• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    棗多糖提取物對環(huán)磷酰胺所致的蛋雛雞腸黏膜免疫屏障功能下降的緩解作用

    2022-03-02 06:23:54郭林霞馬可為馮志華劉彥慈劉觀忠李清艷弓素梅李樹鵬趙國先河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院河北保定07000保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院河北保定07000河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院河北保定07000
    中國獸醫(yī)學(xué)報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:小鼠劑量

    郭林霞,馬可為,馮志華,劉彥慈,劉觀忠,李清艷,弓素梅,李樹鵬*,趙國先* (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,河北 保定 07000;.保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北 保定 07000;.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 07000)

    近年來,動物免疫抑制嚴重阻礙了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。為了消除或緩解免疫抑制,增強動物免疫力,免疫增強劑得以廣泛運用。腸道是體內(nèi)最大的淋巴組織,腸道免疫作用主要是通過腸黏膜屏障(機械、化學(xué)、生物和免疫屏障)功能來實現(xiàn)的,其中免疫屏障通過產(chǎn)生大量的免疫因子進而起到免疫清除腸道有害微生物或抗原的作用,以分泌型免疫球蛋白(SIg)A介導(dǎo)的體液免疫為主。研究表明,免疫抑制會導(dǎo)致畜禽腸黏膜免疫屏障受損,SIg A的分泌量降低[2-3],而植物多糖則可以有效緩解[4-5],但是目前就棗多糖提取物(JPE)對蛋雛雞腸黏膜SIg A的影響及其機理探究還鮮見報道。因此本試驗旨在通過探究JPE對環(huán)磷酰胺(Cy)所致的蛋雛雞腸黏膜免疫屏障功能下降的緩解作用,為其作為免疫增強劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實驗動物與主要試劑1日齡京紅1號蛋雛雞,由河北環(huán)山農(nóng)牧有限公司提供;JPE,前期實驗室提??;Cy純度為98%,購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。

    1.2試驗設(shè)計本試驗采用單因子完全隨機試驗設(shè)計,另設(shè)空白對照(BC)組。選取體質(zhì)量相近且健康的1日齡京紅1號蛋雞750只,適應(yīng)飼養(yǎng)6 d后,隨機均分為5組,每組6個重復(fù),每個重復(fù)25只雞,組間體質(zhì)量差異不顯著。Ⅰ組為BC組,在8~10日齡時皮下注射0.35 m L生理鹽水,飼喂基礎(chǔ)飼糧。Ⅱ~Ⅴ組在8~10日齡皮下注射Cy 100 mg/kg,每天1次,誘導(dǎo)腸黏膜免疫屏障損傷,并從11日齡開始,分別飼喂含有0,400,800,1 600 mg/kg JPE的飼糧。試驗期為5周?;A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

    表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

    1.3飼養(yǎng)管理進雛前對雞舍進行全面沖洗及消毒。試驗過程按養(yǎng)雞場的常規(guī)管理程序進行免疫、驅(qū)蟲、采光和通風(fēng)。采食方式、飲水方式和雞群密度按雞場程序調(diào)整。各組均勻分布于3層階梯式雞籠,消除位置引起的誤差。試驗期內(nèi)每天8:00和15:00各喂1次料,自由采食和飲水。每天觀察雞群健康狀況,記錄死雞和病雞數(shù)量。

    1.4測定指標及方法

    1.4.1空腸分泌因子含量 于試驗的最后1 d從每個重復(fù)中選取1只與平均體質(zhì)量相近的雞,頸部放血致死,剖開腹腔,迅速截取空腸3 cm左右,用生理鹽水沖洗干凈,放入凍存管中,—80℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行IL-(2,4,5,6和10)、TGF-β、IFN-γ、Ig A、SIg A含量的測定。

    1.4.2空腸TLR4 m RNA表達量 按1.4.1方法采集樣品,利用TRIzol法提取總RNA,電泳檢測質(zhì)量,使用Nanodrop 2000超微量分光光度計測定RNA濃度及純度后,進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的一條鏈,再以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR),每組3個重復(fù)。參考GenBank雞TLR4基因m RNA序列,利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計,以GAPDH為內(nèi)參基因。引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。引物信息見表2。

