基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金錢草治療腎結(jié)石的作用機(jī)制

王亞婷，劉 昱，李明權(quán)

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病二科，四川 成都 610075）

腎結(jié)石（nephrolithiasis）是晶體物質(zhì)（如鈣、草酸、尿酸、胱氨酸等）在腎臟的異常聚集所致，是泌尿系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。該病主要臨床表現(xiàn)為活動(dòng)后劇烈腰痛、血尿、尿急、尿痛。有研究表明[1]，我國(guó)泌尿系結(jié)石的發(fā)病率為1%～5%，南方地區(qū)高達(dá)5%～10%。目前，腎結(jié)石的主要治療方式包括：①經(jīng)皮腎鏡碎石取石術(shù)；②體外震波碎石術(shù)（ESWL）；③腎實(shí)質(zhì)切開手術(shù)；④服用解痙、抗炎藥物[2]。雖然上述治療方法效果良好，但患者術(shù)后結(jié)石殘留率及復(fù)發(fā)率仍居高不下[3]。近年來，關(guān)于中醫(yī)藥治療腎結(jié)石的研究報(bào)道越來越多，證實(shí)了金錢草治療腎結(jié)石具有良好的效果[4]。金錢草，味甘、咸，微寒，歸肝、膽、腎、膀胱經(jīng)，具有利尿通淋、利濕退黃、解毒消腫之功效[5]。臨床上可用于治療濕熱黃疸、膽脹脅痛、石淋、熱淋、小便澀痛、癰腫疔瘡、蛇蟲咬傷等疾病[6]?，F(xiàn)代研究表明[7]，金錢草可發(fā)揮利尿、抑制草酸鈣形成、降低血清尿酸水平、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、腎臟保護(hù)等作用來治療腎結(jié)石，具有很好的臨床療效。雖然金錢草治療腎結(jié)石具有良好的效果，但因中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的特點(diǎn)，金錢草的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)等多學(xué)科理論為基礎(chǔ)，從多維度視角理解藥物干預(yù)疾病的分子機(jī)制。大量研究表明，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥的作用機(jī)制準(zhǔn)確可靠。為此，本研究以金錢草10個(gè)成分為基礎(chǔ)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，探討其多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制，旨在為金錢草治療腎結(jié)石作用機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分的收集 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php），獲取金錢草的化學(xué)成分。通過口服生物利用度（OB）和類藥性（DL），篩選出同時(shí)滿足OB≥30%，DL≥0.18 的化學(xué)成分。

1.2 預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn) 通過TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫篩選出化學(xué)成分的靶標(biāo)蛋白，使用Perl 語言并結(jié)合Uniprot 數(shù)據(jù)庫，得到金錢草的靶點(diǎn)基因。在OMIM（http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“kidney stone”搜索已報(bào)道與腎結(jié)石相關(guān)的基因，并去除重復(fù)靶點(diǎn)。然后把所得疾病靶點(diǎn)與金錢草靶點(diǎn)基因使用R 語言程序進(jìn)行對(duì)比，以此篩選出共同的靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.3 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 通過將金錢草和腎結(jié)石共同作用的靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），限定物種為人，進(jìn)行蛋白互作用分析（PPI）。為確保數(shù)據(jù)的可靠性，選取high score＞0.9 的高置信度，保存結(jié)果。

1.4 基因本體（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 首先，對(duì)上述所得的靶點(diǎn)進(jìn)行ID 轉(zhuǎn)換，使用R 語言將金錢草與腎結(jié)石的共作靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成entrezID；其次，在R 語言中調(diào)用生物類的程序包，如clusterProfiler，bioconductor 等進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理；然后，運(yùn)行R 語言得到GO 和KEGG 富集分析的條形圖、氣泡圖、通路圖及包含P值的結(jié)果，如果是圖形則設(shè)置只顯示P值最小的前20個(gè)；最后，使用Perl 將轉(zhuǎn)換的entrez ID 變成原始基因靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)OB、DL值篩選到符合條件的10 種化學(xué)成分，見表1。

