將上市公司全稱與境外投資企業(yè)名稱進行精確匹配；處理上市公司名稱，刪除 “集團”、“股份”、“控股”、“有限”、“公司”等字樣，再一次進行模糊匹配；進一步利用關(guān)聯(lián)交易文件確定上市公司與對外直接投資企業(yè)間是否存在關(guān)聯(lián)關(guān)系。本文認為其母子公司或同一集團控股子公司間接參與對外直接投資活動，符合本文研究上市公司對外直接投資活動對整個企業(yè)集團績效影響的初衷。

表2 引物信息Table 2 Primer Information

黑藏羊十二指腸基因相對表達量結(jié)果如圖3所示。HC組十二指腸的PEPT1基因mRNA相對表達量顯著高于LC組（P<0.05），較MC組差異不顯著（P>0.05）。MC組和LC組十二指腸的SGLT1和GLUT1基因mRNA相對表達量極顯著低于HC組（P<0.01），而MC組與LC組間差異極不顯著（P>0.01）。不同組間十二指腸的JAK2基因mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

四個月以前，楚墨再一次遇到靜秋。三個月以前，楚墨給了靜秋一個結(jié)實的擁抱。兩個月以前，楚墨對靜秋說，他仍然愛她，像大學(xué)時候一樣愛她。一個月以前，楚墨將靜秋擁到懷里深吻。兩個人天真地認為他們都會守住最后的底線，然而，在對方的身體面前，他們不堪一擊。

各樣品引物PCR擴增的Ct由各自的擴增曲線分別得出，采用2-ΔΔCt法[12]計算目的基因的mRNA相對表達豐度，并通過GraphPad Prism 7.0軟件進行繪圖，試驗結(jié)果以“平均數(shù)±標準差（mean±SD）”表示，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

(1)(2)中的這些恒等式就是3階幻方中常見的一次恒等式了.接下來，我們就要以這些一次恒等式為基礎(chǔ)建立二次、三次恒等式.

[3]陸張維,徐麗華,等.基于GIS的中心城區(qū)建設(shè)用地適宜性評價-以浙江省杭州市為例[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016(6):488-492.

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量及反轉(zhuǎn)錄效果

GAPDH、PEPT1、SGLT1、GLUT1及JAK2基因?qū)崟r熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2所示。根據(jù)表2給出的產(chǎn)物大小對應(yīng)相應(yīng)條帶進行判定，即為目的基因擴增產(chǎn)物。

圖1 試驗總RNA凝膠電泳圖Figure 1 Total RNA gel electrophoresis

2.2 實時熒光定量PCR電泳圖

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)黑藏羊十二指腸、空腸和回腸的總RNA濃度均在1.8～2.0之間，樣品質(zhì)量符合后續(xù)試驗條件。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖1），發(fā)現(xiàn)提取的未降解RNA樣品可見清晰28S、18S，且亮度比基本為2:1。說明所提取的RNA純度較高，質(zhì)量較為可靠。

根據(jù)E· 杰克遜· 鮑爾于1960年提出的輿論形成的七個步驟，江蘇衛(wèi)視《非誠勿擾》的輿論形成過程可分為如下幾步：(1)來自社會各界的男女嘉賓秉持著共同的目標——尋找異性伴侶，來到江蘇衛(wèi)視《非誠勿擾》的舞臺；(2)舞臺上，男女嘉賓提出各自觀點，產(chǎn)生沖突、爭論；(3)主持人從中調(diào)和，專家做出分析；(4)主持人做出總結(jié)，可作為節(jié)目制播方的權(quán)威性決定，形成場內(nèi)輿論；(5)輿論話題延伸到場外，形成場外輿論，持續(xù)時間長；(6)場內(nèi)輿論和場外輿論相結(jié)合，形成《非誠勿擾》輿論網(wǎng)絡(luò)。如圖3。

