條斑紫菜丙酮酸羧化酶基因表達(dá)對(duì)不同碳源的響應(yīng)

劉雪瑩, 王廣策, 張寶玉, 宮相忠

條斑紫菜丙酮酸羧化酶基因表達(dá)對(duì)不同碳源的響應(yīng)

劉雪瑩1, 2, 3, 4, 王廣策2, 3, 4, 張寶玉2, 3, 4, 宮相忠1

(1. 中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 4. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PYC)在非光合生物中催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸(oxaloacetate, OAA), 作為糖異生的第一步, 在動(dòng)物維持代謝穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn), PYC在光合生物中也發(fā)揮重要作用。為了探究PYC在潮間帶大型海藻中的作用, 我們從條斑紫菜葉狀體中擴(kuò)增獲得基因全長(zhǎng)序列(命名為), 并分析了其序列特征。通過(guò)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明PyPYC與來(lái)自細(xì)菌的PYC具有較近親緣關(guān)系。針對(duì)條斑紫菜葉狀體生長(zhǎng)環(huán)境所面臨的碳源變化, 設(shè)置了不同類(lèi)型和不同濃度的無(wú)機(jī)碳培養(yǎng)條件, 采用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-qPCR)檢測(cè)了該基因?qū)@些無(wú)機(jī)碳源的響應(yīng)。結(jié)果表明, 高濃度的CO2能顯著上調(diào)基因的表達(dá), 而高濃度的HCO3?對(duì)其影響較小。由此, 我們初步認(rèn)為, 當(dāng)紫菜葉狀體暴露在空氣中時(shí), PYC在其無(wú)機(jī)碳利用中發(fā)揮一定作用。

丙酮酸羧化酶; 條斑紫菜; 無(wú)機(jī)碳利用

條斑紫菜()是屬于原紅藻綱 (Protoflorideae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紫菜屬()的一種大型海藻, 是東南亞地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)海藻之一。它的生活史是由絲狀孢子體和葉狀配子體組成, 屬于異型世代交替[1-2]。紫菜營(yíng)養(yǎng)豐富, 富含氨基酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸及多種微量元素, 是低脂肪高蛋白的健康綠色食品; 因其含有豐富的多糖尤其是瓊膠, 也使其成為重要的化工原料; 紫菜除了經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外, 其葉狀體在生長(zhǎng)過(guò)程中可大量吸收 C、N、P等, 是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的碳庫(kù)、氮庫(kù)和磷庫(kù)[3]。紫菜作為潮間帶海藻, 野生型葉狀體隨潮汐變化會(huì)經(jīng)歷暴露在空氣中數(shù)小時(shí)和沒(méi)入水中的生境變化, 在規(guī)模化養(yǎng)殖過(guò)程中, 漁民也需要定期將紫菜苗簾暴露在空氣中以去除雜藻及提高品質(zhì)[4]。為更深入了解紫菜, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)紫菜的生活史、影響生長(zhǎng)因素、抗逆和代謝產(chǎn)物等方面開(kāi)展了大量的研究, 使之逐漸成為研究紅藻的代表性物種[5-7]。

丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase, PYC)最早在雞的肝臟線粒體中發(fā)現(xiàn)[8], 后來(lái)在非光合生物真菌線粒體中也發(fā)現(xiàn)了PYC。它屬于生物素酶家族, 其特征是具有共價(jià)連接的生物素作為輔助因子, 依賴(lài)ATP, 催化丙酮酸和HCO3?生成草酰乙酸(oxaloacetate, OAA), 該反應(yīng)作為糖異生的第一步, 在動(dòng)物維持代謝穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[9]。如哺乳動(dòng)物中PYC的缺失會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)紊亂, 代謝性酸中毒或癌癥等多種代謝疾病[10-11]。缺乏基因的釀酒酵母()突變體在葡萄糖作為唯一碳源時(shí), 不能存活[12-13]。1990年, 研究者在胡蘿卜、玉米、向日葵和油菜的細(xì)胞提取液發(fā)現(xiàn)了PYC活性, 首次證明了植物中PYC的存在, 但尚未明確其在植物不同部位或發(fā)育過(guò)程中的功能[14]。隨著研究技術(shù)的發(fā)展和水平的提高, PYC陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)存在微藻中[15-16]。Tsuji等[17]證實(shí)丙酮酸羧化酶存在海洋單細(xì)胞藻質(zhì)體中,m(米氏常數(shù): 酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)對(duì)應(yīng)的底物濃度)值顯示該質(zhì)體丙酮酸羧化酶對(duì)丙酮酸有較高的親和性, 主動(dòng)參與羧化用于回補(bǔ)OAA, 作者推測(cè)PYC或許在各種水生光合生物中起著不可或缺的作用。當(dāng)綠藻C-169培養(yǎng)在2% CO2環(huán)境時(shí), PYC的RNA水平和酶活均增加, 作者認(rèn)為PYC參與CO2固定進(jìn)而提高無(wú)機(jī)碳利用率[16]。綜上所述, PYC似乎在促進(jìn)水生光合生物無(wú)機(jī)碳利用方面發(fā)揮一定的作用, 到目前為止我們對(duì)此還是了解較少。我們前期在分析條斑紫菜葉狀體和絲狀體對(duì)不同無(wú)機(jī)碳響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)見(jiàn)國(guó)家基因庫(kù)https://db. cngb.org/cnsa/, 序列入口為CNP0000880)時(shí), 發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似于PYC 的unigene序列, TRINITY_DN105351_ c0_g1和TRINITY_DN15039_c0_g1, 但對(duì)該基因及相應(yīng)蛋白的特點(diǎn), 以及在紫菜中發(fā)揮的功能知之甚少, 因此本文對(duì)條斑紫菜丙酮酸羧化酶展開(kāi)詳細(xì)研究。

