中藥有效成分消除G-菌耐藥性研究進(jìn)展

左麗，曠年玲，鄧聰聰，呂興幫，張博，吳逸琳，張永英

（河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000）

抗生素作為廣譜抗菌藥物，對治療動(dòng)物疾病具有重要作用。但過度應(yīng)用抗生素，使細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[1]。革蘭氏陰性菌（G-菌）因其獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象更為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)在多重耐藥、耐藥機(jī)制復(fù)雜等方面，不僅對養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，也為人類食品安全帶來了巨大隱患。因此，消除細(xì)菌耐藥性恢復(fù)其對抗菌藥物敏感性成為研究熱點(diǎn)。目前多采用化學(xué)合成的抗菌增敏藥物對抗細(xì)菌耐藥性，但易產(chǎn)生毒副作用，如十二烷基硫酸鈉（SDS）[2]。中藥來源豐富、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性、在消除細(xì)菌耐藥方面具有多靶位效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到研究者的廣泛關(guān)注[2]。但中藥成分復(fù)雜，藥效成分和含量受產(chǎn)地、收獲季節(jié)、炮制方式等因素影響較大，在動(dòng)物臨床應(yīng)用中受到很多限制。而中藥有效成分避免了中草藥的缺點(diǎn)，同時(shí)還具有多靶性和無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[3]，成為消除細(xì)菌耐藥性方面的研究熱點(diǎn)。文章對G-菌耐藥性的研究現(xiàn)狀以及耐藥產(chǎn)生機(jī)制、中藥有效成分消除G-菌耐藥性的研究現(xiàn)狀和中藥有效成分協(xié)同消除G-菌耐藥性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為中藥有效成分逆轉(zhuǎn)G-菌耐藥性提供參考。

1 G-菌耐藥現(xiàn)狀和耐藥產(chǎn)生機(jī)制

1.1 G-菌耐藥現(xiàn)狀

G-菌因具有特殊結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁更易產(chǎn)生耐藥性。與革蘭氏陽性菌（G+菌）相比，G-菌細(xì)胞壁主要有3點(diǎn)不同：

（1）G-菌的肽聚糖層更薄。

（2）肽聚糖層外具有親水性和疏水性雙重特性的外膜雙分子層，包含脂多糖（LPS）分子、磷脂和外膜蛋白（OMPs）[4]。上述動(dòng)態(tài)外膜構(gòu)成對抗抗生素的屏障，大部分抗菌藥物必須穿過外膜才可具有抗菌作用，其中氯霉素和氨基糖苷類疏水抗生素可利用脂質(zhì)通道進(jìn)入胞內(nèi)，但其他疏水抗生素和極性分子無法進(jìn)入，可能與LPS作用有關(guān)。

（3）G-菌外膜和細(xì)胞壁之間存在周質(zhì)間隙。β-內(nèi)酰胺類抗生素利用孔蛋白(Porin)等通道蛋白進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)[5]，但具有胞質(zhì)靶點(diǎn)的分子因內(nèi)膜限制而無法進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[6]，從而無法達(dá)到治療效果。因此產(chǎn)生的耐藥性難以消除，G-菌疾病的治療更加復(fù)雜[7]。