表1 金錢草的10 種化學(xué)成分

2.2 作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 將TCMSP、Swisstargetprediction 數(shù)據(jù)庫得到的所有靶點(diǎn)，刪除重復(fù)并去除假陽性，整合得到金錢草活性成分作用靶點(diǎn)331個(gè)；疾病靶點(diǎn)與金錢草靶點(diǎn)基因?qū)Ρ?，篩選出二者共同靶點(diǎn)82個(gè)，繪制韋恩圖見圖1。

圖1 作用靶點(diǎn)

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理可視化 通過Cytoscape 3.7.1 軟件將金錢草10個(gè)活性成分與82個(gè)金錢草治療腎結(jié)石的靶點(diǎn)相連，繪制出金錢草的“藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 金錢草與腎結(jié)石蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選到的靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，共涉及82個(gè)節(jié)點(diǎn)，188 條邊。其中排名前5 的蛋白包括HSP90AA1（20）、EGFR（15）、CCND1（13）、ESR1（13）和RELA（13），見圖3、圖4。

圖3 金錢草-腎結(jié)石蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI 中的核心基因

2.5 GO 功能富集分析 將藥物和疾病共同作用的82個(gè)靶點(diǎn)經(jīng)R 語言進(jìn)行GO 功能富集分析，前20個(gè)功能的GO 功能富集分析見圖5，其涉及NFkappaB 結(jié)合、熱休克蛋白結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇結(jié)合、組蛋白激酶活性等生物學(xué)過程。

圖5 金錢草治療腎結(jié)石候選靶點(diǎn)的GO 富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 將所得的82個(gè)共作靶點(diǎn)使用R 語言程序進(jìn)行KEGG 通路富集分析，運(yùn)行后得到119 條通路，見圖6。結(jié)果顯示，金錢草治療腎結(jié)石除了涉及Prostate cancer、Fluid shear stress and atherosclerosis 等顯著性較高的通路，還涉及了Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Apoptosis、Proteoglycans in cancer、TNF signaling pathway、p53 signaling pathway、MicroRNAs in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、Bladder cancer、Human cytomegalovirus infection、Colorectal cancer、Measles、small cell lung cancer、Human immunodeficiency virus 1 infection、MAPK signaling pathway、Endocrine resistance、Hepatitis C 及Pancreatic cancer等18 條具有顯著性的通路。

圖6 金錢草-腎結(jié)石潛在靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析

3 討論

本研究結(jié)果顯示，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共篩選出OB≥30%和DL≥0.18 的金錢草候選成分10個(gè)。將金錢草靶點(diǎn)與腎結(jié)石靶點(diǎn)取交集，得到藥物-疾病共作靶點(diǎn)82個(gè)。在金錢草的藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中清晰可見相同成分作用于多靶點(diǎn)，每1個(gè)靶點(diǎn)也可對(duì)應(yīng)多個(gè)成分，充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。與此同時(shí)，活性成分中度值最高的包括槲皮素、山柰酚和金合歡素，這些成分均對(duì)腎臟疾病具有治療作用。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，除具有抗氧化和抗腫瘤等作用外，還能夠減少細(xì)胞凋亡、緩解炎癥反應(yīng)[8]。有研究顯示[9]，槲皮素通過作用于緊密連接蛋白（claudins），導(dǎo)致上皮屏障更緊密，可能會(huì)減少鈉、鈣和水的重吸收，從而防止腎結(jié)石的形成。山柰酚存在于多種中藥之中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。研究發(fā)現(xiàn)[10]，山柰酚在糖尿病腎病中能夠有效提高AGE 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中的超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量，抑制活性氧生成并防止氧化應(yīng)激等，為未來治療糖尿病腎病提供了新的思路。金合歡素是一種天然樹膠衍生物，具有抗炎、抗氧化作用。研究證實(shí)[11]，金合歡素對(duì)動(dòng)物和人類的腎臟均具有保護(hù)作用。本次研究中靶點(diǎn)中度值最高的為CYP1B1、ALOX5、ESR2。CYP1B1 屬于細(xì)胞色素P450 超家族，參與了多種化合物代謝（包括致癌物）。既往研究表明[12]，CYP1B1可能通過誘導(dǎo)CDC20 表達(dá)并通過下調(diào)DAPK1 抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)腎細(xì)胞癌的發(fā)展，為腎細(xì)胞癌的治療提供了新的方向。ALOX5 是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠催化花生四烯酸向白三烯A4 轉(zhuǎn)化的限速酶，在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO），葉酸腎病和直系同源小鼠多囊性腎臟疾病模型中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而抑制ALOX5通路可抑制單側(cè)輸尿管梗阻、葉酸腎病患者的腎臟纖維化[13]。草酸是導(dǎo)致腎結(jié)石發(fā)病的重要物質(zhì)。據(jù)報(bào)道[14]，ESR2 信號(hào)可通過乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AGT1）表達(dá)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)抑制草酸的生物合成，進(jìn)而抑制草酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。據(jù)此，推測(cè)槲皮素、山柰酚、金合歡素可能作用于CYP1B1、ALOX5、ESR2 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，在金錢草的藥理中發(fā)揮重要作用。