以條斑紫菜葉狀體cDNA為模板擴(kuò)增獲得基因全長(zhǎng)編碼區(qū)序列后, 與來(lái)自其他物種的丙酮酸羧化酶核酸及蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析, 明確序列特征。同時(shí)用加富CO2的空氣或改變?nèi)斯ずＫ蠳aHCO3濃度方式設(shè)置不同無(wú)機(jī)碳源條件培養(yǎng)紫菜葉狀體, 探究基因在條斑紫菜葉狀體無(wú)機(jī)碳利用中的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

條斑紫菜葉狀體來(lái)自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所藻類(lèi)種質(zhì)庫(kù), 在含有PES營(yíng)養(yǎng)鹽的無(wú)菌海水中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為: 溫度15～18 ℃, 光照強(qiáng)度15～30 μmol·m?2·s?1, 光暗周期為14 h∶10 h, 每周更換1次培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 條斑紫菜不同碳源處理

選取葉片大小相近且生長(zhǎng)旺盛的健康藻體為材料, 分別置于含不同濃度NaHCO3人工海水培養(yǎng), NaHCO3終濃度分別為2、4、8 mmol/L。NaHCO3濃度設(shè)置基于在15 ℃, pH 8.07時(shí), 自然海水中可溶性無(wú)機(jī)碳濃度為2.1 mmol/L, 而可溶性無(wú)機(jī)碳的主要成分是HCO3?, 占91%[18]。每150 mL人工海水培養(yǎng)0.03 g新鮮藻體, 其余培養(yǎng)條件同上。參考文獻(xiàn)[19-20]室內(nèi)培養(yǎng)紫菜方法, 每2 d全部更換培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件, 我們將培養(yǎng)在不同NaHCO3濃度的葉狀體培養(yǎng)24 h后, 光照時(shí)采收。

在以CO2為碳源的處理中, 我們將條斑紫菜葉狀體平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的濾紙上并一直保持濕潤(rùn), 分別往培養(yǎng)瓶中通入正?？諝?CO2體積分?jǐn)?shù)為4.17×10–4)和加富CO2的空氣(CO2終體積分?jǐn)?shù)分別為1×10–3和2×10–3)。青島附近海域的半日潮使得野外生長(zhǎng)的條斑紫菜干出時(shí)間約為2～4 h, 因此我們將條斑紫菜葉狀體處理3 h后采收, 吸干表面水分后用液氮凍存, 以備后續(xù)使用。在處理過(guò)程中始終保持不低于60%的含水量, 光照強(qiáng)度30 μmol·m?2·s?1, 溫度15～18 ℃。以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每組處理設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄制備cDNA

條斑紫菜葉狀體RNA提取及反轉(zhuǎn)錄方法參考文獻(xiàn)[21]。簡(jiǎn)介如下: 約100 mg新鮮培養(yǎng)的葉狀體用吸水紙吸掉表面的水分, 迅速用液氮冷凍研磨, 然后用植物RNA提取試劑盒(天根, 北京)提取。提取的RNA首先用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其質(zhì)量, 然后用Nanodrop Photometer分光光度計(jì)(德國(guó))測(cè)定RNA的純度與濃度。

