基于UPLC-DAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)及6種成分含量測定的桑葉質(zhì)量研究*

禹鵬鑫，陳穎，張麗娟，余河水，2，3，宋新波，2，3，李正，2，3

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津 301617；2．組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；3．中藥制藥工程市級實驗教學(xué)示范中心，天津 301617）

桑葉為?？浦参锷orus alba L．的干燥葉片，2020版《中國藥典》收載桑葉為初霜后釆收，性味甘、苦、寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱，清肺潤燥，清肝明目的功效，用于風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花等癥[1]。桑葉首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，能下氣益陰，又能止咳，有補益之功，是中醫(yī)清熱解毒之要藥[2]?，F(xiàn)代文獻研究表明，桑葉中主要含有黃酮類、酚酸類、生物堿類、香豆素類、氨基酸類、多糖類等化學(xué)成分[3-10]。現(xiàn)代藥理研究表明，桑葉具有降血糖、調(diào)血脂、預(yù)防粥樣動脈硬化、抑制肥胖、抗腫瘤、抗炎、降壓、抗病毒和抗抑郁等多種藥理作用[11-18]。目前文獻報道的桑葉含量測定主要是測定綠原酸[19-20]、蘆丁[21]、異槲皮苷、阿魏酸[22]、兒茶素[23]和 1-脫氧野尻霉素等[24]。桑葉產(chǎn)地豐富，主要分布在湖北、湖南、四川、河北、安徽和浙江等地區(qū)，桑葉的質(zhì)量參差不齊，目前對桑葉質(zhì)量控制的標準尚不完整。本研究通過建立超高效液相色譜法（UPLC）-DAD指紋圖譜方法，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)與多指標含量測定方法綜合評價本實驗中的22批桑葉質(zhì)量，初步建立用于桑葉質(zhì)量評價的方法，以期為桑葉質(zhì)量標準的建立提供科學(xué)實驗依據(jù)，使桑葉得到更深度的開發(fā)利用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀（Agilent公司）；AGILENT UPLC?EC C18色譜柱（2．1 mm×100mm，1．7μm，Agilent公司）；KQ2200DBV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑 沒食子酸甲酯（批號：99-24-1，純度≥98%），隱綠原酸（批號：905-99-7，純度≥98%），異槲皮苷（批號：482-35-9，純度≥98%），山奈酚-3-O-蕓香糖苷（批號：17650-84-9，純度≥98%），紫云英苷（批號：480-10-4，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；蘆?。ㄅ枺?AQDGGPK，純度≥91．9%）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇、磷酸均為色譜醇（Fisher公司），無水乙醇為分析級（朝陽赫成化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

22批桑葉藥材購自河北、河南、安徽、湖北、江蘇、浙江、四川，經(jīng)由天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李天祥教授鑒定均為?？粕僦参锷＃∕orus alba L．）的干燥成熟樹葉。22批藥材來源信息詳見表1。

表1 22批藥材來源信息Tab.1 Sources information of 22 batches of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為Agilent EC-C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流動相：0．2%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～8 min，8%～15%B；8～16 min，15%～30%B；16～18 min，30%～55%B；18～23 min，55%～95%B；流速：0．2 mL/min；柱溫 35 ℃；進樣體積：2 μL；檢測波長：0～7 min，290 nm；7～23 min，360 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取桑葉粉末（過3號篩）約1 g，精密稱定，加80%乙醇溶液40 mL，密塞，超聲（360 W，40 kHz）45 min，過濾，濾渣復(fù)提一次，合并濾液，減壓濃縮至干，加100%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，加100%甲醇定容至刻度，搖勻，測定前用0．22 μm的微孔濾膜過濾。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸甲酯、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷對照品適量，至5 mL容量瓶，加100%甲醇溶解定容至刻度，配置成質(zhì)量濃度1．244、0．478、0．288、0．596、0．328、0．278 mg/mL 的混合對照品溶液。測定前用 100%甲醇稀釋 0，2，4，8，16和32倍，得到系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，備用。