基于STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò)，分析得到HSP90AA1（20）、EGFR（15）、ESR1（13）、RELA（13）等治療腎結(jié)石的核心靶點(diǎn)。它們是參與腎結(jié)石的病理過程，也是金錢草治療腎結(jié)石的關(guān)鍵靶點(diǎn)所在。HSP90AA1 是HSP90 的一種亞型。HSP90是一種普遍表達(dá)，高度保守的應(yīng)激蛋白，能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)其活性。有研究指出[15]，在腎臟內(nèi)轉(zhuǎn)染HSP90α 或HSP90β 可以有效防止缺血/再灌注腎損傷。RELA 在調(diào)控炎癥的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)——NF-κB 信號(hào)通路中起著極其重要的作用，而腎結(jié)石的發(fā)病又與NF-κB 信號(hào)通路密切相關(guān)[16]。

GO 富集結(jié)果表明，金錢草的活性成分靶點(diǎn)會(huì)影響NF-κappB 結(jié)合、熱休克蛋白結(jié)合。NF-κappB是轉(zhuǎn)錄因子家族通用名稱，能夠調(diào)節(jié)涉及免疫、炎癥和細(xì)胞存活的基因。Lu Y 等[17]通過對(duì)建立的miRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，提出NF-κappB 可能在尿鈣過多的尿路結(jié)石癥中起關(guān)鍵作用。有研究表明[18]，熱休克蛋白HSP90 能夠充當(dāng)腎小管上皮細(xì)胞頂膜上一水草酸鈣晶體的潛在受體，參與晶體的內(nèi)吞/內(nèi)化作用，從而預(yù)防腎結(jié)石的形成。此外，金錢草活性成分靶點(diǎn)還可影響核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇結(jié)合、組蛋白激酶活性等生物學(xué)過程。KEGG 通路分析顯示，前列腺癌信號(hào)通路為顯著性最高的信號(hào)通路。該通路包含了PI3K-Akt、Apoptosis、MAPK、p53 等主要信號(hào)通路，其中MAPK 信號(hào)通路涉及了細(xì)胞增殖、分化、遷移等多種細(xì)胞功能。研究表明，草酸鹽是腎結(jié)石形成的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)[19]，草酸鹽和草酸鈣晶體均選擇性激活了p38-MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此通過抗氧化劑阻斷NF-kB 和p38-MAPK 激活可能是治療和預(yù)防尿酸結(jié)石的有效策略。p53 激活是由包括DNA 損傷，氧化應(yīng)激和激活的癌基因等應(yīng)激信號(hào)所誘導(dǎo)的。此外，p53 蛋白還可對(duì)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老或凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。既往研究表明，草酸鹽誘導(dǎo)的體外細(xì)胞凋亡增加可能有助于結(jié)石形成。Miyazawa K 等[20]對(duì)結(jié)石大鼠進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟中p53 基因的mRNA 上調(diào)，由此推測(cè)，腎結(jié)石的發(fā)病可能與p53 上調(diào)有關(guān)。

本研究不足：本實(shí)驗(yàn)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是基于生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)庫的計(jì)算得出結(jié)果，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步篩選和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而明確金錢草治療腎結(jié)石的主要調(diào)控靶點(diǎn)。

綜上所述，金錢草中槲皮素、山柰酚、金合歡素等有效成分可能通過影響NF-κB 結(jié)合、熱休克蛋白結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇結(jié)合、組蛋白激酶活性等機(jī)制發(fā)揮抗腎結(jié)石的作用。