用于擴(kuò)增目的基因的cDNA采用MMLV試劑盒(promega)反轉(zhuǎn), 反轉(zhuǎn)過(guò)程未去除基因組DNA。用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)的cDNA依據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū) (TaKaRa, 大連)進(jìn)行, 具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下: 1) 去除基因組DNA反應(yīng)。5′gDNA Eraser Buffer 2mL, gDNA Eraser 1mL, Total RNA (1 000 ng), 添加RNase Free dH2O至10mL; 42℃ 2 min; 2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。向步驟1的反應(yīng)液中加入以下試劑, PrimeScript RT Enzyme Mix I 1mL, RT Primer Mix 1mL, 5′Primescript Buffer 4mL, RNase Free dH2O 4mL; 37 ℃ 30 min, 85 ℃ 5 s, 4 ℃保存。所獲cDNA模板置于?20 ℃暫存。

1.2.3 目的基因擴(kuò)增

分析轉(zhuǎn)錄組unigene TRINITY_DN105351_c0_g和TRINITY_DN15039_c0_g1序列后, 利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增目的基因的引物, 引物名稱(chēng)及序列見(jiàn)表1。采用Touchdown程序, 即: 94 ℃2 min, 98 ℃30 s, 接下來(lái)10循環(huán)98 ℃30 s, 65 ℃15 s, 68 ℃150 s, 每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.1 ℃, 接下來(lái)進(jìn)入30個(gè)循環(huán)為98 ℃30 s, 55 ℃15 s, 68 ℃150 s, DNA聚合酶為T(mén)ks Gflex (TaKaRa, 大連), 所用儀器為SensoQuest Labcycler (SensoQuest, 德國(guó))。

表1 本文所用引物序列

1.2.4 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

所獲得的序列在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast)上用BLASTx進(jìn)行比對(duì)?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用TMpred軟件[22], 信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP 5.0版(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。多序列比對(duì)采用ClustalＸ程序[23]。采用MEGA 10.0軟件[24]和最大似然法(maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 重復(fù)次數(shù)為1 000次, 建樹(shù)所用的最佳模型為WAG+ G+I模式。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

用于RT-qPCR的引物名稱(chēng)及序列見(jiàn)表１, 并在圖1B中用雙下劃線標(biāo)出。以GAPDH為內(nèi)參基因[25]。反應(yīng)所用試劑購(gòu)自Roche公司(Switzerland), 儀器為Quant Studio1 (Thermo Fisher Scientific Inc., U. S.)。PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃2 min, 接下來(lái)40循環(huán)為94 ℃15 s, 60 ℃15 s, 72 ℃20 s, 擴(kuò)增結(jié)束后的溶解曲線分析為檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。RT-qPCR數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量法分析, 用SPSS單因素方差分析檢驗(yàn)顯著性差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 PyPYC基因核酸全長(zhǎng)序列的獲得

引物對(duì)PyPYC1-F/PyPYC1-R和PyPYC2-F/ PyPYC2-R分別對(duì)應(yīng)TRINITY_DN15039_c0_g1和TRINITY_DN105351_c0_g1序列。盡管在模板濃度、退火溫度以及Taq酶等方面都做了很多嘗試, 用PyPYC1-F/PyPYC1-R引物無(wú)法獲得PCR產(chǎn)物, 也就是說(shuō)不能獲得RINITY_DN15039_c0_g1對(duì)應(yīng)序列。而且, 該unigene序列在條斑紫菜基因組序列[7](BioProject PRJNA589917 in NCBI)中也無(wú)匹配序列。因此, 我們初步認(rèn)為來(lái)自轉(zhuǎn)錄組的TRINITY_ DN15039_c0_g1為來(lái)自細(xì)菌污染。采用引物對(duì)PyPYC2-F和PyPYC2-R獲得大約4 K的PCR產(chǎn)物(圖1a)。測(cè)序后共獲得3 546 bp的核酸序列, 除去324 bp的內(nèi)含子區(qū)外, 其余部分與TRINITY_ DN105351_c0_g1相同(圖1b)。該序列對(duì)應(yīng)條斑紫菜基因組第一條染色體上從14 819 602至14 823 147區(qū)域的核酸序列。經(jīng)BlastX比對(duì)發(fā)現(xiàn), 該序列與來(lái)自紅藻PYC1氨基酸序列(序列入口號(hào): KAA8491876.1)有61%的相似性, 與細(xì)菌的PYC氨基酸序列(RZO64306.1)有53%的相似性, 從而確定該產(chǎn)物為條斑紫菜的基因, 命名為。

