肝癌患者化療栓塞術(shù)后早期外周血免疫細(xì)胞的變化

胡曉蕾 堯銀光 劉素霞

原發(fā)性肝癌（HCC）是常見惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年新發(fā)病例超過100萬例，其中我國(guó)約占40%，在所有惡性腫瘤發(fā)病率中占第3位［1］。肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）是目前應(yīng)用最廣泛的肝癌治療方式之一，也是巴塞羅那分期推薦的中期肝癌標(biāo)準(zhǔn)治療方式，亦用于無法行治愈性治療的早期肝癌［2］。但是，單純TACE有腫瘤壞死不完全、易復(fù)發(fā)、加重肝功能損害等局限性，影響患者的遠(yuǎn)期生存率。這與肝癌患者出現(xiàn)的機(jī)體抗腫瘤免疫缺陷，尤其是細(xì)胞免疫功能抑制密切相關(guān)［3］。本研究擬通過對(duì)HCC患者術(shù)后外周血免疫細(xì)胞組進(jìn)行檢測(cè)，了解患者術(shù)后細(xì)胞免疫功能的變化，為檢測(cè)患者術(shù)后的免疫指標(biāo)選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年7月至2016年3月本院行TACE治療的HCC患者36例，男30例，女6例；年齡28～86歲。診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦及哺乳期婦女；合并其他噬肝病毒感染及有重要器官疾病者（嚴(yán)重心、腎、甲狀腺疾病，糖尿病，精神病等），近6個(gè)月接受干擾素抗病毒及免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制藥物治療者。

1.2 主要試劑和儀器 熒光標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體 CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3PC5，CD11b FITC、CD15 RD1、CD14 PC5、CD45 PC7，CD4 PC7、CD127RD1、CD25 FITC、CD45 PC5，溶血素、鞘液、清洗液，BECKMAN COULTER Cytomics FC500 MCL型流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫爾特公司。

1.3 外周血細(xì)胞免疫表型檢測(cè) （1）標(biāo)本采集：分別于行化療栓塞術(shù)前24 h內(nèi)和術(shù)后72～96 h內(nèi)取外周靜脈血2 mL，置EDTA抗凝管，于6 h內(nèi)檢測(cè)。（2）T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：于流式管中加入單克隆抗體（CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5）10 μL，加入 100 mL血液，混勻后室溫避光溫育15 min。再加入0.5 mL溶血素混勻，避光溫育10 min后加0.5 mL鞘液上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。（3）CD45modCD11b+CD14-CD15-細(xì)胞的檢測(cè)：于流式管中加入單克隆抗體CD11b FITC和CD15 RD1 20 μL，CD14 PC5 和 CD45 PC7 10 μL，加入100 μL血液，混勻后室溫避光溫育15 min。再加入0.5 mL溶血素裂解紅細(xì)胞，避光溫育10 min后，用鞘液洗滌1次，加0.5 mL鞘液上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。（4）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的檢測(cè)：于流式管中加入單克隆抗體（CD4 PC7、CD127RD1、CD45 PC5各10 μL，CD25 FITC 20 μL，加入100 μL血液，混勻后室溫避光溫育15 min。再加入0.5 mL溶血素裂解紅細(xì)胞，避光溫育10 min后，用鞘液洗滌1次，加0.5 mL鞘液上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件，GraphPad Prism 5 Demo軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（）表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料用M（Q1，Q3）表示。手術(shù)前后的對(duì)比采用配對(duì)t檢驗(yàn)或配對(duì)秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料 肝癌患者在化療后WBC、N%、M%等各項(xiàng)指標(biāo)比化療前均有不同程度的上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 化療前和化療后患者的血細(xì)胞及肝功能比較

2.2 外 周 血 中Treg和CD45modCD11b+CD14-CD15-細(xì)胞的變化情況患者化療前和化療后的CD45modCD11b+CD14-CD15-差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.131，P=0.002），見圖1。而化療前后Treg比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.017，P=0.987），見圖2。

