竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

楊 煜，聞 宇，王友聯(lián)，呂文偉，康勁松*，李洪巖*

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130041)

心肌缺血可導(dǎo)致心律不齊甚至心力衰竭等嚴(yán)重的并發(fā)癥，成為對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅的疾病之一。竹節(jié)參總皂苷主要皂苷成分是竹節(jié)參皂苷IV、V和人參皂苷Re等，具有顯著降低中動(dòng)脈栓塞模型大鼠全血粘度、紅細(xì)胞聚集性及增加紅細(xì)胞變形性的功效[1-2]，能夠明顯增加Bcl-2蛋白表達(dá)，減少Bax蛋白表達(dá)，減少凋亡，改善大鼠神經(jīng)功能的受損程度[3]。缺血再灌注時(shí)氧自由基生成增多，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生破壞[4-6]，高能磷酸化合物缺乏，總腺苷酸水平減少，同時(shí)鈣超載，形成磷酸鈣損傷線(xiàn)粒體功能，使 ATP 產(chǎn)生障礙。本試驗(yàn)從心肌酶學(xué)、心肌細(xì)胞凋亡[7]及超微結(jié)構(gòu)方面觀察竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)模型的治療作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、地奧心血康50.0 mg·kg-1組、竹節(jié)參總皂苷50.0 mg·kg-1及100.0 mg·kg-1組，灌胃一周，每天一次。大鼠用乙醚麻醉罐麻醉后，鼠板上仰臥位固定，在心臟周?chē)裘?、消毒并做荷包縫合，在左側(cè)第3肋間開(kāi)胸，暴露心臟，用大鼠擴(kuò)胸器將心臟擠出胸腔，迅速結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支1/2處，將心臟迅速送回胸腔，用力擠出胸腔內(nèi)血液和空氣，收攏荷包關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組僅留線(xiàn)，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。30 min后開(kāi)胸，剪斷結(jié)扎線(xiàn)造心肌缺血再灌注損傷模型。120 min后，大鼠腹主動(dòng)脈插管取血，3 500 r/min，離心10 min，取上清液測(cè)定AST、LDH、MDA、SOD、GSH- Px含量。取心尖及左室心肌組織制成1×109/L 細(xì)胞懸液，加 Annexin-V-FITC室溫避光反應(yīng)10 min，加PI混勻室溫避光反應(yīng) 5 min，于1 小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。切取一小塊梗死區(qū)心肌組織，經(jīng)4%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定，蒸餾水沖洗，乙醇、丙酮由低濃度到高濃度梯度系列脫水，環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋，高溫聚合后，半薄切片定位到心肌縱切面，再進(jìn)行超薄切片，最后經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重電子染色，透射電子顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的改變。

2 結(jié)果

2.1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠血清AST，LDH活性及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

模型組大鼠血清AST、LDH及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.001)，說(shuō)明心肌缺血再灌注損傷模型制備成功。地奧心血康50.0 mg·kg-1組和竹節(jié)參總皂苷50.0 mg·kg-1、100.0 mg·kg-1組與模型組比較，AST分別降至模型組含量的70.4%、72.7%和66.7%(P<0.05、P<0.05、P<0.001)。LDH的含量分別降至模型組含量的71.4%、76%和66.1%。(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)則分別比模型組下降了20%、25.9%和27.5%(P<0.001、P<0.05、P<0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明竹節(jié)參總皂苷能夠明顯減輕心肌缺血再灌注造成的心肌損傷，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠心肌缺血再灌注 AST，LDH活性及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

2.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px的影響

從表2中可以看出 模型組血清MDA水平與假手術(shù)組相比較明顯升高(P<0.001)，SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.001、P<0.01)。給予地奧心血康50.0 mg·kg-1及竹節(jié)參總皂苷50.0 mg·kg-1、100.0 mg·kg-1后，MDA水平明顯降低(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，而SOD及GSH-Px活性明顯升高(P<0.05、P<0.05、P<0.05)。

表2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠心肌缺血再灌注 MDA、SOD、GSH-Px的影響