2.3 UPLC指紋圖譜建立

2.3.1 方法學(xué)考察 按照方法學(xué)考察要求，取“2．2．1”項下供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件進樣測定，以蘆丁峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3．0%（n=6），表明本方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。

2.3.2 方法建立及相似度評價 分別取22批桑葉樣品粉末，按“2．2．1”項下方法制備供試品溶液，再按“2．1”項下色譜條件進樣測定，將22批桑葉粉末的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以S18樣品的指紋圖譜為參照圖譜，中位數(shù)法進行自動匹配，多點校正，生成指紋圖譜共有模式及疊加圖譜，選擇桑葉中的主要成分且分離較好的色譜峰作為共有峰，共標定了16個共有峰，其中峰7（蘆?。┓€(wěn)定性好，色譜響應(yīng)值較高，分離度好，保留時間適中，故選擇其作為參照峰（S）。經(jīng)對照品指認，鑒定出6個成分，峰4為沒食子酸甲酯，峰5為隱綠原酸，峰7為蘆丁，峰8為異槲皮苷，峰9為山奈酚-3-O-蕓香糖苷，峰10為紫云英苷。將22批桑葉藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜匹配，計算相似度，相似度結(jié)果見表2，色譜圖見圖1。由表2可知，22批桑葉相似度差異較大，說明化學(xué)成分存在一定的差異；因此計算各指紋圖譜共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，由結(jié)果可知共有峰相對保留時間差異較小，RSD值為0～0．83%，說明不同批次的桑葉化學(xué)成分相似，但各共有峰相對峰面積差值較大，RSD值為0～158．16%，說明不同批次的桑葉化學(xué)成分含量存在一定的差異，可能由于受到氣候、土壤等環(huán)境因素以及采收加工過程中人為因素的影響，導(dǎo)致藥材內(nèi)在化學(xué)成分的含量存在一定差異。相似度的比較并不能完全顯著區(qū)分成分的差異性，故選取16個共有峰的峰面積進行聚類分析和主成分分析。

圖1 22批桑葉藥材UPLC-DAD指紋圖譜Fig.1 UPLC-DAD fingerprint of 22 batches of mulberry leaves

表2 22批桑葉藥材相似度評價結(jié)果Tab.2 Similarity evaluation of 22 batches of mulberry leaves

2.3.3 聚類分析 將22批桑葉藥材樣品中各共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，運用SPSS 25．0軟件，利用“描述統(tǒng)計”方法標準化后，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式，對22批桑葉藥材進行聚類分析。相似度越大，兩個樣品之間的距離越近，22批桑葉藥材樣品分為4類，S7、S8、S9、S14、S15、S16 號樣品聚為一類；S1、S2、S3、S10、S11、S12、S13、S17、S19、S20、S21、S22 號樣品聚為一類；S4、S5、S6號樣品聚為一類；S18號樣品單獨聚為一類。分析結(jié)果表明，22批桑葉藥材出現(xiàn)產(chǎn)地交叉現(xiàn)象，說明桑葉藥材并不能以產(chǎn)地區(qū)分，藥材質(zhì)量還受采收時間、降水、溫度等其他影響，需要綜合整體化學(xué)成分的含量進行質(zhì)量評價。同時，聚類分析結(jié)果驗證了指紋圖譜相似度評價結(jié)果，也說明了22批桑葉藥材質(zhì)量差異較大，化學(xué)成分含量相差較大。

