棗多糖提取物對環(huán)磷酰胺所致的蛋雛雞腸黏膜免疫屏障功能下降的緩解作用

郭林霞,馬可為,馮志華,劉彥慈,劉觀忠,李清艷,弓素梅,李樹鵬*,趙國先* （.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,河北 保定 07000；.保定職業(yè)技術學院,河北 保定 07000；.河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,河北 保定 07000）

近年來,動物免疫抑制嚴重阻礙了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。為了消除或緩解免疫抑制,增強動物免疫力,免疫增強劑得以廣泛運用。腸道是體內最大的淋巴組織,腸道免疫作用主要是通過腸黏膜屏障（機械、化學、生物和免疫屏障）功能來實現(xiàn)的,其中免疫屏障通過產(chǎn)生大量的免疫因子進而起到免疫清除腸道有害微生物或抗原的作用,以分泌型免疫球蛋白（SIg）A介導的體液免疫為主。研究表明,免疫抑制會導致畜禽腸黏膜免疫屏障受損,SIg A的分泌量降低[2-3],而植物多糖則可以有效緩解[4-5],但是目前就棗多糖提取物（JPE）對蛋雛雞腸黏膜SIg A的影響及其機理探究還鮮見報道。因此本試驗旨在通過探究JPE對環(huán)磷酰胺（Cy）所致的蛋雛雞腸黏膜免疫屏障功能下降的緩解作用,為其作為免疫增強劑的開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑1日齡京紅1號蛋雛雞,由河北環(huán)山農(nóng)牧有限公司提供；JPE,前期實驗室提??；Cy純度為98%,購自上海邁瑞爾化學技術有限公司。

1.2試驗設計本試驗采用單因子完全隨機試驗設計,另設空白對照（BC）組。選取體質量相近且健康的1日齡京紅1號蛋雞750只,適應飼養(yǎng)6 d后,隨機均分為5組,每組6個重復,每個重復25只雞,組間體質量差異不顯著。Ⅰ組為BC組,在8～10日齡時皮下注射0.35 m L生理鹽水,飼喂基礎飼糧。Ⅱ～Ⅴ組在8～10日齡皮下注射Cy 100 mg/kg,每天1次,誘導腸黏膜免疫屏障損傷,并從11日齡開始,分別飼喂含有0,400,800,1 600 mg/kg JPE的飼糧。試驗期為5周。基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎） %

1.3飼養(yǎng)管理進雛前對雞舍進行全面沖洗及消毒。試驗過程按養(yǎng)雞場的常規(guī)管理程序進行免疫、驅蟲、采光和通風。采食方式、飲水方式和雞群密度按雞場程序調整。各組均勻分布于3層階梯式雞籠,消除位置引起的誤差。試驗期內每天8:00和15:00各喂1次料,自由采食和飲水。每天觀察雞群健康狀況,記錄死雞和病雞數(shù)量。

1.4測定指標及方法

1.4.1空腸分泌因子含量 于試驗的最后1 d從每個重復中選取1只與平均體質量相近的雞,頸部放血致死,剖開腹腔,迅速截取空腸3 cm左右,用生理鹽水沖洗干凈,放入凍存管中,—80℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行IL-（2,4,5,6和10）、TGF-β、IFN-γ、Ig A、SIg A含量的測定。

1.4.2空腸TLR4 m RNA表達量 按1.4.1方法采集樣品,利用TRIzol法提取總RNA,電泳檢測質量,使用Nanodrop 2000超微量分光光度計測定RNA濃度及純度后,進行逆轉錄獲得cDNA的一條鏈,再以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）,每組3個重復。參考GenBank雞TLR4基因m RNA序列,利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計,以GAPDH為內參基因。引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。引物信息見表2。

表2 引物信息

1.4.3空腸荊豆凝集素1的蛋白表達量 M細胞為一種特殊的上皮細胞,荊豆凝集素1（UEA1）可特異的與M細胞結合,故利用標記的UEA1可以作為鑒別M細胞的依據(jù)[6-7]。UEA1的蛋白質表達量如下:樣品采集如1.4.1。將空腸組織切塊剪碎充分研磨后,加入10倍體積的RIPA裂解液在冰上裂解組織,4℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清,即為總蛋白溶液。按照試劑盒說明書抽提細胞核蛋白與細胞漿蛋白,按常規(guī)進行熱變性,依次進行SDSPAGE電泳、轉膜及封閉,加入一抗（UEA1抗體）,4℃孵育搖床過夜,加入二抗（HRP標記山羊抗兔）,室溫下孵育30 min,加入ECL發(fā)光液處理,并進行壓膠片、顯影、定影。利用蛋白質凝膠成像分析系統(tǒng)觀察個組蛋白質的相對表達量[8]。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理,用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析,并用Duncan’s法進行多重比較,P＞0.05表示差異不顯著,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。結果以“平均值±標準誤”的形式表示。

