基于數(shù)據(jù)挖掘分析ULBP2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及預(yù)后意義*

王 曉,王 莉,蔡克銀

解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院干部病房二科,武漢 430070

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界第3大癌癥[1-2],也是世界第4大致命癌癥[2-3],早期無(wú)明顯臨床癥狀,發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已是中晚期。結(jié)直腸癌的早期診斷有利于降低發(fā)病率和死亡率,改善患者預(yù)后。由于獲批的胃腸腫瘤靶向治療藥物種類較少,并且缺少有力研究證據(jù)來(lái)指導(dǎo)臨床決策和解決治療難題,因此有必要深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制,找到潛在的診斷、預(yù)后分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

UL16結(jié)合蛋白2(ULBP2)基因是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的相關(guān)分子,與自然殺傷細(xì)胞(natural killer,NK)上的NKG2D(natural killer group 2,member D)受體結(jié)合,觸發(fā)多種細(xì)胞因子和趨化因子的釋放,進(jìn)而促進(jìn)NK細(xì)胞激活。NKG2D是在免疫細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的一種活性受體蛋白,可以和NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTLs)等多種免疫細(xì)胞表面受體作用[4-7]。研究表明NKG2D可以通過(guò)識(shí)別應(yīng)激誘導(dǎo)的ULBP1(UL16結(jié)合蛋白1,UL16 binding protein 1)與ULBP6(UL16 binding protein 6)和MHC類多肽相關(guān)序列A/B(MICA/B,MHC classⅠpolypeptide-related sequence A/B)的結(jié)合,調(diào)控先天和適應(yīng)性免疫[8]。ULBP2可以作為黑色素瘤細(xì)胞的標(biāo)志物[9],其表達(dá)還與急性髓系白血病[10-11]、卵巢癌[12],膀胱癌[13],乳腺癌[14]等癌癥患者的生存結(jié)局有關(guān)。因此,我們推測(cè)ULBP2的表達(dá)也可能與結(jié)直腸癌相關(guān)。本研究通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ULBP2基因相關(guān)信息進(jìn)行深度挖掘,從基因水平、蛋白水平和轉(zhuǎn)錄組水平了解腫瘤調(diào)控機(jī)制,深入研究了ULBP2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和臨床意義,為尋找結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)和藥物開發(fā)提供思路。

1 資料與方法

1.1 通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)于ULBP2基因的mRNA信息

登錄Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)[15-16]官網(wǎng)(網(wǎng)址:https:∥www.oncomine.org/),根據(jù)研究需求在數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇篩選條件。本研究篩選條件如下:①Cancer Type:Colorectal Carcinoma;②Analysis Type:Cancervs.Normal Analysis;③Data Type:mRNA。

1.2 通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析ULBP2基因表達(dá)

GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫(kù)[17]整合了TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)信息,可以分析基因在多種癌癥中的表達(dá)情況和生存信息。本研究篩選條件為ULBP2和結(jié)直腸癌。

1.3 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取ULBP2基因相關(guān)表達(dá)量和生存數(shù)據(jù)

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)[18]檢索:①Primary Site:colon,②Program:TCGA,③Data Category:clinical,其他條件選擇默認(rèn),篩選出了437例樣本信息,其中結(jié)直腸癌患者398例,正常結(jié)直腸組織39例。下載表達(dá)量數(shù)據(jù),使用R軟件中EdgeR包進(jìn)行結(jié)直腸癌組與正常組基因表達(dá)量差異分析,將差異倍數(shù)≥4(logFC≥2)且矯正后P值＜0.01作為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)生存數(shù)據(jù),將生存數(shù)據(jù)和ULBP2基因表達(dá)數(shù)據(jù)整合后進(jìn)行生存分析。使用Survival包進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線,統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)為L(zhǎng)og-rank檢驗(yàn),過(guò)濾條件為P值＜0.01。通過(guò)分析,找出差異基因ULBP2與結(jié)直腸癌生存時(shí)間的關(guān)系。

1.4 通過(guò)String網(wǎng)站進(jìn)行ULBP2上下游關(guān)系預(yù)測(cè)

利用String網(wǎng)站[19]研究ULBP2相關(guān)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)[20]和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析[21-22]。GO數(shù)據(jù)庫(kù)共有三大類,分別是生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞定位(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF),分別描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能,所處的細(xì)胞環(huán)境,以及參與的生物學(xué)過(guò)程,以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)確定功能。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析ULBP2在結(jié)直腸癌中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

