烏魯木齊市某羊屠宰場(chǎng)沙門氏菌污染調(diào)查及分離株耐藥性檢測(cè)

曹婉怡，彭斌，朱亞磊，趙琴，王金泉

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

沙門氏菌是革蘭氏陰性兼性厭氧細(xì)菌，于19世紀(jì)首次分離出豬霍亂沙門氏菌（Salmonellasp.）[1]。作為人畜共患傳染病的主要傳染源之一，沙門氏菌傳播途徑多樣，經(jīng)食物鏈可引起人和多種動(dòng)物的急性或慢性傳染病[2]。肉制品作為沙門氏菌的攜帶體，屠宰加工時(shí)可通過操作人員、加工工具、運(yùn)輸?shù)韧緩綌y帶并傳播沙門氏菌[3]。

目前，沙門氏菌耐藥現(xiàn)象較為普遍[4]。Kroger等[5]對(duì)149株沙門氏菌進(jìn)行10種以上的抗生素耐藥檢測(cè)，結(jié)果顯示，超過七成樣品存在不同程度的耐藥，其中超半數(shù)對(duì)兩種或兩種以上藥品敏感。在廣州地區(qū)進(jìn)行非傷寒菌株耐藥性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，氨芐西林的耐藥性最高，磺胺甲基異惡唑、頭孢他啶和環(huán)丙沙星也呈較高的耐藥性[6]，表明存在一定的安全隱患[7]。本研究以烏魯木齊某羊屠宰場(chǎng)為樣品采集地，對(duì)該地沙門氏菌的流行情況進(jìn)行調(diào)查，并進(jìn)行多種抗生素敏感試驗(yàn)，以期為沙門氏菌的防控與治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2021年5月在烏魯木齊市某羊屠宰場(chǎng)采集112份樣品（57份羊胴體拭子、30份羊腸內(nèi)容物、25份操作環(huán)境拭子）。無(wú)菌生理鹽水浸潤(rùn)的棉簽涂抹羊胴體表面、操作工具及操作臺(tái)表面；刮取羊腸內(nèi)容物后，立即放入提前準(zhǔn)備好的甘油肉湯中并標(biāo)記，24 h內(nèi)送回待檢。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311，保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院畜產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室。1.1.3試劑與儀器

主要試劑：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎(chǔ)（TTB）、亞砷酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、MH肉湯、LB肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、0.1%煌綠溶液和碘溶液、PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、基因擴(kuò)增儀（PCR儀）、凝膠成像系統(tǒng)GELDOCXR（BIO-RAD公司）。

1.1.4 引物序列（見表1）

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

根據(jù)參考文獻(xiàn)確定inv A基因[8]并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.5 藥敏試驗(yàn)材料

選取11種藥物的藥敏紙片，包括：β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林（AMP）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松（CRO）；氨基糖苷類：卡那霉素（KAN）、慶大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）；喹諾酮類：環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFX）；四環(huán)素類：四環(huán)素（TET）、酰胺醇類：氯霉素（CHL）；均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分離純化

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]的方法操作。吸取2 mL含有樣品的甘油肉湯加入裝有2 mL BPW的滅菌離心管中，37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的樣品進(jìn)行分裝處理，取1 mL培養(yǎng)液加入10 mL TTB（加入0.1%煌綠溶液、碘溶液，每100 mL/支）內(nèi)，再取1 mL培養(yǎng)液加入10 mL SC內(nèi)。將兩種增菌液做好標(biāo)記均放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)后的菌液，采用滅菌后的接種環(huán)蘸取菌液一環(huán)，分別在XLD和BS平板上，使用平板劃線法涂布，分別放入37和42℃環(huán)境中培養(yǎng)24、48 h；重復(fù)前一步驟3～4次，即得到理想菌落。

1.2.2inv-APCR鑒定

使用水煮法[10]提取模板；反應(yīng)結(jié)束后，將與預(yù)期片段大小一致的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)。

PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master mix 10 μL、inv AF 1 μL、inv A-R1 μL、超純水11 μL、模板2 μL。

PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.2.3 保菌

陽(yáng)性菌復(fù)蘇培養(yǎng)，取單一菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，使用60%甘油以1∶1比例將陽(yáng)性菌制成甘油菌，-20℃保存。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

使用上述藥物對(duì)陽(yáng)性分離株采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。采用滅菌棉拭子蘸取復(fù)蘇后的菌液，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板；依次放置藥敏片，紙片之間距離為2 cm，37℃培養(yǎng)24 h，以標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株并做2個(gè)平行重復(fù)，測(cè)量抑菌圈直徑以便判斷結(jié)果。結(jié)果表現(xiàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行判定，分為耐藥（resistance，R）、中介（intermediary，I）及敏感（sensitive，S）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，37℃培養(yǎng)24 h后，沙門氏菌在XLD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為粉紅色并帶有黑色中心的菌落；經(jīng)42℃培養(yǎng)48 h后，BS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為黑色有金屬光澤的菌落。