圖1 患者化療前后外周血Treg細(xì)胞占比

圖2 患者化療前后外周血CD45modCD11+CD14-CD15-細(xì)胞占比

2.3 外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況 CD4（Z=-1.523，P=0.128）、CD8（Z=-1.235，P=0.217）和CD4/CD8（Z=-0.163，P=0.871）手術(shù)前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3、4、5。

圖3 患者化療前后外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)

圖4 患者化療前后外周血CD8+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)

圖5 患者化療前后外周血CD4+/CD8+比值

3 討論

機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主，T淋巴細(xì)胞起主要調(diào)控作用，CD3陽性細(xì)胞代表總T淋巴細(xì)胞，CD4+和CD8+分別代表T淋巴細(xì)胞的兩個(gè)亞群，其中CD4+細(xì)胞為輔助T細(xì)胞，不僅可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以分泌大量細(xì)胞因子以提高CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，CD8+T細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞，分別具有殺傷腫瘤細(xì)胞和抑制機(jī)體免疫應(yīng)答的功能，正常情況下兩者處于動(dòng)態(tài)平衡，共同參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。但大多數(shù)腫瘤存在腫瘤免疫逃避機(jī)制，這也是腫瘤細(xì)胞在機(jī)體中難以被徹底清除的原因所在。髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在感染產(chǎn)生的免疫抑制環(huán)境和腫瘤誘發(fā)的免疫抑制過程中發(fā)揮重要作用［5-6］。MDSC主要由處于早期分化階段的髓系細(xì)胞組成，是一群具有異源性、可塑性的未成熟髓系細(xì)胞［7］，由于其表型在不同的疾病或研究報(bào)道中各不相同，目前只能通過其免疫抑制功能確認(rèn)。Treg在人的外周血及淋巴組織中約占CD4+T細(xì)胞的5%～10%，其中天然Treg（nTreg）大部分為CD4+CD25+Treg，以其表面高表達(dá)CD25，同時(shí)表達(dá)CD4，低表達(dá)CD127為特征［8］。

在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HCC患者行TACE術(shù)前后的T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)化療后CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞和CD4/CD8比值均低于化療前的檢測(cè)值，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能原因是標(biāo)本量較少。免疫表型進(jìn)一步的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Treg的表達(dá)在化療后比化療前有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本次實(shí)驗(yàn)根據(jù)MDSC為早期分化階段的髓系細(xì)胞的定義，檢測(cè)免疫表型為CD45modCD11b+CD14-CD15-的細(xì)胞在化療栓塞術(shù)后3天的變化，發(fā)現(xiàn)雖然化療后早期HCC患者外周血白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例均有不同程度的上升，但本實(shí)驗(yàn)中代表MDSC的CD45modCD11b+CD14-CD15-細(xì)胞在化療后的表達(dá)與化療前相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。作者認(rèn)為，在化療后早期，由于化療造成的組織細(xì)胞破壞必然引起機(jī)體的快速防御反應(yīng)，因此髓系系統(tǒng)的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞增多，然而反應(yīng)需更多時(shí)間的特異性免疫系統(tǒng)則未見明顯變化。本實(shí)驗(yàn)中處于早期分化階段的髓系細(xì)胞CD45modCD11b+CD14-CD15-細(xì)胞的明顯變化或許可提示MDSC能夠反映肝癌患者在接受化療栓塞術(shù)后早期的細(xì)胞免疫狀況的變化，進(jìn)而為患者的長(zhǎng)期預(yù)后提供預(yù)判。為證明這一點(diǎn)，需長(zhǎng)期隨訪患者，并納入更多的研究對(duì)象?；贛DSC在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，以及本實(shí)驗(yàn)中CD45modCD11b+CD14-CD15-細(xì)胞在肝癌患者化療后早期有明顯的變化，提示MDSC可能成為肝癌患者療效檢測(cè)和預(yù)后判斷的指標(biāo)尋找的切入點(diǎn)，值得進(jìn)一步探尋。