圖2 實時熒光定量PCR電泳圖Figure 2 Real-time quantitative PCR electrophoresis

2.3 黑藏羊小腸組織PEPT1、SGLT1、GLUT1和JAK2基因的mRNA相對表達豐度

1.3.4 RT-qPCR反應(yīng)體系和程序

圖3 黑藏羊十二指腸中營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體基因的mRNA相對含量Figure 3 mRNA relative content of nutrient transporter gene in duodenum of black Tibetan sheep

黑藏羊空腸基因相對表達量結(jié)果如圖4所示。各組間空腸的PEPT1基因mRNA相對表達量表現(xiàn)為：HC組>LC>MC，但均差異不顯著（P>0.05）。HC組空腸的SGLT1基因mRNA相對表達量極顯著高于MC組和LC組（P<0.01），而MC組和LC組間差異極不顯著（P>0.01）。MC和LC組空腸的GLUT1基因mRNA相對表達量極顯著低于HC組（P<0.01），同時MC組和LC組間差異顯著（P<0.05）。各組間空腸的JAK2基因mRNA相對表達量差異不顯著（P>0.05）。

圖4 黑藏羊空腸中營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體基因的mRNA相對含量Figure 4 mRNA relative content of nutrient transporter gene in jejunum of black Tibetan sheep

黑藏羊回腸基因相對表達量結(jié)果如圖5所示。MC組與LC組回腸的PEPT1基因mRNA相對表達量極顯著低于HC組（P<0.01），同時MC組與LC組間差異極不顯著（P>0.01）。HC組回腸的SGLT1和JAK2基因相對表達量均高于MC組與LC組，其中HC組和MC組間差異達到顯著水平（P<0.05）。各組間GLUT1基因相對表達量差異不顯著（P>0.05）

圖5 黑藏羊回腸中營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體基因的mRNA相對含量Figure 5 mRNA relative content of nutrient transporter gene in ileum of black Tibetan sheep

3 討論與結(jié)論

幼齡時期處于反芻動物生命周期中的關(guān)鍵階段，在此期間，必須高度重視能量、蛋白質(zhì)含量以及比例的供給情況，會直接影響到機體今后的生長發(fā)育狀況[13]。機體的生長發(fā)育不僅取決于的營養(yǎng)物質(zhì)攝入量，而且和小腸消化吸收的能力息息相關(guān)[14]。據(jù)報道，小腸上皮細胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體的表達量能夠直接影響?zhàn)B分的吸收[15]，所以反芻動物消化吸收的能力可以通過小腸運載體基因表達豐度來反映。目前關(guān)于日糧組成與反芻動物腸道相關(guān)基因表達量的研究報道相對較少，因此，研究日糧精粗比對黑藏羊腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運載體基因表達量的影響，對于改善綿羊生長發(fā)育具有重要意義。