    表2 引物信息

    1.4.3空腸荊豆凝集素1的蛋白表達量 M細胞為一種特殊的上皮細胞,荊豆凝集素1(UEA1)可特異的與M細胞結(jié)合,故利用標記的UEA1可以作為鑒別M細胞的依據(jù)[6-7]。UEA1的蛋白質(zhì)表達量如下:樣品采集如1.4.1。將空腸組織切塊剪碎充分研磨后,加入10倍體積的RIPA裂解液在冰上裂解組織,4℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清,即為總蛋白溶液。按照試劑盒說明書抽提細胞核蛋白與細胞漿蛋白,按常規(guī)進行熱變性,依次進行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉,加入一抗(UEA1抗體),4℃孵育搖床過夜,加入二抗(HRP標記山羊抗兔),室溫下孵育30 min,加入ECL發(fā)光液處理,并進行壓膠片、顯影、定影。利用蛋白質(zhì)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察個組蛋白質(zhì)的相對表達量[8]。

    1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理,用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析,并用Duncan’s法進行多重比較,P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。結(jié)果以“平均值±標準誤”的形式表示。

    2 結(jié)果

    2.1JPE對蛋雛雞空腸IgA和SIgA的影響

    2.1.1Ig A 與Ⅰ組比,Ⅲ~Ⅴ組Ig A升高(P<0.01),Ⅱ組Ig A有下降趨勢(P=0.09);與Ⅱ組比,Ⅲ~Ⅴ組Ig A升高(P<0.01);Ⅳ組Ig A比Ⅲ、Ⅴ組高(P<0.01)(表3)。

    2.1.2SIg A 與Ⅰ組比,Ⅱ組SIg A降低(P<0.05),Ⅲ~Ⅴ組SIg A升高(P<0.01);與Ⅱ組比,Ⅲ~Ⅴ組SIg A升高(P<0.01);Ⅳ組SIg A比Ⅲ、Ⅴ組高(P<0.01)。其他組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

    表3 JPE對蛋雛雞空腸Ig A和SIg A的影響

    2.2JPE對蛋雛雞空腸TLR4 mRNA表達量的影響與Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組比,Ⅳ和Ⅴ組TLR4升高(P<0.01);其他組間差異不顯著(P>0.05)(表4)。

    表4 JPE對蛋雛雞空腸TLR4 m RNA表達量的影響

    2.3JPE對蛋雛雞空腸UEA1蛋白質(zhì)表達量的影響與Ⅰ組和Ⅱ組比,Ⅲ~Ⅴ組UEA1升高,其中Ⅲ組差異顯著(P<0.05),其他差異極顯著(P<0.01);Ⅴ組較Ⅲ組和Ⅳ組高(P<0.01);其他組間差異不顯著(P>0.05)(表5,圖1)。

    圖1 JPE對UEA1表達量的影響

    表5 JPE對蛋雛雞空腸UEA1蛋白質(zhì)表達量的影響

    2.4JPE對蛋雛雞空腸白介素分泌量的影響

    2.4.1IL-2 與Ⅰ組和Ⅱ組比,Ⅲ~Ⅴ組升高(P<0.01);Ⅲ組和Ⅳ組比Ⅴ組高(P<0.01)(表6)。

    2.4.2IL-4 與Ⅰ組比,Ⅱ~Ⅴ組升高,其中Ⅱ組差異顯著(P<0.05),其他差異極顯著(P<0.01);與Ⅱ組比,Ⅲ~Ⅴ組升高(P<0.01);Ⅲ組和Ⅳ組IL-4比Ⅴ組高(P<0.01)(表6)。

    2.4.3IL-5 與Ⅰ組比,Ⅱ~Ⅴ組降低(P<0.01);與Ⅱ組比,Ⅲ~Ⅴ組升高(P<0.01)(表6)。

    2.4.4IL-6 與Ⅰ組比,Ⅱ~Ⅴ組降低,其中Ⅳ組差異顯著(P<0.05),其他差異極顯著(P<0.01);與Ⅱ組比,Ⅳ組和Ⅴ組升高(P<0.01);Ⅳ組(P<0.01)和Ⅴ組(P<0.05)比Ⅲ組高(表6)。