2.2 序列特征分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

丙酮酸羧化酶催化丙酮酸和HCO3?結(jié)合生成草酰乙酸的整個(gè)反應(yīng)分為以下兩步進(jìn)行[26-28]:

(1)

(2)

在結(jié)構(gòu)上, 典型的丙酮酸羧化酶由4個(gè)相同的亞基排列成四面體狀結(jié)構(gòu), 每個(gè)亞基包含3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域: 生物素羧化(BC, biotin carboxylase)結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)羧基(CT, carboxyltransferase) 結(jié)構(gòu)域以及生物素羧基載體(BCCP, biotin carboxyl carrier protein)結(jié)構(gòu)域[27, 29]。這種依賴(lài)生物素的羧化酶在2個(gè)活性位點(diǎn)以2個(gè)連續(xù)的步驟執(zhí)行它們的活性, 在第一步反應(yīng)中, 可移動(dòng)的羧基載體生物素在BC活性部位進(jìn)行羧化, 這一過(guò)程需要Mg-ATP提供能量。然后, 結(jié)合了羧基的生物素被BCCP轉(zhuǎn)移到CT活性中心將羧基轉(zhuǎn)移到底物丙酮酸上, 使丙酮酸完成羧化反應(yīng)[30]。并且, PYC的每個(gè)亞基都含有一個(gè)緊密結(jié)合的二價(jià)金屬離子(Zn2+/Mg2+), 它作為PYC的輔助因子似乎起著結(jié)構(gòu)性的作用[27]。

圖1 采用PyPYC2-F和PyPYC2-R引物擴(kuò)增PyPYC基因及其核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

Fig. 1 Electrophoresis pattern of the DNA fragments amplified with the PyPYC2-F and PyPYC2-R primer pairs, nucleotide sequence of PyPYC and its relative putative amino acids

注: 圖1b中黑色加粗處為內(nèi)含子區(qū)域, 單下劃線為擴(kuò)增基因全長(zhǎng)序列所用引物區(qū), 雙下劃線為熒光定量檢測(cè)所用引物區(qū)。

我們采用ClustalX軟件將不同來(lái)源的PYC氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和相似性分析(表2和圖2), 發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同物種的PYC氨基酸序列具有較高的保守性, PyPYC與來(lái)自C-169、和Ch24-10的PYC分別有41.2%, 42.6%和38.3%相似性(表2)。在這些物種PYC序列上已經(jīng)證實(shí)的活性位點(diǎn)區(qū)域, 如與Mg-ATP結(jié)合的位點(diǎn)(ERNCSIQRRHQKV 和 QVEH), BCCP結(jié)構(gòu)域中的生物素結(jié)合位點(diǎn)(AMKM), CT結(jié)構(gòu)域中丙酮酸結(jié)合位點(diǎn)(ETWGGATFDVAM RFLECPWERL)和1個(gè)二價(jià)金屬離子(Zn2+/Mg2+)結(jié)合位點(diǎn)(HVHTH)等[31], 在PyPYC序列中也同樣存在, 且序列相似度較高(圖2)。

表2 氨基酸序列相似性

注: Cs代表C-169; Sc代表; Rp代表Ch24-10

圖2 來(lái)自不同物種的PYC氨基酸序列比對(duì)

注: 登錄號(hào)分別為:C-169 (XP_005642706.1)、(CAA42544.1)、Ch24-10 (KKZ88730.1)

在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上(圖3), PyPYC與來(lái)自紫球藻()PYC以100%的bootstrap值聚在一起, 然后該分支又以較高的bootstrap值(72%)與來(lái)自絲囊霉菌()和假微型海鏈藻(CCMP1335)的PYC組成一個(gè)分支。此外, 在進(jìn)化關(guān)系上, 該分支又和來(lái)自太平洋鄰囊菌()和細(xì)菌()的PYC聚為一支。這些結(jié)果似乎表明, PyPYC與細(xì)菌的PYC有較近的親緣關(guān)系。

圖3 由PYC氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

注: 登錄號(hào)分別為:(KAA8491876.1)、(XP 008865358.1)、CCMP1335 (EED88205.1)、(WP 045116520.1)、(RZO64306.1)、(QDZ22274.1)、(XP_002503347.1)、(PNH00295.1)、C-169 (XP_ 005642706.1)、(PSC70059.1)、S288C (NP 011453.1)、(WP 003505139.1)、(WP 011013816.1)

