廣西壯族自治區(qū)部分地區(qū)馬屬動(dòng)物梨形蟲感染的分子流行病學(xué)調(diào)查

周慶安,黃勝斌,莫?jiǎng)偬m,胡麗萍,韓銀華,何奇松,馬 琳,鐘華訓(xùn),韋顯凱,李劍靜,施開創(chuàng),李 軍,郭建剛*,李 健 （.廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西 南寧,53000；.岑溪?jiǎng)游镆卟☆A(yù)防控制中心,廣西 梧州,54300；3.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 00070）

馬梨形蟲?。╡puine piroplasmosis）是由駑巴貝斯蟲（Babesia caballi）和馬泰勒蟲（Theileria equi）寄生于馬屬動(dòng)物的紅細(xì)胞內(nèi)所引起的血液性原蟲病[1],屬于一種蜱媒傳染病。馬梨形蟲隸屬頂復(fù)門（Apicomplexa）梨形蟲亞綱（Piroplasmasina）梨形蟲目（Piroplasmida）巴貝斯科（Babesiidae）巴貝斯屬（Babesia）和泰勒科（Theileriidae）泰勒屬（Theileria）[2]。馬梨形蟲病以高熱、貧血、黃疸、淋巴結(jié)腫大、死亡等為主要臨床癥狀,呈全世界分布狀態(tài),主要分布在歐洲、非洲、亞洲、美洲等大部分熱帶及亞熱帶地區(qū)[3]。在我國東北、西北、西南、華南等地區(qū)均有馬梨形蟲病感染的報(bào)道[4-7]。中國養(yǎng)馬歷史悠久,馬文化底蘊(yùn)深厚,是養(yǎng)馬大國,據(jù)統(tǒng)計(jì)2019年全國馬存欄367.1萬匹,占世界總存欄數(shù)的6%,位居第5位[8],而廣西壯族自治區(qū)馬屬動(dòng)物養(yǎng)殖地區(qū)主要分布在防城港、百色、河池、崇左等山區(qū)地區(qū),主要以家庭散養(yǎng)方式為主。

18S r RNA基因是編碼真核生物核糖體小亞基的DNA序列,包括其中能體現(xiàn)種之間的親緣關(guān)系的保守序列區(qū)域,也包括能區(qū)分種間差異的變序列區(qū)域,因此用于種屬以上的分類分子標(biāo)志。巢式PCR分子方法可用于較多樣本的檢測(cè),較傳統(tǒng)的方法可以避免主觀因素的影響。梨形蟲病是影響?zhàn)B馬業(yè)和相關(guān)馬術(shù)比賽的發(fā)展,廣西對(duì)馬屬動(dòng)物的梨形蟲病調(diào)查較少,因此,本試驗(yàn)根據(jù)巴貝斯蟲和泰勒蟲18S r RNA保守基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物,運(yùn)用巢式PCR分子方法對(duì)馬屬動(dòng)物全血梨形蟲開展分子流行病學(xué)調(diào)查,為廣西壯族自治區(qū)馬屬動(dòng)物梨形蟲病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品信息于2019年1月至2020年10月在廣西壯族自治區(qū)防城港市、百色市、崇左市、河池市等4個(gè)地級(jí)市轄區(qū)的馬屬動(dòng)物進(jìn)行頸靜脈采集全血,置于EDTA真空抗凝管,混均勻后,冷藏保存,帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。各市馬屬動(dòng)物全血采集情況見表1。

表1 馬屬動(dòng)物全血采集信息表

1.2主要試劑及儀器TGuide S32磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒、2×Tap plus PCR Maste mix、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TGuide S32核酸抽提儀購自北京天根公司,DH5α感受態(tài)細(xì)胞、p MDTM18-T克隆載體、DL2000 DNA Marker購自Ta KaRa,Bionetra TONE PCR儀購自德國耶拿公司,UVITEC凝膠成像系統(tǒng)購自英國UVItec公司,電泳儀購自北京市六一儀器廠。

1.3引物合成運(yùn)用巢式PCR方法擴(kuò)增馬屬動(dòng)物梨形蟲原蟲18S r RNA部分基因,引物序列參考文獻(xiàn)[9]根據(jù)巴貝斯蟲和泰勒蟲18S r RNA基因序列信息設(shè)計(jì)的通用引物,引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.4全血核酸抽提取200μL馬屬動(dòng)物全血按照TGuide S32磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒說明書抽提核酸后,保存于—20℃待檢測(cè)。

1.5目的基因擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件運(yùn)用巢式PCR方法根擴(kuò)增目的基因,第1、2輪擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件一樣。反應(yīng)體系25μL:2×Taq Master Mix 12μL,dd H2O 9μL,上、下游特異性引物各0.5μL,抽提核酸3μL,第2輪PCR反應(yīng)體系模板為第1輪PCR產(chǎn)物。在95℃5 min；94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,34個(gè)循環(huán)；72℃10 min條件下運(yùn)行完成擴(kuò)增。取7μL第2輪PCR產(chǎn)物加入1.5%的瓊脂糖凝膠,放入電泳儀在100 V、66 m A條件下30 min電泳后,在凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有特異性亮帶。