    2.4.5IL-10 與Ⅰ組比,Ⅱ~Ⅴ組升高(P<0.01);與Ⅱ組比,Ⅲ~Ⅴ組升高(P<0.01);Ⅳ組比Ⅲ、Ⅴ組高(P<0.01),Ⅲ組比Ⅴ組高(P<0.01)(表6)。

    表6 JPE對蛋雛雞空腸白介素分泌量的影響 ng/g

    2.5JPE對蛋雛雞空腸TGF-β和IFN-γ分泌量的影響

    2.5.1TGF-β 與Ⅰ組和Ⅱ組比,Ⅲ~Ⅴ組升高(P<0.01);Ⅳ組比Ⅲ組(P<0.05)和Ⅴ組(P<0.01)高(表7)。

    2.5.2IFN-γ 與Ⅰ組比,Ⅱ組(P<0.01)、Ⅲ組(P<0.05)和Ⅴ組(P<0.01)降低;與Ⅱ組比,Ⅲ組和Ⅳ組升高(P<0.01);Ⅲ組和Ⅳ組比Ⅴ組高(P<0.01)。其他組間差異不顯著(P>0.05)(表7)。

    表7 JPE對蛋雛雞空腸TGF-β和IFN-γ分泌量的影響 ng/g

    3 討論

    腸黏膜免疫屏障是動物體最重要的屏障之一,以SIg A介導(dǎo)的體液免疫為主[9]。研究表明,Cy可以顯著降低小腸中SIg A的含量[3,10],本試驗結(jié)果與此一致,說明空腸免疫屏障受損。研究表明,黨參多糖[4]和淫羊藿多糖[5]均可以顯著增加雛雞腸道中SIg A的含量。本試驗結(jié)果顯示,與Cy組比,JPE組中SIg A均顯著增加,均達到了BC組水平,說明JPE可以顯著緩解Cy導(dǎo)致的SIg A降低,進而緩解免疫屏障功能損傷。

    Ig A是SIg A的重要組成部分,為了探究JPE促進SIg A產(chǎn)生的機理,本試驗對Ig A的含量進行到了測定。研究表明,Cy可以降低小鼠[11]和雛雞[2]腸道中Ig A的表達量或含量,本試驗結(jié)果表明,Cy可以使Ig A的含量下降,但未達到顯著水平,可能與作用時間和劑量有關(guān)。研究表明,魷魚墨多糖[11]和淫羊藿多糖[5]均可以顯著促進腸道中Ig A的分泌,本試驗結(jié)果與其一致,且JPE組達到了BC組水平。且Ig A含量隨著JPE濃度的增加先增加后減少,即存在最適添加量(800 mg/kg),與SIg A變化一致,說明JPE通過提高Ig A促進SIg A的分泌。

    為了探究JPE對Ig A分泌過程的具體影響,本試驗對各個階段的影響因子進行了測定。

    3.1JPE對B細胞激活過程的影響為了探究JPE激活B細胞的途徑,本試驗測定了腸道TLR4 m RNA以及腸道黏膜免疫的前哨細胞-M細胞的含量(UEA1的表達量)。

    免疫細胞只有通過免疫識別受體后才能介導(dǎo)Ig A的產(chǎn)生,并進一步分泌到腸腔,發(fā)揮獲得性免疫作用,TLR4則是一種重要的免疫細胞表面的識別受體[12]。研究表明,Cy可以降低小鼠小腸中TLR4 m RNA的表達量[13-14]。本試驗結(jié)果顯示,Cy對TLR4 mRNA表達量沒有顯著影響,可能與作用時間和試驗動物有關(guān)。研究表明,靈芝多糖[14]和冬蟲夏草多糖[15]均可以顯著緩解Cy導(dǎo)致的TLR4 m RNA的表達下降。本試驗結(jié)果表明,與Cy組相比,中高劑量JPE組TLR4 m RNA的表達量顯著增加,由此說明TLR4是JPE的受體之一。各個劑量JPE組TLR4 m RNA的表達量均達到了BC組水平,且添加800~1 600 mg/kg效果較好。