2.3 PyPYC基因?qū)Σ煌?lèi)型和不同濃度碳源的響應(yīng)

為探究基因?qū)Σ煌荚吹捻憫?yīng)情況, 我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了在不同處理中的表達(dá)量變化(圖4)。結(jié)果顯示, 在以NaHCO3作碳源時(shí),基因的表達(dá)量隨NaHCO3濃度升高出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì), 但和正常濃度碳(2 mmol/L NaHCO3)相比, 差異不顯著(圖4a); 而在以CO2為碳源加富處理時(shí),基因表達(dá)量隨著CO2濃度的升高顯著升高, 特別是暴露在體積分?jǐn)?shù)為2×10–3CO2時(shí), 其表達(dá)量比暴露在空氣高14倍(圖4b)。

圖4 PyPYC基因表達(dá)對(duì)不同碳源的響應(yīng)

3 討論

如圖2所示, 來(lái)自條斑紫菜的PYC蛋白序列活性位點(diǎn)與來(lái)自細(xì)菌(,)和微藻(C-169)PYC的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)序列幾乎完全相同, 該結(jié)果說(shuō)明PYC氨基酸序列功能性位點(diǎn)區(qū)域在進(jìn)化上非常保守。

如前所述, 條斑紫菜葉狀體在生長(zhǎng)過(guò)程中由于生境的變化而經(jīng)歷不同類(lèi)型碳源(暴露在空氣中接觸空氣CO2及沒(méi)入海水接觸海水無(wú)機(jī)碳)和含水量的變化。前期研究表明, 紫菜葉狀體在含水量不低于60%時(shí), 增加空氣中CO2能提高紫菜100% CO2固定率[4, 32-33]。因此, 在獲得條斑紫菜基因全長(zhǎng)序列后, 在保證其含水量不受脅迫(含水量>60%)的前提條件下(將紫菜葉狀體置于濕潤(rùn)的濾紙上, 見(jiàn)方法部分), 我們模擬葉狀體在野外生境的碳源情況, 探究紫菜葉狀體中羧化酶基因?qū)Σ煌荚吹捻憫?yīng)。結(jié)果表明, 相對(duì)于碳酸氫根作為主要碳源, 葉狀體中的基因?qū)O2的變化更敏感(圖4)。自20世紀(jì)70年代以來(lái), 越來(lái)越多的證據(jù)表明, 大多數(shù)藻類(lèi)存在CO2濃縮機(jī)制(CO2concentrating mechanism, CCM), 該機(jī)制協(xié)助藻類(lèi)高效利用海水和空氣中的無(wú)機(jī)碳源[32, 34-38]。而且, 有些海藻的CCM機(jī)制中不僅存在碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA), 還發(fā)現(xiàn)類(lèi)似高等植物高效固碳途徑-C4途徑的一些酶, 如烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate Carboxylase, PEPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxy-kinase, PEPCK)等, 某些特殊生境或培養(yǎng)條件會(huì)誘導(dǎo)類(lèi)C4途徑酶發(fā)揮固碳作用[39-42]。如在大型綠藻滸苔()中發(fā)現(xiàn), 低光和低CO2水平時(shí)主要通過(guò)CA利用海水中的HCO3?, 而高光(1 200～2 000 μmol photons·m–2·s–1)時(shí), 則通過(guò)PEPC和PEPCK酶利用HCO3?, 從而揭示了滸苔高效固碳機(jī)制[43]。

與滸苔不同的是, 條斑紫菜葉狀體中PEPC酶活較低, 并且在加富HCO3?(4 mmol/L)人工海水培養(yǎng)時(shí),和轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)出現(xiàn)升高趨勢(shì), 同時(shí)也伴隨著 PYC羧化酶活和PEPCK脫羧酶活的升高[37]。Shao等[44]研究同樣表明, 高碳(0.1 mol/L KHCO3)促進(jìn)海帶()PEPCK脫羧酶活性增加, 但未檢測(cè)到PEPC酶活。以上結(jié)果表明, 大型紅藻和褐藻中可能存在與大型綠藻不同的類(lèi)C4途徑, 綠藻以PEPC和PEPCK途徑為主, 而紅藻和褐藻以PYC和PEPCK為主。萊茵衣藻()在低碳條件培養(yǎng)(培養(yǎng)基通入空氣, 即含體積分?jǐn)?shù)為3.60×10–4CO2), 增加培養(yǎng)基中NH4+后, PYC酶活比PEPC酶活升高, 作者認(rèn)為該結(jié)果證實(shí)了以前的研究結(jié)論, 即植物細(xì)胞內(nèi)不同的羧化酶提供了OAA合成支路, 為三羧酸循環(huán)提供C4復(fù)合物, 從而為氮同化和氨基酸合成提供碳骨架[45]。