2 結果

2.1JPE對蛋雛雞空腸IgA和SIgA的影響

2.1.1Ig A 與Ⅰ組比,Ⅲ～Ⅴ組Ig A升高（P＜0.01）,Ⅱ組Ig A有下降趨勢（P＝0.09）；與Ⅱ組比,Ⅲ～Ⅴ組Ig A升高（P＜0.01）；Ⅳ組Ig A比Ⅲ、Ⅴ組高（P＜0.01）（表3）。

2.1.2SIg A 與Ⅰ組比,Ⅱ組SIg A降低（P＜0.05）,Ⅲ～Ⅴ組SIg A升高（P＜0.01）；與Ⅱ組比,Ⅲ～Ⅴ組SIg A升高（P＜0.01）；Ⅳ組SIg A比Ⅲ、Ⅴ組高（P＜0.01）。其他組間差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

表3 JPE對蛋雛雞空腸Ig A和SIg A的影響

2.2JPE對蛋雛雞空腸TLR4 mRNA表達量的影響與Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組比,Ⅳ和Ⅴ組TLR4升高（P＜0.01）；其他組間差異不顯著（P＞0.05）（表4）。

表4 JPE對蛋雛雞空腸TLR4 m RNA表達量的影響

2.3JPE對蛋雛雞空腸UEA1蛋白質表達量的影響與Ⅰ組和Ⅱ組比,Ⅲ～Ⅴ組UEA1升高,其中Ⅲ組差異顯著（P＜0.05）,其他差異極顯著（P＜0.01）；Ⅴ組較Ⅲ組和Ⅳ組高（P＜0.01）；其他組間差異不顯著（P＞0.05）（表5,圖1）。

圖1 JPE對UEA1表達量的影響

表5 JPE對蛋雛雞空腸UEA1蛋白質表達量的影響

2.4JPE對蛋雛雞空腸白介素分泌量的影響

2.4.1IL-2 與Ⅰ組和Ⅱ組比,Ⅲ～Ⅴ組升高（P＜0.01）；Ⅲ組和Ⅳ組比Ⅴ組高（P＜0.01）（表6）。

2.4.2IL-4 與Ⅰ組比,Ⅱ～Ⅴ組升高,其中Ⅱ組差異顯著（P＜0.05）,其他差異極顯著（P＜0.01）；與Ⅱ組比,Ⅲ～Ⅴ組升高（P＜0.01）；Ⅲ組和Ⅳ組IL-4比Ⅴ組高（P＜0.01）（表6）。

2.4.3IL-5 與Ⅰ組比,Ⅱ～Ⅴ組降低（P＜0.01）；與Ⅱ組比,Ⅲ～Ⅴ組升高（P＜0.01）（表6）。

2.4.4IL-6 與Ⅰ組比,Ⅱ～Ⅴ組降低,其中Ⅳ組差異顯著（P＜0.05）,其他差異極顯著（P＜0.01）；與Ⅱ組比,Ⅳ組和Ⅴ組升高（P＜0.01）；Ⅳ組（P＜0.01）和Ⅴ組（P＜0.05）比Ⅲ組高（表6）。

2.4.5IL-10 與Ⅰ組比,Ⅱ～Ⅴ組升高（P＜0.01）；與Ⅱ組比,Ⅲ～Ⅴ組升高（P＜0.01）；Ⅳ組比Ⅲ、Ⅴ組高（P＜0.01）,Ⅲ組比Ⅴ組高（P＜0.01）（表6）。

表6 JPE對蛋雛雞空腸白介素分泌量的影響 ng/g

2.5JPE對蛋雛雞空腸TGF-β和IFN-γ分泌量的影響

2.5.1TGF-β 與Ⅰ組和Ⅱ組比,Ⅲ～Ⅴ組升高（P＜0.01）；Ⅳ組比Ⅲ組（P＜0.05）和Ⅴ組（P＜0.01）高（表7）。

2.5.2IFN-γ 與Ⅰ組比,Ⅱ組（P＜0.01）、Ⅲ組（P＜0.05）和Ⅴ組（P＜0.01）降低；與Ⅱ組比,Ⅲ組和Ⅳ組升高（P＜0.01）；Ⅲ組和Ⅳ組比Ⅴ組高（P＜0.01）。其他組間差異不顯著（P＞0.05）（表7）。

表7 JPE對蛋雛雞空腸TGF-β和IFN-γ分泌量的影響 ng/g

3 討論

腸黏膜免疫屏障是動物體最重要的屏障之一,以SIg A介導的體液免疫為主[9]。研究表明,Cy可以顯著降低小腸中SIg A的含量[3,10],本試驗結果與此一致,說明空腸免疫屏障受損。研究表明,黨參多糖[4]和淫羊藿多糖[5]均可以顯著增加雛雞腸道中SIg A的含量。本試驗結果顯示,與Cy組比,JPE組中SIg A均顯著增加,均達到了BC組水平,說明JPE可以顯著緩解Cy導致的SIg A降低,進而緩解免疫屏障功能損傷。