近年來多重耐藥菌數(shù)量急劇增加，馮敏燕等[8]測定2008—2014年山東省不同地區(qū)雞場分離的210株大腸桿菌對14種抗生素的耐藥性，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對13種抗生素（多西環(huán)素除外）的耐藥率有所增長，對其中10種抗生素的耐藥率增長1倍甚至更高。Huber等[9]對2013—2019年加拿大肉雞中沙門氏菌、彎曲桿菌和大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)2014年加拿大實(shí)施家禽業(yè)減少抗生素使用戰(zhàn)略后，耐藥菌對抗生素的耐藥性下降了6%～38%，表明當(dāng)某一種高耐藥性的抗生素（如頭孢類抗生素）退出臨床使用后，G-菌逐漸會(huì)對另一種抗生素（如氨基糖苷類抗生素）產(chǎn)生耐藥性，形成惡性循環(huán)。崔瑩等[10]對河南鄭州生禽肉樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)檢出的26株致瀉大腸桿菌耐藥率達(dá)96.15%，其中對四環(huán)素耐藥率高達(dá)84.62%，對5種及以上抗生素耐藥的菌株占68%。Lenart-Boron等[11]從某污水處理廠附近河流分離出50株大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)該大腸桿菌對阿莫西林耐藥菌株高達(dá)90%，氨芐西林耐藥菌株占36%，頭孢菌素耐藥菌株占30%，對3種及以上抗生素耐藥的大腸桿菌占40%。張立偉[12]對河北地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)56株大腸桿菌中對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的菌株最多，對氨芐西林耐藥的菌株占94.64%，多數(shù)菌株對5種及以上的抗生素具有耐藥性。Datok等[13]發(fā)現(xiàn)，從尼日利亞某城市出售的300份烤牛肉樣品中分離出的大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率高達(dá)100%，其次是阿莫西林/克拉維酸、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、亞胺培南和頭孢曲松，多重耐藥大腸桿菌占97.5%。上述研究表明，G-菌對臨床常用的多種抗生素表現(xiàn)較高的耐藥性，且耐藥譜不斷變廣。

1.2 G-菌耐藥產(chǎn)生機(jī)制

細(xì)菌耐藥機(jī)制包括內(nèi)在耐藥和獲得耐藥[9]。內(nèi)在耐藥是編碼染色體DNA的穩(wěn)定遺傳特性，由該屬全部成員共享。細(xì)菌可通過宿主染色體DNA突變或得到攜帶耐藥基因的染色體獲得耐藥性[14]，其產(chǎn)生機(jī)制主要分為以下5類：

（1）產(chǎn)生使藥物失活的酶。耐藥菌能夠產(chǎn)生通過水解或修飾作用破壞抗生素結(jié)構(gòu)使其失去活性的酶，如β-內(nèi)酰胺酶可打開青霉素和頭孢菌素的內(nèi)酰胺環(huán)，破壞藥物結(jié)構(gòu)使其完全失去抗菌活性；氨基糖苷類抗菌藥物鈍化酶（氨基糖苷?；D(zhuǎn)移酶等）對氨基糖苷類分子中的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，使其與作用靶位核糖體的親和力大幅降低，如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶使氯霉素乙酰化，失去抗菌作用[15]。

（2）主動(dòng)外排機(jī)制。存在于細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白質(zhì)復(fù)合物可排出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的抗生素和毒素，從而使細(xì)胞內(nèi)有毒化合物濃度降低到亞毒性水平。這些蛋白質(zhì)對不同結(jié)構(gòu)抗生素的識別和外排存在不同的位點(diǎn)和機(jī)制[16]。

（3）藥物作用靶點(diǎn)改變。細(xì)菌能夠改變抗生素作用靶位的蛋白結(jié)構(gòu)和數(shù)量，從而影響與藥物的結(jié)合。如肺炎鏈球菌耐紅霉素是由質(zhì)粒介導(dǎo)的甲基化酶使23S rRNA中一個(gè)關(guān)鍵性的腺嘌呤殘基甲基化，使抗菌藥物進(jìn)入胞內(nèi)后無法與之結(jié)合發(fā)揮作用[17]。

（4）細(xì)胞膜通透性降低。細(xì)胞外膜上的孔蛋白是一種非特異性的、跨越細(xì)胞膜的水溶性擴(kuò)散通道，抗菌藥物必須進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部到達(dá)作用靶點(diǎn)后才能夠發(fā)揮抗菌作用。細(xì)菌的細(xì)胞壁障礙或外膜通透性改變均可嚴(yán)重影響抗菌藥物的抗菌作用，如細(xì)菌細(xì)胞膜微孔缺失，亞胺培南難以進(jìn)入胞內(nèi)，從而失去抗菌作用[15]。