小肽轉(zhuǎn)運載體1（PEPT1）在腸道內(nèi)參與小肽的吸收[16]，同時對氨基酸轉(zhuǎn)運以及機體免疫也存在一定影響[17]。以肉雞為研究對象[18]，發(fā)現(xiàn)蛋白水平為18%組與24%組腸道PEPT1基因mRNA的表達豐度顯著高于蛋白水平為12%組。唐德富等[19]試驗表明，16%蛋白組十二指腸和空腸PEPT1基因mRNA的表達量顯著低于20%蛋白組，同時其空腸的表達量顯著低于18%蛋白組。其他試驗也進一步證實，精粗比為75∶25飼糧的荷斯坦犢牛十二指腸、空腸PEPT1基因mRNA的表達豐度極顯著高于精粗比為65∶35飼糧[20]。上述研究結(jié)論與本試驗結(jié)果類似，本試驗中，HC組十二指腸、空腸及回腸PEPT1基因表達量均高于其他2組，其中十二指腸、回腸差異顯著或極顯著。其原因可能是：首先提高精料量的使得內(nèi)源消化蛋白質(zhì)的酶量隨之相應(yīng)增加，促進了腸道載體的表達[21]，其次蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物（如氨基酸、小肽和單糖等）對載體的表達具有調(diào)節(jié)作用[22]。進入小腸的碳水化合物在消化酶作用下，被降解為葡萄糖，而單糖需相應(yīng)的轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運才能被吸收。小腸上皮細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運載體數(shù)量及活性能夠隨著腸腔中葡萄糖濃度的增加而提高[23]。在轉(zhuǎn)運葡萄糖過程中SGLT1扮演著重要的角色，也是反映小腸對營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力的重要指標，且受腸腔中營養(yǎng)素的調(diào)控[24]。從本試驗結(jié)果來看，MC組與LC組十二指腸、空腸SGLT1基因表達量極顯著低于HC組，同時，MC組回腸的SGLT1基因表達量顯著低于HC組。說明HC組所攝入的精料量相較于其他2組在瘤胃中降解速度更慢，且能更多地到達小腸，被其消化酶進一步消化產(chǎn)生的葡萄糖較多，繼而促進了葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因的高度表達，以提供更多葡萄糖轉(zhuǎn)運載體用于對葡萄糖的消化吸收，這與HC組十二指腸、空腸及回腸SGLT1基因mRNA表達量均顯著高于MC組和LC組相吻合，進一步證實了SGLT1基因能促進反芻動物對于葡萄糖的吸收。

GLUT1能夠提供葡萄糖跨膜運輸來生成ATP以及合成大分子，同時也轉(zhuǎn)運其他如半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺等物質(zhì)[25]。適宜的精粗比日糧能夠提高母羊?qū)w維素的分解能力，繼而促進葡萄糖的生成[26]。在大鼠上研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞外葡萄糖濃度增加時，能夠提高細胞膜上GLUT1的表達[27]。占今舜等[28]同樣證實，精粗比為65∶35組犢牛的肝臟、瘤胃、十二指腸和盲腸GLUT1基因的mRNA相對表達量顯著高于精粗比為60∶40組。本研究結(jié)果顯示，HC組十二指腸與空腸GLUT1基因的表達量極顯著高于MC組與LC組。另外發(fā)現(xiàn)各組間回腸GLUT1基因的表達量無顯著影響，這與上述人員的研究結(jié)論具有相似之處。由此推測十二指腸與空腸可能是糖類消化吸收的主要場所，導(dǎo)致進入回腸內(nèi)葡萄糖的濃度下降，進而造成回腸GLUT1基因的表達量在不同組間差異不顯著。這進一步表明精粗比為70∶30的日糧更利于黑藏羊吸收葡萄糖以供應(yīng)機體生長和發(fā)育的需要。在奶牛上研究發(fā)現(xiàn)[29]，與正常對照組（精粗比40∶60）相比，高精料組（精粗比60∶40）肝臟組織中GHR、JAK2、STAT5A和STAT5B基因的mRNA表達水平顯著下調(diào)。葉平生[30]在奶山羊上的研究也揭示，在高精料日糧的飼喂條件下，肝臟組織中GHR、JAK2和STAT5基因的mRNA表達水平均出現(xiàn)下調(diào)，其中JAK2基因的mRNA表達水平顯著下調(diào)。而在本試驗中，通過對小腸中JAK2基因的mRNA表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)十二指腸、空腸JAK2基因的mRNA表達量隨著日糧精料量的提高而增加，同時HC組回腸JAK2基因的mRNA表達量顯著高于MC組，這與上述人員的研究結(jié)論不一致。這可能由于當(dāng)日糧中精料占70%時，黑藏羊為了維持基本生命活動，上調(diào)JAK2基因的mRNA相對表達量，以增加回腸對小肽吸收所致。

綜上，在本試驗條件下，不同精粗比日糧能夠顯著影響黑藏羊小腸各段組織中PEPT1、SGLT1、GLUT1以及JAK2基因的mRNA表達豐度，可能會影響小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運吸收，其中以精粗比為70:30的日糧效果較佳。