2.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組心肌細(xì)胞肌膜連續(xù)，于Z線(xiàn)處下陷，肌絲束排列整齊，肌節(jié)的結(jié)構(gòu)清晰，線(xiàn)粒體嵴致密、結(jié)構(gòu)清晰,沿長(zhǎng)軸整齊地排列在肌絲束之間。模型組心肌細(xì)胞胞膜破損，肌絲束排列紊亂、可見(jiàn)廣泛的斷裂溶解改變，有的心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌節(jié)合并形成異常的收縮帶，線(xiàn)粒體移位，局部空化，也有部分線(xiàn)粒體呈完全的腫脹空化狀態(tài)。與模型組相比較，地奧心血康組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改善明顯，除部分肌絲束仍有輕微斷裂改變外，大部分肌絲束排列整齊,肌節(jié)及明暗帶結(jié)構(gòu)清晰，線(xiàn)粒體數(shù)量略有減少，但未見(jiàn)空化改變。竹節(jié)參總皂苷50.0 mg·kg-1組心肌細(xì)胞仍可見(jiàn)部分肌絲束呈輕微斷裂改變，肌絲排列松散,肌節(jié)及明暗帶結(jié)構(gòu)尚可，線(xiàn)粒體基質(zhì)疏松，局部可見(jiàn)空化改變。竹節(jié)參總皂苷100.0 mg·kg-1組大部分心肌細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)到整齊排列的肌絲束,肌節(jié)及明暗帶結(jié)構(gòu)清晰，線(xiàn)粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)略顯疏松。

3 討論

MIRI發(fā)生時(shí)，由于能量代謝障礙產(chǎn)生大量氧自由基，自由基進(jìn)一步損害線(xiàn)粒體，造成線(xiàn)粒體功能障礙，加重能量代謝障礙。這種惡性循環(huán)是造成MIRI心肌組織損傷和細(xì)胞死亡的重要原因[8]。實(shí)驗(yàn)中觀察到大鼠心肌缺血再灌注后，模型組大鼠血清中心肌酶AST和LDH含量明顯增加，說(shuō)明有大量的心肌細(xì)胞發(fā)生損傷，與李玲美等結(jié)果一致[9]。而竹節(jié)參總皂苷能夠明顯降低血清中AST和LDH的含量，說(shuō)明竹節(jié)參總皂苷能夠減輕缺血再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷。

大量研究表明，組織缺血再灌注過(guò)程中生成的大量自由基可以進(jìn)一步加劇組織的損傷，使細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞。SOD和MDA是目前公認(rèn)的能反映氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的指標(biāo)[10]。MDA是生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量間接反映機(jī)體組織氧化應(yīng)激狀態(tài)。SOD可直接清除超氧陰離子，是維持機(jī)體氧化還原平衡狀態(tài)的重要抗氧化酶之一，GSH-Px 具有保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受損害的作用，這些抗氧化酶是體內(nèi)抗氧化的第一道防線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，竹節(jié)參總皂苷可明顯降低血清MDA的含量，增加血清SOD、GSH-Px的含量。說(shuō)明竹節(jié)參總皂苷可能通過(guò)增加SOD、GSH-Px的含量，減少缺血再灌注過(guò)程中生成的自由基對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用，。在缺血早期細(xì)胞凋亡數(shù)量甚至多于細(xì)胞壞死數(shù)量，缺血再灌注過(guò)程中心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)相關(guān)性[11-12]。模型組大鼠心肌細(xì)胞在缺血再灌注后，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增高，心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也明顯破壞，可見(jiàn)心肌細(xì)胞膜破損，肌絲束廣泛的斷裂溶解，線(xiàn)粒體空化。給予竹節(jié)參總皂苷后，心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯下降。心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也得到了明顯的改善，心肌細(xì)胞中僅可見(jiàn)部分肌絲束呈輕微斷裂改變，肌節(jié)及明暗帶結(jié)構(gòu)尚可，線(xiàn)粒體未見(jiàn)明顯的空化改變。說(shuō)明竹節(jié)參總皂苷能夠保護(hù)心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及減少細(xì)胞的凋亡發(fā)生。

綜上所述，竹節(jié)參總皂苷能夠保護(hù)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，減輕心肌的缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制可能與清除氧自由基，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。