綜上所述, 我們初步認(rèn)為, 適當(dāng)高濃度無(wú)機(jī)碳環(huán)境(如增加空氣中CO2和增加水體中HCO3?), 能誘導(dǎo)條斑紫菜和表達(dá)進(jìn)而協(xié)助紫菜進(jìn)行高效固碳, 而且高濃度CO2更易于誘導(dǎo)的表達(dá)?；?qū)Ω邼舛菴O2的響應(yīng)將有助于條斑紫菜葉狀體暴露在空氣中時(shí)高效利用大氣中CO2, 至于基因?qū)O2和HCO3–表現(xiàn)出不同的響應(yīng)則需要更深入的研究。

4 總結(jié)

來(lái)自不同物種(細(xì)菌, 古細(xì)菌, 微藻及大型海藻) PYC在活性位點(diǎn)區(qū)的氨基酸序列比較保守, 而且來(lái)自條斑紫菜、紫球藻和假微型海鏈藻的PYC與細(xì)菌的PYC有比較近的親緣關(guān)系。該基因在RNA水平上對(duì)環(huán)境中CO2的變化響應(yīng)比對(duì)HCO3–更敏感, 推測(cè)其在協(xié)助條斑紫菜高效利用空氣中CO2發(fā)揮作用。

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Expression of the pyruvate carboxylase gene inin response to different inorganic carbon sources

LIU Xue-ying1, 2, 3, 4, ZHANG Bao-yu2, 3, 4, WANG Guang-ce2, 3, 4, GONG Xiang-zhong1

(1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Pyruvate carboxylase (PYC) catalyzes the carboxylation of pyruvate to oxaloacetate in non-photosynthetic organisms. PYC plays an important role in maintaining metabolic homeostasis in animals as the first step in gluconeogenesis. PYC also functions in photosynthetic organisms, including microalgae and plants, but its function in macroalgae inhabiting the intertidal zone is unknown. In this study, the complete sequence of thegene (namely) was obtained from the thallus cDNA ofand the sequence characteristics were analyzed. The phylogenetic tree based on amino acid sequences indicated that PyPYC was closely related to PYC from prokaryotes. Different types and concentrations of inorganic carbon sources were employed during the cultivation of the thallus based on the changes in carbon sources that wild thallus ofencounter in the natural intertidal zone. The relative expression level ofin thallus cultivated under these inorganic carbon conditions was evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction. The results demonstrated that the transcription ofwas significantly induced by a high concentration of CO2compared with the normal inorganic carbon concentration. The change in transcription was not as obvious in response to a high concentration of HCO3–. Therefore, we propose that PYC probably plays a particular role in inorganic carbon utilization whenthallus is exposed to the atmosphere.

Pyruvate carboxylase;; inorganic carbon utilization

Apr. 22, 2022

Q71

A

1000-3096(2022)12-0138-10

10.11759/hykx20220422001

2022-04-22;

2022-07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金(41876163); 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心重點(diǎn)部署項(xiàng)目(COMS2019Q02); 山東省“泰山學(xué)者”工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(tspd20210316); 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國(guó)家現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-50)

[National Natural Science Foundation of China, No.41876163; The Key Deployment Project of the Centre for Ocean Mega-Research of Science, the Chinese Academy of Sciences, No. COMS2019Q02; Taishan Scholar Project of Shandong Province, No. tspd20210316; Ministry of Finance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs: National Modern Agricultural Industry Technology System Project, No. CARS-50]

劉雪瑩(1998—), 女, 山東泰安人, 碩士研究生, 主要從事藻類(lèi)分子生物學(xué)與發(fā)育調(diào)控研究, E-mail: liuxueying@stu.ouc.edu.cn; 張寶玉(1975—),通信作者, 副研究員, 主要從事藻類(lèi)分子生物學(xué)和發(fā)育調(diào)控, E-mail: byzhang@qdio.ac.cn; 宮相忠(1963—), 通信作者, 教授, 主要從事海藻繁殖生物學(xué)研究, E-mail: gxzhw@ouc.edu.cn

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)