    M細胞是一種特化的腸上皮細胞,是腸道黏膜免疫的前哨細胞,主要分散于派氏結(jié)(PPs)相關(guān)上皮細胞中,它可以從腸腔中攝取抗原,并將其轉(zhuǎn)運給抗原遞呈細胞,經(jīng)識別后轉(zhuǎn)運到PPs,進而激活淋巴細胞,啟動腸道黏膜免疫應(yīng)答[16]。荊豆凝集素1(UEA1)可特異地與M細胞結(jié)合,標記的UEA1可以作為鑒別M細胞的依據(jù)[7]。研究表明,Cy可以顯著降低小鼠腸道中M細胞的數(shù)量[17]。本試驗結(jié)果顯示,Cy對UEA1的表達量(即M細胞數(shù)量)沒有顯著影響,可能與Cy的劑量及試驗動物有關(guān),需要進一步驗證。JIANG等[17]試驗表明,香菇多糖可以促進小鼠腸上皮細胞分化M細胞,增強其抗原轉(zhuǎn)移能力,進而改善免疫抑制小鼠腸黏膜的免疫狀態(tài)。本試驗結(jié)果顯示,與Cy組比,JPE組的UEA1均顯著升高,即M細胞的數(shù)量增加,說明JPE可以通過促進M細胞的表達來提高抗原遞呈能力。JPE的各個劑量組的UEA1表達量均達到BC組水平,且以高劑量組效果最好。

    3.2JPE對B細胞分化過程的影響B(tài)細胞分化過程中受到IFN-γ、TGF-β等細胞因子的調(diào)控。研究表明,Cy可以使雛雞[18]和小鼠[15]腸道IFN-γ的分泌量降低,本試驗結(jié)果與其一致,可能是因為Cy破壞了免疫細胞。左濤[12]和CHEN等[19]試驗結(jié)果顯示,小鼠和大鼠腸道IFN-γ的分泌不受Cy控制,可能與Cy的劑量和純度有關(guān)。畢師誠等[2]試驗中Cy顯著下調(diào)了雛雞十二指腸中TGF-β的含量;CHEN等[19]試驗顯示,Cy對大鼠小腸中TGF-β的含量沒有顯著影響,本試驗中Cy對雛雞空腸中的TGF-β也無顯著影響,可能與Cy的作用時間長短及其作用部位有關(guān)。

    研究表明,參芪多糖[18]和黃連多糖[19]分別顯著促進雛雞空腸黏膜和大鼠小腸黏膜中IFN-γ的分泌。本試驗結(jié)果顯示,與Cy組比,低中劑量JPE組的IFN-γ極顯著增加,且中劑量JPE組的IFN-γ均達到BC組水平。而魷魚墨多糖[12]對小鼠腸道IFN-γ的分泌沒有顯著影響,可能與多糖的分子量、單糖組成以及多糖的糖苷鍵結(jié)構(gòu)有關(guān)。玉屏風(fēng)多糖和黃連多糖[19]均可以促進鼠小腸中TGF-β的分泌。在本試驗中,與Cy組比,JPE的各劑量組的TGF-β均極顯著升高,均達到了BC組水平,預(yù)示著JPE對免疫細胞功能具有改善作用。且TGF-β的含量隨著JPE質(zhì)量濃度的增加先增加后減少,即存在最適添加量(800 mg/kg)。

    3.3JPE對B細胞的IgA類別轉(zhuǎn)換過程的影響B(tài)

    細胞的Ig A類別轉(zhuǎn)換過程受IL-2、IL-4、IL-5和TGF-β的調(diào)控。IL-2可促進B淋巴細胞分泌抗體。研究表明,Cy可使小鼠十二指腸和回腸的IL-2降低[10,15]。本試驗中Cy則對IL-2沒有顯著影響,可能與試驗動物和作用部位有關(guān)。靈芝多糖[14]和冬蟲小草多糖[15]可以顯著促進小鼠腸道IL-2的分泌,本試驗中各個劑量的JPE均可顯著促進IL-2的分泌,并均恢復(fù)到BC組水平,且400~800 mg/kg效果較好。