Ig A是SIg A的重要組成部分,為了探究JPE促進SIg A產(chǎn)生的機理,本試驗對Ig A的含量進行到了測定。研究表明,Cy可以降低小鼠[11]和雛雞[2]腸道中Ig A的表達量或含量,本試驗結果表明,Cy可以使Ig A的含量下降,但未達到顯著水平,可能與作用時間和劑量有關。研究表明,魷魚墨多糖[11]和淫羊藿多糖[5]均可以顯著促進腸道中Ig A的分泌,本試驗結果與其一致,且JPE組達到了BC組水平。且Ig A含量隨著JPE濃度的增加先增加后減少,即存在最適添加量（800 mg/kg）,與SIg A變化一致,說明JPE通過提高Ig A促進SIg A的分泌。

為了探究JPE對Ig A分泌過程的具體影響,本試驗對各個階段的影響因子進行了測定。

3.1JPE對B細胞激活過程的影響為了探究JPE激活B細胞的途徑,本試驗測定了腸道TLR4 m RNA以及腸道黏膜免疫的前哨細胞-M細胞的含量（UEA1的表達量）。

免疫細胞只有通過免疫識別受體后才能介導Ig A的產(chǎn)生,并進一步分泌到腸腔,發(fā)揮獲得性免疫作用,TLR4則是一種重要的免疫細胞表面的識別受體[12]。研究表明,Cy可以降低小鼠小腸中TLR4 m RNA的表達量[13-14]。本試驗結果顯示,Cy對TLR4 mRNA表達量沒有顯著影響,可能與作用時間和試驗動物有關。研究表明,靈芝多糖[14]和冬蟲夏草多糖[15]均可以顯著緩解Cy導致的TLR4 m RNA的表達下降。本試驗結果表明,與Cy組相比,中高劑量JPE組TLR4 m RNA的表達量顯著增加,由此說明TLR4是JPE的受體之一。各個劑量JPE組TLR4 m RNA的表達量均達到了BC組水平,且添加800～1 600 mg/kg效果較好。

M細胞是一種特化的腸上皮細胞,是腸道黏膜免疫的前哨細胞,主要分散于派氏結（PPs）相關上皮細胞中,它可以從腸腔中攝取抗原,并將其轉運給抗原遞呈細胞,經(jīng)識別后轉運到PPs,進而激活淋巴細胞,啟動腸道黏膜免疫應答[16]。荊豆凝集素1（UEA1）可特異地與M細胞結合,標記的UEA1可以作為鑒別M細胞的依據(jù)[7]。研究表明,Cy可以顯著降低小鼠腸道中M細胞的數(shù)量[17]。本試驗結果顯示,Cy對UEA1的表達量（即M細胞數(shù)量）沒有顯著影響,可能與Cy的劑量及試驗動物有關,需要進一步驗證。JIANG等[17]試驗表明,香菇多糖可以促進小鼠腸上皮細胞分化M細胞,增強其抗原轉移能力,進而改善免疫抑制小鼠腸黏膜的免疫狀態(tài)。本試驗結果顯示,與Cy組比,JPE組的UEA1均顯著升高,即M細胞的數(shù)量增加,說明JPE可以通過促進M細胞的表達來提高抗原遞呈能力。JPE的各個劑量組的UEA1表達量均達到BC組水平,且以高劑量組效果最好。

3.2JPE對B細胞分化過程的影響B(tài)細胞分化過程中受到IFN-γ、TGF-β等細胞因子的調控。研究表明,Cy可以使雛雞[18]和小鼠[15]腸道IFN-γ的分泌量降低,本試驗結果與其一致,可能是因為Cy破壞了免疫細胞。左濤[12]和CHEN等[19]試驗結果顯示,小鼠和大鼠腸道IFN-γ的分泌不受Cy控制,可能與Cy的劑量和純度有關。畢師誠等[2]試驗中Cy顯著下調了雛雞十二指腸中TGF-β的含量；CHEN等[19]試驗顯示,Cy對大鼠小腸中TGF-β的含量沒有顯著影響,本試驗中Cy對雛雞空腸中的TGF-β也無顯著影響,可能與Cy的作用時間長短及其作用部位有關。