2.3.4 主成分分析及因子分析 為了進一步分析22批桑葉藥材之間的差異，更好的篩選品質(zhì)上佳的桑葉，采用SPSS 25．0軟件對22批不同產(chǎn)地的桑葉藥材共有峰峰面積進行標準化處理，通過降維因子分析，以主成分的方差貢獻率及特征值為依據(jù)，提取16個共有峰進行主成分分析，計算相關(guān)矩陣的特征值及其方差貢獻率。16個共有峰中特征值＞1的主成分，對總方差的累積貢獻率達91．083%，表明該主成分對桑葉有很好的代表性，能基本反映出樣品的主要信息。選取前3個主成分進行方差分析，主成分得分系數(shù)載荷矩陣見表3，以主成分的絕對值大小作為評價依據(jù)，主成分1的信息來自峰2、3、4、5、7、8、9、10、11，12，且峰 12 與主成分 1 成負相關(guān)，其中峰 4、5、7、8、9和 10對主成分 1具有較大的貢獻，經(jīng)對照品指認，峰4為沒食子酸甲酯，峰5為隱綠原酸，峰7為蘆丁，峰8為異槲皮苷，峰9為山奈酚-3-O-蕓香糖苷，峰10為紫云英苷，其余峰未知，主成分 2 的信息來自峰 6、13、15、16，主成分3的信息來自于峰1、14。為保證桑葉藥材的質(zhì)量穩(wěn)定，可對指標性成分進行含量測定，即對主成分1中的得分系數(shù)較大的成分予以重點關(guān)注。以16個共有峰的峰面積為變量，利用Origin 2019b作圖軟件繪制主成分分析得分圖。根據(jù)得分圖可知，22批桑葉藥材分散不集中，主成分得分存在較大的差異，大致可以分成4類，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，故在實際應(yīng)用中，應(yīng)該固定藥材來源，固定藥用品種，明確采摘時間，為桑葉質(zhì)量評價提供可行性。見圖2。

圖2 主成分得分圖Fig.2 Principal component score chart

表3 主成分成分矩陣Tab.3 Principal component matrix

2.4 多指標成分含量測定

2.4.1 線性關(guān)系考察 在“2．1”項下色譜條件下，精密吸取系列濃度的混合對照品溶液注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖。記錄各對照品相應(yīng)保留時間處的峰面積，以色譜峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算回歸方程，結(jié)果顯示其線性關(guān)系良好，其回歸方程，決定系數(shù)及線性范圍見表4。

表4 桑葉粉末中6種有效成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.4 Linear relationship of 6 active components in mulberry leaf powder

2.4.2 精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液2 μL，按“2．1”項下色譜條件連續(xù)進樣 6 次，記錄峰面積，計算沒食子酸甲酯、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷峰面積的RSD值分別為 0．14%、0．31%、0．13%、0．09%、0．21%、0．11%，RSD＜1．0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實驗 取同一批樣品6份，按“2．2．1”項下方法制備供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算沒食子酸甲酯、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷的含量及平均含量的RSD值，結(jié)果分別為2．05%、2．35%、2．25%、1．95%、2．85%、2．01%，RSD＜3．0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 按“2．2．1”項下方法制備供試品溶液，取同一批供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件進樣測定，分別于制備后 0，2，4，8，12，24 h 進樣2 μL，記錄峰面積，計算沒食子酸甲酯、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷峰面積的RSD值，經(jīng)計算6種成分的RSD分別為2．44%、2．72%、2．65%、2．69%、1．24%、2．63%，RSD＜3．0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率實驗 精密稱取6份已知含量的桑葉粉末約0．5 g，分別加入各對照品適量，按“2．2．2”項下方法制備供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算沒食子酸甲酯、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷的含量及平均加樣回收率，依次為99．42%、101．75%、99．08%、97．42%、102．69%、100．33%，RSD值分別為 1．00%、2．11%、2．58%、1．89%、1．99%、2．01%，RSD＜3．0%，表明該方法的準確度符合要求。

2.4.6 樣品測定結(jié)果 取22批桑葉藥材粉末共22 份，每份約 1 g，精密稱定，按照“2．2”項下方法制備供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件測定峰面積，計算22批桑葉藥材中沒食子酸甲酯、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷的含量見表5。由表5可知，22批桑葉藥材指標性成分含量存在較大差異，江蘇宿遷S6桑葉藥材6個指標性總含量達到14．589 mg/g以上，而江蘇鹽城S7桑葉藥材僅達0．372 mg/g。通過對22批桑葉6個指標性成分含量對比，沒食子酸甲酯、蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷的相對含量差異較大，分別為6．622～0．039、1．419～0．011、3．259～0．018 mg/g；隱綠原酸、異槲皮苷、紫云英苷相對含量差異較小，分別為1．679～0．088、1．034～0．023、0．846～0．019 mg/g，說明桑葉藥材之間質(zhì)量存在很大的差異，對桑葉的質(zhì)量控制是一項嚴峻的考驗。