    IFN-γ和IL-4是調(diào)節(jié)SIg A分泌的主要細胞因子,分別是輔助性T細胞TH(1和2)的代表因子。研究表明,Cy可以使雛雞空腸黏膜[20]和小鼠小腸[14]的IL-4含量顯著下降。而本試驗中Cy使IL-4含量顯著升高,與上述結(jié)果不一致,可能是因為本試驗中Cy導(dǎo)致IFN-γ含量降低,進而使得IFN-γ對IL-4拮抗作用減弱[21],造成IL-4/IFN-γ失調(diào),以此導(dǎo)致TH1和TH2的平衡狀態(tài)被破壞,使得TH2細胞占優(yōu)勢,引起異常的免疫反應(yīng)。研究表明,參芪多糖[20]和猴頭菇多糖[22]可分別使雛雞空腸黏膜和雛鴨十二指腸中的IL-4升高。本試驗結(jié)果顯示,與Cy組比,JPE的各個劑量組中IL-4均極顯著升高,與上述結(jié)果一致。由此說明,JPE通過促進IL-4和IFN-γ的增加促使TH1和TH2細胞趨于平衡,維持免疫系統(tǒng)正常運行。JPE的各個劑量組的IL-4均恢復(fù)到BC組水平,且添加400~800 mg/kg效果較好。

    IL-5是B細胞生長因子[23],可以協(xié)同TGF-β促進B淋巴細胞增殖,促進Ig A的產(chǎn)生。本試驗中,Cy使IL-5含量顯著降低,而對TGF-β則沒有顯著影響,由此得出,Cy通過降低IL-5導(dǎo)致Ig A的產(chǎn)生受阻。研究表明,猴頭菇多糖[24]和霍山石斛多糖[25]可分別促進番鴨十二指腸和小鼠空腸分泌IL-5。本試驗結(jié)果顯示,與Cy組比,JPE的各個劑量組中IL-5極顯著升高,與上述結(jié)果一致。結(jié)合TGF-β的結(jié)果,得出JPE通過促進IL-5和TGF-β的分泌來促進B淋巴細胞增殖,進而促進Ig A的產(chǎn)生。且JPE的各個劑量組IL-5均未達到BC組水平,可能是添加量不夠。

    3.4JPE對B細胞終末分化過程的影響B(tài)細胞終末分化過程主要受IL-6和IL-10的調(diào)控[12]。IL-6促進漿細胞的終末分化,并可以將免疫球蛋白的產(chǎn)量提高6~8倍[11]。據(jù)報道,Cy可使雛雞[2]和小鼠[12]腸道中IL-6的含量下降,本試驗結(jié)果與此一致,說明Cy通過影響IL-6的分泌來影響B(tài)細胞的終末分化過程。研究表明,魷魚墨多糖[12]和太子參多糖[10]可以促進IL-6的表達。本試驗結(jié)果顯示,與Cy組比,中和高劑量JPE組顯著升高,說明JPE可以顯著緩解Cy導(dǎo)致的IL-6的減少,且存在劑量相關(guān)性。JPE各個劑量組IL-6均未達到BC組水平,可能是添加量不夠。

    IL-10可促進B細胞分化增殖[26]。研究表明,Cy可使小鼠腸道中IL-10的含量下降[15],而本試驗中Cy組的IL-10較BC組顯著升高,可能與TH1和TH2細胞因子失衡有關(guān)。枸杞多糖[27]促進鼠腸道中IL-10的分泌,本試驗結(jié)果顯示,與Cy組比,JPE的各個劑量組均極顯著升高,均達到BC組水平,且IL-10隨著JPE劑量的增加先增加后降低,即存在最適添加量(800 mg/kg)。