1.6梨形蟲18S r RNA部分基因序列測(cè)序目的基因切割后,運(yùn)用大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收梨形蟲目的基因,并連接至p MDTM18-T載體,在16℃條件下過夜后,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。接種至LB固定培養(yǎng)基后挑選可疑陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng),再回收重組質(zhì)粒,經(jīng)鑒定是陽性后,送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司。

1.7序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立通過測(cè)序獲得的序列與NCBI中注冊(cè)的序列進(jìn)行同源性對(duì)比,分析所得的序列是否為目的基因以及梨形蟲病原體種類,并和GenBank上登錄的泰勒蟲和巴貝斯蟲18S r RNA基因序列相似度比較,選東方泰勒蟲（MH208642）、環(huán)形泰勒蟲（MG599091）、中華泰勒蟲（MT271905）、尤氏泰勒蟲（JF719835）、鹿泰勒蟲（KT959227）、綿羊泰勒蟲（MN493111）、呂氏泰勒蟲（LC326007）、牛巴貝斯蟲（KY805833）、莫氏巴貝斯蟲（AY260179）、卵形巴貝斯蟲（MN900525）、雙芽巴貝斯蟲（MH050358）、馬泰勒焦蟲（MH651216、MG052901）、Colpodellasp.（KT600661、MH20-8617）、C.tetrapymenae（AF330214）作 為 參 照 序列,選同為梨形蟲目的貓胞簇蟲（Cytauxzoon felis,L19080）作為外類群,用MEGA5.2軟件中的Neighbor-Joining Tree,經(jīng)過1 000次的Bootstrap計(jì)算,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1梨形蟲18S r RNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后,取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳后,在凝膠成像系統(tǒng)可觀察到約438 bp片段亮帶,與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

圖1 特異引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物

2.2各市馬屬動(dòng)物梨形蟲感染情況在4個(gè)市10個(gè)縣的馬屬動(dòng)物樣品中,除了憑祥市未檢出梨形蟲外,其他區(qū)域均檢出梨形蟲,平均感染為26.54%,最高感染率為76.47%。各市縣具體感染情況見表2。

表2 各地區(qū)梨形蟲感染情況 %

2.2梨形蟲感染種類情況及序列分析結(jié)果經(jīng)序列分析,NCBI序列比對(duì),序列分別與馬泰勒焦蟲、東方泰勒焦蟲、瑟氏泰勒焦蟲、Colpodellasp.、Sarcocystis gjerde相似度較高,其中馬泰勒焦蟲30株、東方泰勒焦蟲7株、瑟氏泰勒焦蟲2株、Colpodellasp.3株、Sarcocystis gjerdei1株?；?8S r RNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹得出2個(gè)大分支:泰勒蟲屬、巴貝斯蟲屬分支和Colpodellasp.分支。相應(yīng)的種類分別與該病原相似度較高的參考序列在同一小分支（圖2）。

圖2 基于18S r RNA基因梨形蟲不同種類的進(jìn)化樹

3 討論

馬梨形蟲是國際馬病疫情監(jiān)測(cè)病種之一,近幾年一些國家偶有發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)該病[10]。目前,通過常規(guī)監(jiān)測(cè)可以有效預(yù)防梨形蟲病。本次對(duì)廣西壯族自治區(qū)防城港、崇左、百色、河池等地區(qū)的馬屬動(dòng)物梨形蟲進(jìn)行監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)平均感染率為26.54%,馬泰勒焦蟲為優(yōu)勢(shì)種,未監(jiān)測(cè)出弩巴貝斯蟲,較新疆部分地區(qū)的馬屬動(dòng)物略低[5],比鄰省廣東省、云南省部分地區(qū)的馬屬動(dòng)物感染率略高[6-7]。廣西壯族自治區(qū)防城港、崇左、百色、河池等一些區(qū)域地處山區(qū),且防城港、崇左、百色地處中越邊境,邊境線較長,與越南接壤,而越南邊境地區(qū)動(dòng)物防疫薄弱,會(huì)增加馬梨形蟲病傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)。

本次馬屬動(dòng)物梨形蟲的監(jiān)測(cè)運(yùn)用巢氏PCR方法檢測(cè),并進(jìn)行基因測(cè)序與NCBI相關(guān)種類相似度比較。在所成功的序列中除了與泰勒焦蟲屬的馬泰勒焦蟲、東方泰勒焦蟲和瑟氏泰勒焦蟲種類相似度較高外,還有1株與肉孢子屬的種類相似度高達(dá)99.77%以及3株Colpodellasp.Colpodellids門與頂體復(fù)合物門相近的一個(gè)姊妹世系,形態(tài)很相似[11]。Colpodellasp.是一種人畜共患的新發(fā)病原體,2012年在我國昆明首次發(fā)現(xiàn)Colpodellaspp.樣病原體感染人的病例[12],在一些動(dòng)物的排泄物、小牛腹瀉物、鴕鳥排泄物中的卵囊、人類的血液、蜱蟲均分離到Colpodellaspp.[11-13],這次在靖西和那坡的馬屬動(dòng)物也檢到Colpodellasp.,與參靠序列同源性相似度為98%,同屬于進(jìn)化分支。

以上調(diào)查結(jié)果及序列分析表明,廣西部分馬屬動(dòng)物梨形蟲攜帶率高,種類多,還涉及一種人獸共患新發(fā)病原體,因此在防治馬屬動(dòng)物血液原蟲的同時(shí),也引起公共衛(wèi)生的足夠重視。