研究表明,參芪多糖[18]和黃連多糖[19]分別顯著促進雛雞空腸黏膜和大鼠小腸黏膜中IFN-γ的分泌。本試驗結果顯示,與Cy組比,低中劑量JPE組的IFN-γ極顯著增加,且中劑量JPE組的IFN-γ均達到BC組水平。而魷魚墨多糖[12]對小鼠腸道IFN-γ的分泌沒有顯著影響,可能與多糖的分子量、單糖組成以及多糖的糖苷鍵結構有關。玉屏風多糖和黃連多糖[19]均可以促進鼠小腸中TGF-β的分泌。在本試驗中,與Cy組比,JPE的各劑量組的TGF-β均極顯著升高,均達到了BC組水平,預示著JPE對免疫細胞功能具有改善作用。且TGF-β的含量隨著JPE質量濃度的增加先增加后減少,即存在最適添加量（800 mg/kg）。

3.3JPE對B細胞的IgA類別轉換過程的影響B(tài)

細胞的Ig A類別轉換過程受IL-2、IL-4、IL-5和TGF-β的調控。IL-2可促進B淋巴細胞分泌抗體。研究表明,Cy可使小鼠十二指腸和回腸的IL-2降低[10,15]。本試驗中Cy則對IL-2沒有顯著影響,可能與試驗動物和作用部位有關。靈芝多糖[14]和冬蟲小草多糖[15]可以顯著促進小鼠腸道IL-2的分泌,本試驗中各個劑量的JPE均可顯著促進IL-2的分泌,并均恢復到BC組水平,且400～800 mg/kg效果較好。

IFN-γ和IL-4是調節(jié)SIg A分泌的主要細胞因子,分別是輔助性T細胞TH（1和2）的代表因子。研究表明,Cy可以使雛雞空腸黏膜[20]和小鼠小腸[14]的IL-4含量顯著下降。而本試驗中Cy使IL-4含量顯著升高,與上述結果不一致,可能是因為本試驗中Cy導致IFN-γ含量降低,進而使得IFN-γ對IL-4拮抗作用減弱[21],造成IL-4/IFN-γ失調,以此導致TH1和TH2的平衡狀態(tài)被破壞,使得TH2細胞占優(yōu)勢,引起異常的免疫反應。研究表明,參芪多糖[20]和猴頭菇多糖[22]可分別使雛雞空腸黏膜和雛鴨十二指腸中的IL-4升高。本試驗結果顯示,與Cy組比,JPE的各個劑量組中IL-4均極顯著升高,與上述結果一致。由此說明,JPE通過促進IL-4和IFN-γ的增加促使TH1和TH2細胞趨于平衡,維持免疫系統(tǒng)正常運行。JPE的各個劑量組的IL-4均恢復到BC組水平,且添加400～800 mg/kg效果較好。

IL-5是B細胞生長因子[23],可以協(xié)同TGF-β促進B淋巴細胞增殖,促進Ig A的產(chǎn)生。本試驗中,Cy使IL-5含量顯著降低,而對TGF-β則沒有顯著影響,由此得出,Cy通過降低IL-5導致Ig A的產(chǎn)生受阻。研究表明,猴頭菇多糖[24]和霍山石斛多糖[25]可分別促進番鴨十二指腸和小鼠空腸分泌IL-5。本試驗結果顯示,與Cy組比,JPE的各個劑量組中IL-5極顯著升高,與上述結果一致。結合TGF-β的結果,得出JPE通過促進IL-5和TGF-β的分泌來促進B淋巴細胞增殖,進而促進Ig A的產(chǎn)生。且JPE的各個劑量組IL-5均未達到BC組水平,可能是添加量不夠。

3.4JPE對B細胞終末分化過程的影響B(tài)細胞終末分化過程主要受IL-6和IL-10的調控[12]。IL-6促進漿細胞的終末分化,并可以將免疫球蛋白的產(chǎn)量提高6～8倍[11]。據(jù)報道,Cy可使雛雞[2]和小鼠[12]腸道中IL-6的含量下降,本試驗結果與此一致,說明Cy通過影響IL-6的分泌來影響B(tài)細胞的終末分化過程。研究表明,魷魚墨多糖[12]和太子參多糖[10]可以促進IL-6的表達。本試驗結果顯示,與Cy組比,中和高劑量JPE組顯著升高,說明JPE可以顯著緩解Cy導致的IL-6的減少,且存在劑量相關性。JPE各個劑量組IL-6均未達到BC組水平,可能是添加量不夠。

IL-10可促進B細胞分化增殖[26]。研究表明,Cy可使小鼠腸道中IL-10的含量下降[15],而本試驗中Cy組的IL-10較BC組顯著升高,可能與TH1和TH2細胞因子失衡有關。枸杞多糖[27]促進鼠腸道中IL-10的分泌,本試驗結果顯示,與Cy組比,JPE的各個劑量組均極顯著升高,均達到BC組水平,且IL-10隨著JPE劑量的增加先增加后降低,即存在最適添加量（800 mg/kg）。