（5）細(xì)菌自身代謝狀態(tài)改變。細(xì)菌可通過改變自身狀態(tài)逃避藥物作用，休眠狀態(tài)或營養(yǎng)缺陷的細(xì)菌耐多種抗生素[10]。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境，吸附于生物或非生物表面的細(xì)胞群落，能夠阻止藥物滲透到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，具有保護(hù)細(xì)菌逃逸抗菌藥物的殺傷作用[7]。

2 中藥有效成分消除G-菌耐藥性研究現(xiàn)狀

張石磊等[18]研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度小檗堿與多重耐藥大腸桿菌共培養(yǎng)3 d后，左氧氟沙星的最低抑菌濃度（MIC）由16 mg/L降至8 mg/L，表明小檗堿對大腸桿菌耐藥性具有消除作用。Qu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與耐多黏菌素菌株共培養(yǎng)后，多黏菌素的MIC由4～256 mg/L降至1～64 mg/L，表明槲皮素可顯著提升耐藥菌對多黏菌素的敏感性。郭巖[20]研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚能夠顯著恢復(fù)MCR-1陽性的大腸桿菌、沙門菌以及肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性。由此可見，中藥有效成分可通過多種耐藥消除機(jī)制降低G-菌大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性。

2.1 酶抑制劑

G-菌能夠產(chǎn)生抗生素的水解酶，使抗生素活性降低或失去活性，以β-內(nèi)酰胺類酶最為普遍[21]，可水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的活性結(jié)構(gòu)，使其失去抗菌活性。其中ESBLs和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM-1）可降低β-內(nèi)酰胺類抗生素對大腸桿菌的抑制作用。第二類抗生素的水解酶是氨基糖苷類修飾酶（AMEs），包括N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ANT）和O-磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）[22]，可通過共價(jià)修飾藥物上的特定氨基或羥基滅活氨基糖苷類抗生素，使抗生素失去抑菌活性。第三類是四環(huán)素鈍化酶，可通過降解四環(huán)素使其失去活性[20]。曹敏[23]研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素、槲皮素、香紫蘇醇、木樨草素、苦參堿、大蒜素和五味子甲素7種中藥單體對β-內(nèi)酰胺酶具有一定的抑制作用，其中，蘆薈大黃素對β-內(nèi)酰胺酶活性抑制作用最強(qiáng)。茶提取物-黃素-3,3二氨基甲（TFDG）也能夠有效抑制ESBLs活性，增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類藥物的藥效[24]。賈芳等[25]研究發(fā)現(xiàn)，2.5～15.0 g/L的苦豆子堿既可對大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，還可降低ESBLs活性。因此，中藥有效成分具有抑制酶活性的能力，可提高耐藥菌株對抗菌藥物敏感性。

2.2 外排泵抑制劑

G-菌依靠跨越雙膜的3種蛋白復(fù)合體從細(xì)胞中泵出抗生素。3種蛋白復(fù)合體包括抗性結(jié)瘤細(xì)胞分裂（RND）家族的內(nèi)膜蛋白（IMP）、外膜蛋白（OMP）及連接兩個(gè)蛋白的胞膜融合蛋白（MFP）[26]。外排泵具有底物選擇廣泛的特點(diǎn)，以此形成對抗生素的非特異性耐藥。外排泵抑制劑（EPIs）的研發(fā)對恢復(fù)多重耐藥G-菌的敏感性具有重要意義。劉三俠[27]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)小檗堿處理的多重耐藥大腸埃希菌外排泵AcrA-mRNA表達(dá)量顯著降低，表明小檗堿能夠抑制細(xì)菌主要外排系統(tǒng)AcrAB-Tolc。Choudhury等[28]研究發(fā)現(xiàn)，香豆素能夠抑制銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵MexB蛋白表達(dá)，抑制細(xì)菌耐藥性。綜上，中藥有效成分能夠顯著抑制G-菌的外排泵作用以及相關(guān)基因的表達(dá)，從而消除細(xì)菌耐藥性。