2.1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中ULBP2在結(jié)腸癌中的差異表達(dá) 在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)按照前文中檢索條件分析ULBP2在結(jié)直腸癌與正常結(jié)腸組織中差異表達(dá),得出7個(gè)數(shù)據(jù)集,10項(xiàng)研究,共583例(圖1),結(jié)果表明ULBP2基因在結(jié)直腸癌中普遍高表達(dá)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中ULBP2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)Fig.1 The expression of ULBP2 in colorectal cancer in the Oncomine database

2.1.2 ULBP2基因在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中,我們分析了ULBP2在腫瘤組與正常組織中基因表達(dá)情況,針對(duì)基因表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的進(jìn)行研究。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)共收集了352個(gè)不同類型的研究,其中有23個(gè)研究中的ULBP2在腫瘤和正常組織表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ULBP2高表達(dá)的腫瘤研究有18個(gè),低表達(dá)的有5個(gè)。

2.1.3 不同數(shù)據(jù)集中ULBP2基因在結(jié)直腸癌和正常組織中的表達(dá)差異 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中綜合比較數(shù)據(jù)集的研究結(jié)果,對(duì)其進(jìn)行二次分析,得出與對(duì)照組相比基因的表達(dá)情況。圖2為ULBP2在不同結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況,表1分別為圖2數(shù)據(jù)集對(duì)應(yīng)的P值和差異倍數(shù)等信息。研究顯示在TCGA Colorectal、Skrzypczak Colorectal、Skrzypczak Colorectal 2等這8個(gè)數(shù)據(jù)集中,ULBP2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量均顯著高于正常結(jié)腸組織(均P＜0.05)。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中ULBP2在不同結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)Fig.2 The expression of ULBP2 in colorectal cancer in the Oncomine database

表1 ULBP2基因在不同結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況Table 1 ULBP2 expression in colon cancer in the 8 datasets

2.2 GEPIA分析ULBP2差異表達(dá)

通過(guò)GEPIA在線工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ULBP2基因在結(jié)直腸癌組織樣本和正常結(jié)腸組織表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常結(jié)直腸組織相比,ULBP2基因在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)(圖3)。這與Oncomine芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索的結(jié)果一致。

圖3 GEPIA中ULBP2在結(jié)直腸癌樣本和正常結(jié)腸組織樣本差異表達(dá)Fig.3 Differential expression of ULBP2 in colorectal cancer samples and normal colon tissue samples shown in GEPIA

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)挖掘與生存曲線

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)挖掘,共447例樣本,其中結(jié)直腸癌樣本398例,正常結(jié)腸組織樣本39例。使用R軟件中EdgeR包進(jìn)行樣本表達(dá)量差異分析,結(jié)果表明ULBP2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)(logFC=4.32,P＜0.01)。使用Survival包繪制ULBP2基因表達(dá)量與生存時(shí)間的關(guān)系圖(圖4),結(jié)果表明,在結(jié)直腸癌患者中ULBP2基因高表達(dá),且高表達(dá)組對(duì)應(yīng)的生存期顯著低于低表達(dá)組(P＜0.01)。

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ULBP2在結(jié)直腸癌中表達(dá)與生存時(shí)間曲線Fig.4 ULBP2 expression and time-survival curve in colorectal cancer in TCGA database

2.4 ULBP2蛋白互作分析及基因功能富集

subfamily K,member 1)、造血細(xì)胞信號(hào)傳感器(hematopoietic cell signal transducer,HCLK)、CD226(CD226 molecule),趨化因子受體8(chemokine receptor 8,CCR8)、MHC類多肽相關(guān)序列A(MHC class I polypeptide-related sequence A,MICA)、MHC類多肽相關(guān)序列B(MHC class I polypeptide-related sequence B,MHCB)?；蚧プ鞴δ芨患治鋈绫?所示:其分子功能主要是與自然殺傷細(xì)胞凝集素受體結(jié)合;生物過(guò)程與自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)毒性、自然殺傷細(xì)胞活性和淋巴細(xì)胞活性有關(guān);細(xì)胞組分與質(zhì)膜的本征組分有關(guān);涉及自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。