圖1 分離純化結(jié)果Fig.1 Separation and purification results

2.2 invA PCR鑒定結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，使用PCR法對(duì)疑似分離株進(jìn)行inv A特異性基因鑒定，有20株片段與預(yù)期大小一致，約284 bp。

圖2 部分樣品invA基因擴(kuò)增鑒定結(jié)果Fig.2 PCR analysis of inv A gene in some samples

對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并將結(jié)果在NCBI比對(duì)，結(jié)果顯示，有16株與GenBank上沙門氏菌序列同源性達(dá)99%以上，確定為沙門氏菌。

2.3 沙門氏菌分離鑒定結(jié)果

對(duì)在屠宰場(chǎng)采集的112份樣品，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)和PCR鑒定相結(jié)合的方法，共分離鑒定得到16株沙門氏菌，總陽(yáng)性率為14.29%（16/112）。

其中，羊酮體陽(yáng)性率12.28%（7/57）、羊腸內(nèi)容物陽(yáng)性率13.33%（4/30）、操作環(huán)境拭子陽(yáng)性率20.00%（5/25）。

2.4 沙門氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

由表2可知，16株菌株對(duì)氨芐西林（68.75%）、頭孢噻肟（100.00%）和頭孢曲松（100.00%）表現(xiàn)高度耐藥；對(duì)氯霉素、四環(huán)素、諾氟沙星中介率較高，分別為62.50%、56.25%、56.25%；對(duì)氧氟沙星敏感率最高，但僅為37.50%。

表2 沙門氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Salmonella susceptibility test results

3 討論

由沙門氏菌引起的群體性食源性疾病愈發(fā)受到重視，已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為最常見食源性疾病病源之一[12]。人與動(dòng)物的直接接觸可能在一定程度上促進(jìn)耐藥菌株在宿主之間的迅速傳播，能夠密切接觸到耐藥菌株的人相對(duì)存在更大程度上被感染的風(fēng)險(xiǎn)[13]?？股氐氖褂檬悄退幓騻鞑サ年P(guān)鍵因素。在動(dòng)物性食品產(chǎn)業(yè)鏈中，抗生素一直作為治療劑、預(yù)防性藥物以及生長(zhǎng)促進(jìn)劑普遍應(yīng)用，在一定程度上加劇了耐藥菌的傳播[14]。

國(guó)家疾病預(yù)防控制中心在2001年對(duì)生肉等7大類中國(guó)食品致病菌的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，生肉中沙門氏菌的平均污染率為9.35%[15]。本試驗(yàn)對(duì)烏魯木齊某羊屠宰場(chǎng)112份樣品進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)，結(jié)果顯示，16份樣本顯示陽(yáng)性，檢出率為14.29%。不同研究中沙門氏菌檢出率的差異性，可能受調(diào)查對(duì)象不同、采樣季節(jié)變化、屠宰衛(wèi)生條件、運(yùn)輸銷售、分離方法等因素影響。因此，烏魯木齊市食源性沙門氏菌的污染情況不容忽視，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)督管理。

大量研究表明，肉制品產(chǎn)業(yè)鏈中存在耐藥性細(xì)菌[16]，抗生素的使用是引起耐藥菌出現(xiàn)的關(guān)鍵因素。因此，本研究對(duì)該屠宰場(chǎng)分離到的16株沙門氏菌進(jìn)行11種抗生素的耐藥性檢測(cè)，結(jié)果顯示，16株分離株均表現(xiàn)敏感，其中對(duì)β-內(nèi)酰胺類表現(xiàn)為高度耐藥，且對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松高達(dá)100%，可能是由于在養(yǎng)殖過程中β-內(nèi)酰胺類藥物主要用于預(yù)防治療其他疾病有關(guān)。

羊源沙門氏菌通過食物鏈傳播，耐藥菌極易再傳播，不僅影響畜牧業(yè)發(fā)展，還會(huì)威脅人類健康，抗生素類藥物的規(guī)范使用迫在眉睫。故應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)耐藥菌的監(jiān)督和檢測(cè)，以便積極應(yīng)對(duì)沙門氏菌耐藥性問題。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，該屠宰場(chǎng)中存在沙門氏菌污染現(xiàn)象，并且存在不同程度上的耐藥現(xiàn)象。因此，需加強(qiáng)屠宰加工環(huán)節(jié)的管控措施，加大管理力度，完善場(chǎng)內(nèi)消毒的方法并提高消毒頻次，以降低沙門氏菌的污染概率；同時(shí)還應(yīng)規(guī)范養(yǎng)殖過程中抗生素藥物的使用，從源頭控制藥物耐藥性問題。