2.3 生物被膜抑制劑

生物被膜是指細(xì)菌被自身產(chǎn)生的多聚復(fù)合物基質(zhì)包繞的異質(zhì)性細(xì)菌群體，附著于無活性物體或活體物體表面[15]。一般情況下，生物被膜通過降低菌體代謝速率和對抗生素的通透性阻止或減少抗生素進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而產(chǎn)生抗生素耐藥性[29]。景春娥等[30]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠降低阪崎克羅諾桿菌的附著性，抑制生物被膜形成，且鞭毛合成基因、生物被膜形成相關(guān)基因、生物被膜群體感應(yīng)因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄水平均有所下調(diào)。張凱等[31]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的厚樸酚對同一耐藥菌生物被膜形成均可產(chǎn)生抑制作用。黃盼等[32]研究發(fā)現(xiàn)，5 g/L的甘草酸可顯著抑制耐藥菌生物被膜形成，10 g/L的甘草酸處理的耐藥菌幾乎不形成生物被膜。綜上，中藥有效成分通過抑制耐藥G-菌生物被膜形成可消除G-菌耐藥性。

2.4 耐藥質(zhì)粒消除劑

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性最主要的機(jī)制是獲得耐藥質(zhì)粒[14]。耐藥基因在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移，可整合到細(xì)菌的染色體中，代代穩(wěn)定遺傳，也可在細(xì)菌質(zhì)粒上保持在染色體外狀態(tài)，由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性可伴隨耐藥質(zhì)粒的消除而逆轉(zhuǎn)。汪東海等[33]研究發(fā)現(xiàn)，與處理前相比，經(jīng)0.1～1.0 g/L黃芩苷處理的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌株質(zhì)粒消除率為6.3%～37.5%，且呈劑量依賴性。王新興等[34]研究發(fā)現(xiàn)，MIC濃度的小檗堿可消除MCR-1陽性大腸桿菌耐藥質(zhì)粒，消除率為26.9%；經(jīng)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)小檗堿作用后，由質(zhì)粒編碼的MCR-1基因也被消除。綜上，中藥有效成分通過消除耐藥質(zhì)粒達(dá)到消除G-菌耐藥性的作用。

3 中藥有效成分協(xié)同消除G-菌耐藥性

G-菌耐藥性產(chǎn)生由多重耐藥機(jī)制介導(dǎo)，單一消除劑無法抑制全部耐藥機(jī)制，多種消除劑聯(lián)合應(yīng)用才是消除細(xì)菌多重耐藥機(jī)制的有效手段。徐倩倩等[35]研究發(fā)現(xiàn)，黃連-訶子、山楂-蘆薈、蘆薈-烏梅等7對中藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)顯示協(xié)同作用，F(xiàn)IC指數(shù)為0.28～0.50；黃連-山楂、蘆薈-五味子等9對藥物聯(lián)合應(yīng)用呈現(xiàn)相加作用，F(xiàn)IC指數(shù)為0.56～1.00；27對藥物聯(lián)用呈現(xiàn)拮抗作用，F(xiàn)IC指數(shù)均大于2。王芝超[36]發(fā)現(xiàn)，山楂可消除1～3條耐藥大腸桿菌耐藥質(zhì)粒條帶，黃連可抑制耐藥菌β-內(nèi)酰胺酶活性，降低大腸桿菌外排泵AcrAB-TolC轉(zhuǎn)錄水平，生物被膜由強(qiáng)附著性變?yōu)槿醺街?，山楂黃連組方對雞源大腸桿菌病治愈率達(dá)90%。

4 結(jié)論

目前對中草藥復(fù)方消除細(xì)菌耐藥研究較多，但中藥成分復(fù)雜，藥效受采摘季節(jié)、產(chǎn)地、炮制方式、制備濃度等諸多因素影響，導(dǎo)致臨床治療細(xì)菌性疾病尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。而藥效明確、濃度可控的中藥有效成分可避開此弊端，更具臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，研發(fā)多靶點(diǎn)消除細(xì)菌多重耐藥性的中藥有效成分消除劑是發(fā)展趨勢。