表2 ULBP2互作蛋白功能富集和KEGG通路分析Table 2 Analysis of function enrichment and KEGG pathway of ULBP2 interaction proteins

使用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ULBP2進(jìn)行單個(gè)基因互作及功能分析,ULBP2基因在自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性過(guò)程中處于重要位置。圖5為ULBP2的蛋白互作網(wǎng)絡(luò),包括11個(gè)結(jié)點(diǎn)和47條邊(P＜0.01)。與ULBP2相互作用的基因包括UL16結(jié)合蛋白1(UL16 binding protein 1,ULBP1)、UL16結(jié)合蛋白3(UL16 binding protein 3,ULBP3)、自然細(xì)胞毒性觸發(fā)受體1(natural cytotoxicity triggering receptor 1,NCTR1)、自然細(xì)胞毒性觸發(fā)受體2(natural cytotoxicity triggering receptor 2,NCTR2)、K細(xì)胞凝集素受體亞科K1(killer cell lectin-like receptor

圖5 ULBP2相互作用蛋白互作圖Fig.5 Diagram of ULBP2 interaction proteins

3 討論

腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志物可以作為早期檢測(cè)、臨床診斷和預(yù)后治療的關(guān)鍵指標(biāo),是結(jié)直腸癌研究的重點(diǎn)[22]。ULBP2[8]是主要組織相容性復(fù)合體MHC(major histocompatibility complex)第一類超家族中的成員,表達(dá)蛋白為UL16結(jié)合蛋白2,不包含α3結(jié)構(gòu)域,缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域。有研究表明,ULBP2有助于小細(xì)胞型肺癌及慢性淋巴瘤的診斷[23],也可作為胰腺癌和急性髓系白血病[10]的腫瘤標(biāo)志物,并且其基因表達(dá)和卵巢癌[12]、膀胱癌[13]、乳腺癌[14]等癌癥患者的生存有關(guān)。

免疫細(xì)胞及其相關(guān)因子等組成的局部微環(huán)境可幫助機(jī)體清除感染或癌變的細(xì)胞,在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中起到重要作用[24]。MHC家族相關(guān)配體的免疫受體NKG2D常被腫瘤細(xì)胞表達(dá),并通過(guò)NK細(xì)胞刺激腫瘤免疫[25]。NK細(xì)胞可以調(diào)節(jié)抗癌或抗感染免疫效應(yīng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,在抗腫瘤和抗感染宿主防御中發(fā)揮著重要作用[26-27],可直接參與細(xì)胞毒性[28]作用,增強(qiáng)靶細(xì)胞免疫原性[29]和適應(yīng)性免疫[30]。ULBP2是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的NK細(xì)胞受體NKG2D的配體[9],可以起到抑制腫瘤的作用。NK細(xì)胞通過(guò)激活NKG2D受體與ULBP2配體的相互作用,在急性髓系白血病免疫識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮重大作用[10],我們通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選發(fā)現(xiàn),相關(guān)互作的蛋白主要調(diào)控免疫,主要包括:ULBP1、ULBP3、NCTR1、NCTR2、HCLK、CCR8、MICA、MHCB等。本項(xiàng)目篩選結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)ULBP2基因可能是通過(guò)調(diào)控免疫,影響腫瘤細(xì)胞的生存。

本文從大數(shù)據(jù)方向研究ULBP2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系,涉及了Oncomine、TCGA、GEPIA公共數(shù)據(jù)庫(kù)。使用Oncomine研究ULBP2在不同腫瘤及結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況;通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)再次驗(yàn)證ULBP2在結(jié)直腸癌與正常結(jié)腸組織中的差異表達(dá);對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)進(jìn)行校正,繪制生存曲線。研究結(jié)果表明,ULBP2在結(jié)直腸癌中高表達(dá);ULBP2的表達(dá)量和結(jié)直腸癌的預(yù)后存在明顯的相關(guān)性,表達(dá)量越低,預(yù)后越好。但是,目前所得結(jié)果只是通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)整合分析,我們將在后續(xù)研究中進(jìn)行驗(yàn)證,如在結(jié)直腸癌細(xì)胞或動(dòng)物模型中上調(diào)或者抑制ULBP2基因表達(dá),從體內(nèi)外及臨床水平進(jìn)一步探討該基因?qū)Y(jié)直腸癌發(fā)展的影響,為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)和預(yù)后分子標(biāo)記物的研究提供思路。