C C L2 調(diào)節(jié)血管生成及在骨重建修復(fù)中的運(yùn)用

彭中華，彭詩(shī)婷，龐 河，彭 鑫，譚奇超，魏 波

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 湛江 524023；2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 珠海 519000；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，廣東 湛江 524023）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)及交通事業(yè)的快速發(fā)展，高處墜落、車禍等高能量創(chuàng)傷造成的復(fù)雜性骨折頻發(fā)，骨折類型以開放性、粉碎性為主，創(chuàng)傷后易造成骨愈合不良、骨不愈合[1]，盡管骨組織在體內(nèi)可完全再生，但超過(guò)臨界長(zhǎng)度的骨缺損難以自行修復(fù)與重建[2]，漫長(zhǎng)的康復(fù)過(guò)程給患者造成巨大的身體、經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)，因此備受關(guān)注。快速修復(fù)巨大骨創(chuàng)傷缺損成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。在體內(nèi)，趨化因子CC 基序配體2（CCL2）可由許多不同類型的細(xì)胞在氧化應(yīng)激之后產(chǎn)生，可以促進(jìn)血管新生、干細(xì)胞遷移、骨組織形成，加速骨的缺損修復(fù)等，對(duì)應(yīng)用CCL2 促進(jìn)骨的快速修復(fù)重建提供了新的思路。本文現(xiàn)對(duì)CCL2 促血管生成的作用機(jī)制及其在骨重建修復(fù)中的應(yīng)用綜述如下，旨在為CCL2 在骨折愈合中的應(yīng)用研究及治療研究提供參考。

1 CCL2 的介紹

趨化因子CC 基序配體2（CCL2）又稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1），是CC-基序趨化因子家族的成員之一。CCL2 是第1個(gè)發(fā)現(xiàn)的人類趨化因子，也是單核細(xì)胞的有效趨化因子[3]，同時(shí)還具有促炎和抗炎的作用[4]，是涉及對(duì)炎癥部位招募和轉(zhuǎn)運(yùn)單核免疫細(xì)胞的小趨化因子[5]。趨化因子是可以調(diào)節(jié)特定白細(xì)胞亞群的趨化性和代謝活性的低分子量分泌蛋白，是一個(gè)大家族的小分泌蛋白，其信號(hào)通過(guò)細(xì)胞表面G 蛋白偶聯(lián)的七肽趨化因子受體，具有刺激細(xì)胞遷移的能力，白細(xì)胞尤甚。因此，趨化因子在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起著核心作用，并參與所有保護(hù)性或破壞性免疫和炎癥反應(yīng)。除了誘導(dǎo)細(xì)胞停滯或粘附之外，趨化因子還可以刺激其他類型的定向和非定向遷移行為[6]。CCL2 是CC 趨化因子受體2（CCR2）的配體，對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞具有趨化作用[7]。CCL2 由許多不同的細(xì)胞類型在氧化應(yīng)激之后產(chǎn)生或誘導(dǎo)后表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌、系膜細(xì)胞、星形細(xì)胞、單核細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等[8]，是單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞等細(xì)胞的有效化學(xué)誘導(dǎo)物；趨化因子與其同源受體的結(jié)合是觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和發(fā)揮趨化性等生物學(xué)效應(yīng)的必要途徑。CCL2 介導(dǎo)其通過(guò)CCR 的作用，主要是CCR2，與CCL2 不同，CCR2 表達(dá)主要限于血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞[9]。