    猜你喜歡
    小鼠劑量
    結(jié)合劑量,談輻射
    ·更正·
    全科護理(2022年10期)2022-12-26 21:19:15
    中藥的劑量越大、療效就一定越好嗎?
    不同濃度營養(yǎng)液對生菜管道水培的影響
    90Sr-90Y敷貼治療的EBT3膠片劑量驗證方法
    小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
    米小鼠和它的伙伴們
    Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
    加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細胞凋亡的保護作用
    高劑量型流感疫苗IIV3-HD對老年人防護作用優(yōu)于標準劑量型
    精品久久久久久久末码| 特级一级黄色大片| 国产三级中文精品| 国产av不卡久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产真实乱freesex| 真实男女啪啪啪动态图| 寂寞人妻少妇视频99o| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 嫩草影院新地址| 精品人妻熟女av久视频| av专区在线播放| 高清午夜精品一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 亚洲欧美清纯卡通| 国产大屁股一区二区在线视频| 岛国毛片在线播放| 日本色播在线视频| 嫩草影院新地址| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久久久久久中文| 欧美精品一区二区大全| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美色视频一区免费| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品1区2区在线观看.| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 午夜视频国产福利| 亚洲精品,欧美精品| 丰满乱子伦码专区| 久久99热6这里只有精品| 日韩欧美在线乱码| 精品人妻视频免费看| 一级二级三级毛片免费看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲av男天堂| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产高清三级在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 美女国产视频在线观看| 97热精品久久久久久| 内地一区二区视频在线| 国产av码专区亚洲av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 丝袜美腿在线中文| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产乱人偷精品视频| 国产精品1区2区在线观看.| 久久99热这里只有精品18| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品伦人一区二区| 日韩成人伦理影院| 国产av码专区亚洲av| 看非洲黑人一级黄片| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品永久免费网站| 日本黄大片高清| 亚洲18禁久久av| 日本欧美国产在线视频| 看片在线看免费视频| 国产乱人视频| 久久久久久大精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品国产高清国产av| 最新中文字幕久久久久| 亚洲国产最新在线播放| 天堂网av新在线| 1000部很黄的大片| 久久久精品94久久精品| 精品无人区乱码1区二区| 久久久欧美国产精品| 日日啪夜夜撸| 国产高清有码在线观看视频| 老女人水多毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日韩三级伦理在线观看| 99热6这里只有精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久99精品国语久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品久久电影中文字幕| 小说图片视频综合网站| 亚洲国产欧美人成| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲,欧美,日韩| 日韩欧美精品v在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 又爽又黄a免费视频| 国产熟女欧美一区二区| 欧美性猛交黑人性爽| 在线免费观看不下载黄p国产| 97超碰精品成人国产| 久久99精品国语久久久| 视频中文字幕在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本黄色视频三级网站网址| 男女国产视频网站| 午夜精品国产一区二区电影 | 成人无遮挡网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品熟女少妇av免费看| 激情 狠狠 欧美| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产私拍福利视频在线观看| 51国产日韩欧美| 看黄色毛片网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲五月天丁香| 十八禁国产超污无遮挡网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产精品久久视频播放| 可以在线观看毛片的网站| 国产三级中文精品| 久久99热这里只频精品6学生 | 免费看a级黄色片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人二区视频| 国产av码专区亚洲av| 九色成人免费人妻av| 精品无人区乱码1区二区| 不卡视频在线观看欧美| 色吧在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 天天一区二区日本电影三级| 精品一区二区免费观看| 久久精品夜色国产| 伦理电影大哥的女人| 久久久久久久久大av| 春色校园在线视频观看| 伦精品一区二区三区| 草草在线视频免费看| 国内精品宾馆在线| 国产伦在线观看视频一区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 色5月婷婷丁香| 26uuu在线亚洲综合色| 国产成人精品一,二区| 一区二区三区高清视频在线| 欧美zozozo另类| 国产在视频线在精品| 两个人的视频大全免费| 18禁在线播放成人免费| 又爽又黄a免费视频| 中文天堂在线官网| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲在线自拍视频| 国产不卡一卡二| 午夜免费激情av| 可以在线观看毛片的网站| 91aial.com中文字幕在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 久久久精品94久久精品| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品免费久久久久久久清纯| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日本与韩国留学比较| 嫩草影院入口| 91狼人影院| 国产精品av视频在线免费观看| 在现免费观看毛片| 少妇高潮的动态图| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 插逼视频在线观看| 一夜夜www| 亚洲人成网站高清观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 美女内射精品一级片tv| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人国产麻豆网| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久久久久久成人| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲av一区综合| 久久人妻av系列| 久久久午夜欧美精品| 亚洲国产精品成人综合色| 成人综合一区亚洲| www.