表5 22批桑葉藥材含量測定結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of the samples content determination of 22 batches of mulberry leaves(n=3)

3 討論

本研究考察了不同提取溶劑、不同提取方式對桑葉中主要指標成分的影響，最終選擇80%乙醇，超聲提取45 min，提取2次，100%甲醇復(fù)溶作為供試品溶液的制備方法。同時，本研究進行200～400 nm下全波長掃描，發(fā)現(xiàn)酚酸類在290 nm處，黃酮類在360 nm處，各成分均有較強吸收，色譜峰分布均勻，故選擇分段波長進行分析。研究中還考察流動相（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0．2%的甲酸水溶液、乙腈-0．05%的磷酸水溶液、乙腈-0．2%的磷酸水溶液）、柱溫（30、35、40 ℃）、流動相流速（0．1、0．2、0．3mL/min）、進樣量（1、2、3 μL），最終確定色譜條件為乙腈-0．2%磷酸溶液梯度洗脫，柱溫35℃，流速0．2 mL/min，進樣量2 μL時所得色譜圖可以獲得較為平穩(wěn)的基線，且各待測成分的峰形較好，分離度較高。

桑葉是典型的多產(chǎn)地的中藥材，其生長過程中影響因素較多，比如氣溫、降水、紫外線、土壤、遺傳等[25-26]，并且采收時間[27]、干燥方式[28]等，均會影響桑葉藥材的質(zhì)量，導(dǎo)致市場上的桑葉藥材質(zhì)量參差不齊[29]。本研究建立的基于UPLC-DAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)與多指標含量測定的方法，對22批桑葉進行一致性評價和定量研究，同時測定桑葉藥材中沒食子酸甲酯、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和紫云英苷6種化學(xué)成分的含量。實驗結(jié)果表明，22批桑葉藥材相似度有一定的差距，共有峰峰面積RSD比值較大，說明本實驗所用22批桑葉藥材化學(xué)成分的含量存在較大的差異性。聚類分析驗證了相似度評價的準確度，僅說明了不同批次間桑葉藥材化學(xué)成分相似，將22批桑葉進行主成分分析，分析結(jié)果可知主成分1中經(jīng)對照品指認的6種成分可反映桑葉藥材的基本信息，因此可用于評價桑葉的質(zhì)量研究，通過對6種指標成分進行含量測定，結(jié)果顯示22批次桑葉藥材的化學(xué)成分的含量存在較大差異，可能與桑葉地理環(huán)境、氣候條件、品種、采收時間和烘干方式等均有關(guān)，對藥物次生代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致桑葉藥材相似度以及含量的差異性，即使同一產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境相似，但藥材質(zhì)量也會受種植方式人為等因素的影響。

為了保證藥食兩用桑葉原料的質(zhì)量和品質(zhì)，可考慮加強對桑葉采收加工規(guī)范化研究，提高和完善國家桑葉藥材標準，進一步提升桑葉的質(zhì)量，對不同品種、不同產(chǎn)地、不同采收期和不同生育期的桑葉進行進一步細致的研究，以期使桑葉得到更有效的利用。綜上所述，本研究采用UPLC-DAD技術(shù)建立指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對桑葉藥材成分進行差異性分析，并對6個指標性成分進行含量測定，直觀的評價桑葉藥材品質(zhì)的一致性，還同時體現(xiàn)化學(xué)成分的差異性，該方法操作便捷、結(jié)果準確、重復(fù)性好，為桑葉藥材的質(zhì)量控制和相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)參考。