2 CCL2 的主要功能

2.1 CCL2 與血管生成、創(chuàng)面愈合 CCL2 對(duì)血管生成起著重要作用，但其中的機(jī)制機(jī)制尚不十分明確。研究表明[10]，CCL2 參與了新血管生成的發(fā)生，包括單核巨噬細(xì)胞的募集和靶細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，CCL2 通過(guò)CCL2-CCR2 信號(hào)軸調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，在新血管生成中起關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞可以通過(guò)清除細(xì)胞碎片、破壞入侵的病原體、產(chǎn)生大量細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)愈合過(guò)程。趨化因子是調(diào)節(jié)靶細(xì)胞遷移的小信號(hào)分子家族的成員，CCL2 通過(guò)與其同源受體CCR2 或CCR4 結(jié)合，激發(fā)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的趨化潛能，這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)新血管生成，而新血管生成是傷口愈合、組織生長(zhǎng)的必要過(guò)程。血管生成，即從現(xiàn)有血管中形成新生血管，是由血管生成和血管抑制性細(xì)胞因子精確控制的。所募集的巨噬細(xì)胞或駐留的巨噬細(xì)胞根據(jù)特定的微環(huán)境與趨化因子結(jié)合后遷移到病損部位[11]，促進(jìn)血管生成。在新血管生成過(guò)程中，CCL2 直接促進(jìn)血管內(nèi)皮的遷移，巨噬細(xì)胞在CCL2 的刺激下，能夠分泌多種促血管生成細(xì)胞因子如VEGF-A、IFN-γ 和IL-6，直接增強(qiáng)血管生成作用[12]，其中VEGF-A 是參與愈合過(guò)程的最重要的促血管生成因子之一。巨噬細(xì)胞的特征在于其表型擁有不同的屬性，在特定的微環(huán)境可誘導(dǎo)分化成獨(dú)特的亞型，當(dāng)被不同類型的趨化因子如CCL2、CCL5 和CX3CL1 募集時(shí)，巨噬細(xì)胞可釋放一系列血管生成或血管生成抑制因子，如VEGF-A、THBS-1 和ADAMTS-1，使細(xì)胞因子的表達(dá)朝向促血管生成或抗血管生成方向傾斜[13]。

還有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，CCL2 通過(guò)上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)水平，促進(jìn)人臍靜脈和皮膚內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成[14]，在體外同樣能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成。機(jī)體內(nèi)分泌的CCL2通過(guò)向內(nèi)皮細(xì)胞募集平滑肌細(xì)胞，參與介導(dǎo)組織因子的血管生成作用，并促進(jìn)體內(nèi)基質(zhì)膠栓新生微血管的成熟。有學(xué)者利用CCL2 改善小鼠后肢缺血模型中的血流情況[15]，證明了CCL2/CCR2 信號(hào)軸在內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新血管生成中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，并能促進(jìn)血流的恢復(fù)。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[16]，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的CCL2 能夠加速創(chuàng)面閉合，在促進(jìn)血管生成、上皮再生和減輕炎癥反應(yīng)、加速皮膚創(chuàng)面愈合起著重要作用。同時(shí)，CCL2 也可通過(guò)與其特異性受體CCR2 結(jié)合，在乳腺癌組織中可促進(jìn)血管形成[17]。Ishida Y 等[18]在構(gòu)建糖尿病小鼠皮膚缺損模型中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組在切除皮膚后出現(xiàn)愈合障礙，新血管生成、CCL2 的表達(dá)和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，實(shí)驗(yàn)組外用CCL2 提取物涂層即可逆轉(zhuǎn)損傷后皮膚的愈合，提高傷口愈合率、促進(jìn)新血管生成、膠原積聚，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 表達(dá)及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等，因而可知局部應(yīng)用CCL2 可以成為治療創(chuàng)面修復(fù)缺陷、促進(jìn)皮膚創(chuàng)面新血管生成和膠原沉積的有效方法。

2.2 CCL2 與炎癥浸潤(rùn)、細(xì)胞遷移 CCL2 是一種特異性因子，能夠吸引、激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是受體CCR2 的主要配體。趨化因子通過(guò)與CCR2 趨化因子受體的相互作用，介導(dǎo)單核細(xì)胞從骨髓中分離并募集到炎癥組織中，促炎細(xì)胞因子可上調(diào)其表達(dá)。CCL2-CCR2 軸通過(guò)影響功能相關(guān)和極化相關(guān)基因的表達(dá)，下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化[19]。PI3K 和MAPK 信號(hào)通路參與細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和侵襲的調(diào)控，CCL2 可通過(guò)激活A(yù)kt 和MAPK/Erk1/2 信號(hào)通路，增加增殖細(xì)胞核抗原、Survivin 和基質(zhì)金屬蛋白酶2 的表達(dá)，降低金屬蛋白酶組織抑制因子1 和2 的表達(dá)，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的存活、增殖和遷移，除了在炎癥反應(yīng)中的作用外，CCL2 還通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號(hào)通路（5-7）上調(diào)Survivin 的表達(dá)，進(jìn)一步刺激細(xì)胞的增殖和存活?？笴CL2 中和抗體和CCR2 拮抗劑可以完全降低CCL2 誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞的存活率、增殖率和侵襲力[20]。