色视频.com| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 能在线免费看毛片的网站| 秋霞伦理黄片| 七月丁香在线播放| 老司机福利观看| 亚洲av日韩在线播放| 一级毛片久久久久久久久女| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | av免费观看日本| 国产亚洲精品久久久com| 欧美日韩国产亚洲二区| 美女国产视频在线观看| 久热久热在线精品观看| 国内精品美女久久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 日韩av在线大香蕉| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 色综合站精品国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美日韩在线观看h| 一个人免费在线观看电影| 简卡轻食公司| 国产精品电影一区二区三区| 国产乱人视频| 免费观看性生交大片5| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲av免费高清在线观看| 99久久精品一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产成人精品婷婷| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产探花极品一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 超碰97精品在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产一区二区三区av在线| 青青草视频在线视频观看| 婷婷色av中文字幕| 日本熟妇午夜| 3wmmmm亚洲av在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 男女国产视频网站| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美成人精品欧美一级黄| 91久久精品电影网| 国产亚洲av嫩草精品影院| 高清视频免费观看一区二区 | 2021少妇久久久久久久久久久| 国产午夜精品论理片| 国产成年人精品一区二区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产毛片a区久久久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美一区二区国产精品久久精品| 干丝袜人妻中文字幕| 国产高清不卡午夜福利| 床上黄色一级片| 国产淫片久久久久久久久| 久久久精品大字幕| 大话2 男鬼变身卡| 免费av毛片视频| 午夜福利视频1000在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久99精品国语久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美区成人在线视频| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲成人久久爱视频| 国产午夜精品论理片| 欧美bdsm另类| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜精品一区二区三区免费看| 1000部很黄的大片| 一级毛片久久久久久久久女| av线在线观看网站| 午夜a级毛片| 国产视频内射| 亚洲av中文av极速乱| 一本一本综合久久| 亚洲电影在线观看av| 日韩av在线大香蕉| 岛国毛片在线播放| 成人午夜高清在线视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 97在线视频观看| 国产成人精品一,二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩精品青青久久久久久| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产成年人精品一区二区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产不卡一卡二| 日本黄色片子视频| 村上凉子中文字幕在线| 桃色一区二区三区在线观看| 中文天堂在线官网| 午夜爱爱视频在线播放| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 我要看日韩黄色一级片| 亚洲人成网站在线观看播放| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| a级毛片免费高清观看在线播放| 99热这里只有是精品50| 国产精品一区二区三区四区久久| 天堂网av新在线| 美女黄网站色视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品人妻视频免费看| a级毛色黄片| 亚洲av中文av极速乱| 国产人妻一区二区三区在| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲18禁久久av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 26uuu在线亚洲综合色| 久久草成人影院| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲一区高清亚洲精品| 黄片无遮挡物在线观看| 91精品国产九色| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 亚洲人成网站在线播| 成人三级黄色视频| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 欧美成人精品欧美一级黄| 少妇人妻一区二区三区视频| 如何舔出高潮| 看非洲黑人一级黄片| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 极品教师在线视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| eeuss影院久久| 成人二区视频| 26uuu在线亚洲综合色| 老司机福利观看| 日韩中字成人| 如何舔出高潮| 草草在线视频免费看| 欧美高清性xxxxhd video| av国产免费在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 91精品国产九色| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美丝袜亚洲另类| 2021天堂中文幕一二区在线观| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 在线观看av片永久免费下载| 少妇熟女欧美另类| 精品人妻视频免费看| 国产精品伦人一区二区| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 麻豆国产97在线/欧美| 99热精品在线国产| 日韩强制内射视频| 内射极品少妇av片p| 免费看美女性在线毛片视频| 日本熟妇午夜| 久久午夜福利片| 欧美区成人在线视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日韩高清综合在线| 永久网站在线| 国产人妻一区二区三区在| 中文字幕av成人在线电影| 少妇人妻精品综合一区二区| 只有这里有精品99| 中文字幕亚洲精品专区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品久久久久久久久久久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 我的女老师完整版在线观看| 精品久久久噜噜| 国产黄a三级三级三级人| 秋霞伦理黄片| 国产精品女同一区二区软件| 国产毛片a区久久久久| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲电影在线观看av| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 免费看av在线观看网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜久久久久精精品| 