研究表明[21]，趨化因子成員CCL2、CCL7、CCL8、CCL12 和CCL13 都能與趨化因子受體CCR2 結(jié)合，但CCL2/CCR2 被認(rèn)為是單核/巨噬細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的最有效的介質(zhì)，通過(guò)CCR2 受體，CCL2 誘導(dǎo)炎性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向外周組織的遷移。CCL2 具有幾種血管生成特性，可以通過(guò)CCR2 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[22]，CCL2 通過(guò)誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)和募集巨噬細(xì)胞，在病變形成中發(fā)揮作用[23]。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)受到過(guò)度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其他巨噬細(xì)胞釋放的CC-趨化因子的高度調(diào)節(jié)，CCL2 在傷后第1周內(nèi)表達(dá)的多種趨化因子表達(dá)比例最高。趨化因子調(diào)節(jié)關(guān)鍵的血管生成過(guò)程，如炎癥細(xì)胞向損傷部位的募集，為增殖和遷移細(xì)胞提供支持，并形成肉芽組織；可見CCL2具有顯著刺激內(nèi)皮細(xì)胞血管形成和遷移的能力[24]。CCL2 及其受體CCR2 同時(shí)是參與腫瘤微環(huán)境的主要趨化因子，通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的動(dòng)員和浸潤(rùn)，從骨髓募集單核細(xì)胞到周圍炎癥部位；且CCL2-CCR2軸可以通過(guò)激活ERK1/2-MMP2/9 途徑促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[25]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[26]，過(guò)表達(dá)CCL2 的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）能夠修復(fù)SD 大鼠腦卒中模型的功能缺陷，這是由于腦梗死區(qū)CCL2 水平升高導(dǎo)致干細(xì)胞的遷移頻率增加，從而促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生，減少神經(jīng)炎癥，恢復(fù)神經(jīng)的功能。

3 骨重建再生與血管生成

骨是一種高度血管化的組織，具有獨(dú)特而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。長(zhǎng)骨由包含血管滲透通道網(wǎng)絡(luò)的外周皮質(zhì)外殼和高度血管化的內(nèi)部骨髓間隙組成[27]。生理骨質(zhì)的重塑是具有生長(zhǎng)、修復(fù)和礦物質(zhì)穩(wěn)固的作用[28]。長(zhǎng)骨骨折的愈合是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，包括炎癥機(jī)化、修復(fù)和塑形改造3個(gè)主要階段。在炎癥機(jī)化階段，血管將包括血小板、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞運(yùn)送到損傷部位，這些細(xì)胞被激活，以釋放炎癥細(xì)胞因子來(lái)吸引其他細(xì)胞。在修復(fù)過(guò)程中，骨膜細(xì)胞在創(chuàng)面遷移分化成軟骨細(xì)胞，形成骨痂，隨后基質(zhì)鈣化，血管生成，軟骨細(xì)胞被成骨細(xì)胞取代。最后，致密的骨通過(guò)重塑形成，成骨細(xì)胞成熟為破骨細(xì)胞。其中血管被認(rèn)為是啟動(dòng)骨折愈合的關(guān)鍵因素，在細(xì)胞遷移、增殖和早期分化中起關(guān)鍵作用。血管生成的過(guò)程在很大程度上是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞將現(xiàn)有血管萌發(fā)到缺氧區(qū)，再由內(nèi)皮細(xì)胞排列并連接到現(xiàn)有血管。