亚洲伊人久久精品综合 | 深夜a级毛片| 中文字幕制服av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产av一区在线观看免费| 亚洲欧洲国产日韩| 99热这里只有是精品50| 综合色av麻豆| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩av在线大香蕉| 国产精品久久久久久久电影| 简卡轻食公司| 亚洲自拍偷在线| 国产精品久久久久久久久免| 免费av毛片视频| 亚洲在线观看片| 久久精品综合一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 看十八女毛片水多多多| 午夜精品在线福利| 久久久久九九精品影院| 1000部很黄的大片| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 一夜夜www| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一本久久精品| ponron亚洲| 成年免费大片在线观看| 成人国产麻豆网| av在线老鸭窝| 久久精品综合一区二区三区| 免费看光身美女| 91久久精品国产一区二区成人| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本色播在线视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久久久久午夜电影| a级一级毛片免费在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 老司机影院毛片| 久久久久网色| 日本与韩国留学比较| 成年av动漫网址| 丰满人妻一区二区三区视频av| av专区在线播放| 免费大片18禁| 精品免费久久久久久久清纯| h日本视频在线播放| 插阴视频在线观看视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 嘟嘟电影网在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 成人一区二区视频在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产淫片久久久久久久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99热这里只有精品一区| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 久久精品影院6| 尾随美女入室| 偷拍熟女少妇极品色| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久久久久久午夜电影| 赤兔流量卡办理| 白带黄色成豆腐渣| 网址你懂的国产日韩在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产精品久久久久久av不卡| 三级经典国产精品| av卡一久久| 欧美最新免费一区二区三区| 插阴视频在线观看视频| 国产极品精品免费视频能看的| 男人和女人高潮做爰伦理| 永久网站在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 国产91av在线免费观看| 精品一区二区免费观看| 男女那种视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产又色又爽无遮挡免| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| .国产精品久久| 能在线免费看毛片的网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产亚洲精品久久久com| 欧美精品一区二区大全| 午夜激情福利司机影院| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 成人国产麻豆网| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品无大码| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 精品一区二区免费观看| 亚洲国产精品国产精品| 97超视频在线观看视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久99热这里只有精品18| 高清在线视频一区二区三区 | 麻豆成人午夜福利视频| ponron亚洲| 麻豆乱淫一区二区| 日本午夜av视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 久久久a久久爽久久v久久| 综合色av麻豆| 在线a可以看的网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品国产三级普通话版| 免费人成在线观看视频色| 岛国在线免费视频观看| av在线蜜桃| 婷婷色av中文字幕| 亚洲av福利一区| 伦精品一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 精品人妻视频免费看| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av一区综合| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲综合色惰| 尾随美女入室| 亚洲四区av| 日本色播在线视频| 免费人成在线观看视频色| 69av精品久久久久久| 我的老师免费观看完整版| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 大香蕉97超碰在线| 精华霜和精华液先用哪个| 精品国内亚洲2022精品成人| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 岛国毛片在线播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品久久久久久精品电影| 91精品一卡2卡3卡4卡| 男插女下体视频免费在线播放| 国产一区二区三区av在线| 成人综合一区亚洲| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲av日韩在线播放| 如何舔出高潮| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本黄色片子视频| 亚洲av成人av| 国产黄片美女视频| 国产乱来视频区| 黑人高潮一二区| 免费看光身美女| 熟女人妻精品中文字幕| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 欧美日韩精品成人综合77777| av专区在线播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品国产三级专区第一集| av在线老鸭窝| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久热精品热| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产黄色小视频在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 高清午夜精品一区二区三区| 欧美成人精品欧美一级黄| 色综合站精品国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品蜜桃在线观看| 成人特级av手机在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久久久久久久久免费av| 国产精品一二三区在线看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 午夜亚洲福利在线播放| 1000部很黄的大片| 国产乱人偷精品视频| 国产黄色小视频在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲美女视频黄频| 伦精品一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品一及| 久久鲁丝午夜福利片| 午夜激情福利司机影院| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 天美传媒精品一区二区| 久久久亚洲精品成人影院| 国产高清三级在线| 国产精品久久久久久av不卡|