骨組織的再生基于成骨和血管生成過(guò)程之間相互作用，能夠驅(qū)動(dòng)骨生長(zhǎng)和組織修復(fù)。骨再生的成敗取決于血管化過(guò)程的中心作用，尤其是血管化的可能性是骨再生的關(guān)鍵。血管的生成為組織修復(fù)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子、礦物質(zhì)和氧氣，血管形成是骨形成、骨骼發(fā)育和骨整合過(guò)程中必不可少的組成部分，在生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)運(yùn)中起著關(guān)鍵作用，使細(xì)胞能夠存活和相互作用。骨脈管系統(tǒng)在骨構(gòu)建，新的血管生長(zhǎng)在原發(fā)性骨發(fā)育以及成人骨折修復(fù)過(guò)程中都是必不可少的。骨修復(fù)和骨重塑都涉及血管生成和成骨途徑之間的激活和相互作用[29]。骨血管生成不足或不合適與骨形成減少有關(guān)[30]，血管系統(tǒng)的不利影響直接抑制骨組織的再生，延遲骨的愈合[31]。

CCL2 在骨重塑和骨骼轉(zhuǎn)移的機(jī)制中起關(guān)鍵作用。CCL2 通過(guò)其對(duì)單核細(xì)胞募集，激活血源性相關(guān)巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的影響。CCL2 通過(guò)CCR2 作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（VEGF-A）的釋放實(shí)現(xiàn)血管生成[9]。血源性巨噬細(xì)胞是從單核細(xì)胞中產(chǎn)生的，單核細(xì)胞從血液中吸收到組織部位后成熟，這些單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞通過(guò)多種趨化因子吸收，CCL2-CCR2 信號(hào)軸對(duì)損傷后巨噬細(xì)胞向炎癥部位的募集[32]促進(jìn)血管的生成。在骨組織工程中，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（HMSCs）通常被用作成骨細(xì)胞和再生骨的骨祖細(xì)胞，而內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）通常用于血管生成，干細(xì)胞是CCL2 相對(duì)主要的來(lái)源，通過(guò)CCL2/CCR2 軸傳遞基本信號(hào)，招募巨噬細(xì)胞聚集炎癥部位，釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，以實(shí)現(xiàn)血管生成對(duì)細(xì)胞的增殖和隨后組織的再生[33]。使用HMSCs 的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是，其內(nèi)源性血管生成細(xì)胞因子的產(chǎn)生消除了外源性治療可溶性因子的需求，這些治療可溶性因子在體內(nèi)和體外均能穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞形成的血管結(jié)構(gòu)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)非靶向組織中的血管生成，刺激細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，促進(jìn)功能血管的發(fā)展[25]，以促進(jìn)骨創(chuàng)傷的重建愈合。另外，CCL2 通過(guò)參與破骨細(xì)胞的分化和成熟參與骨的再建，通過(guò)應(yīng)力骨折（SFx）啟動(dòng)特異性誘導(dǎo)，激活SFx 的靶向重塑，并在SFx 的骨膜出口處由成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞表達(dá)[34]。Sumi K 等[35]利用RAW264 細(xì)胞系作為破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的模型，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)CCR2 產(chǎn)生CCL2 作為破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的趨化信號(hào)。因此，認(rèn)為CCL2 是破骨細(xì)胞生物學(xué)的調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞生存和促成骨分化的作用，參與骨的重建，尤其是破骨細(xì)胞的分化。

4 總結(jié)

CCL2 對(duì)于巨噬細(xì)胞的聚集、新生血管的生成、組織細(xì)胞的遷移、骨組織的再生等作用雖然已有初步的確定，但其中包含的具體機(jī)制非常復(fù)雜，且CCL2 對(duì)于骨缺損修復(fù)在臨床上的應(yīng)用較少。CCL2對(duì)骨重建修復(fù)的有效使用劑量，以及具體通過(guò)哪些信號(hào)通路發(fā)生作用尚不清楚，甚至可能存在藥物劑量的依賴性以及時(shí)效作用性，其他趨化因子也可能對(duì)CCL2 存在協(xié)同或者拮抗的效應(yīng)，如能提高及精準(zhǔn)地利用CCL2 的效能對(duì)臨床上促進(jìn)骨創(chuàng)傷缺損的快速修復(fù)與重建有著較好的前景。