冠心病患者CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性分析及預(yù)測(cè)價(jià)值*

郭 娜,趙 凱,金 珊,王成燕,沈西華,蔡文平,段軍倉(cāng),劉克堅(jiān),龐麗娟△

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科/國(guó)家衛(wèi)生健康委中亞高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子 大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832002

2浙江省金華市中心醫(yī)院心內(nèi)科,金華 321000

3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,石河子 832002

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病又名冠心病(coronary heart disease,CHD),是全球人類死亡的最主要原因[1]。介入手術(shù)治療是緩解相關(guān)臨床癥狀最有效的血運(yùn)重建手段,但仍有10%～20%的患者出現(xiàn)術(shù)后再狹窄[2]。目前,冠狀動(dòng)脈造影是冠心病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但其操作復(fù)雜且價(jià)格昂貴,不適用于開(kāi)展早期大規(guī)模篩查診斷工作。

冠心病發(fā)生的基本病理基礎(chǔ)為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成及斑塊的沉積,炎癥反應(yīng)已被證實(shí)參與此過(guò)程[3]。CD8+T細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵參與者,對(duì)冠心病發(fā)生發(fā)展起調(diào)控作用[4]。PD-1/PD-L1負(fù)性共刺激通路與TGF-β1信號(hào)通路在機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)中具有協(xié)同作用,均可抑制T細(xì)胞活性,從而減弱T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制并參與免疫介導(dǎo)的組織損傷過(guò)程[5]。文獻(xiàn)報(bào)道PD-1/PDL1通路表達(dá)水平的變化可通過(guò)改變動(dòng)脈粥樣硬化炎癥程度和粥樣斑塊的狀態(tài)參與冠心病的發(fā)病過(guò)程[6]。TGF-β1信號(hào)通路也參與了冠心病啟動(dòng)及進(jìn)展的各個(gè)階段,在機(jī)體炎癥反應(yīng)、高密度脂蛋白含量、斑塊穩(wěn)定程度、血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移及血小板活性調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[7]。有文獻(xiàn)證實(shí),在創(chuàng)面炎癥調(diào)控紊亂所致的難愈創(chuàng)面或病理性瘢痕中TGF-β1可上調(diào)PD-L1表達(dá),從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[8];同時(shí)在TGF-β1存在時(shí),PD-L1可誘導(dǎo)大量的幼稚T細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化[9]。MMP-14不僅可調(diào)節(jié)TGF-β1的生物活性,而且可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分,水解潛伏的TGF-β1結(jié)合蛋白,從而在細(xì)胞外基質(zhì)中釋放潛在TGF-β1,進(jìn)而調(diào)節(jié)粥樣斑塊的發(fā)生和血管損傷修復(fù)過(guò)程[10]。

本研究借助生物信息學(xué)方法對(duì)CD8、PD-1、PDL1、TGF-β1、MMP-14進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析,利用STRING在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)分析CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14之間的相互作用。同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)驗(yàn)證冠心病不同Gensini評(píng)分患者血漿CD8、PD-1、PDL1、TGF-β1、MMP-14含量差異,并探究其與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性,探討血漿CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14分子含量變化對(duì)冠心病發(fā)病的預(yù)測(cè)價(jià)值。研究流程見(jiàn)圖1。

圖1 研究設(shè)計(jì)流程圖Fig.1 Flowchart of study design

1 資料與方法

1.1 GO和KEGG通路富集分析

使用R語(yǔ)言中的“Cluster Profiler”對(duì)CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14進(jìn) 行GO和KEGG富集通路分析。

1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14之間的相互作用。

1.3 臨床資料收集

收集2019年6月至2020年6月就診于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的冠心病患者39例,其中男性25例,女性14例,平均年齡(60.00±10.91)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①行冠狀動(dòng)脈造影檢查明確診斷為冠心病;②行血液生化指標(biāo)及全血細(xì)胞計(jì)數(shù)檢查;③基本臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①先天性心臟病、心臟瓣膜病等其他器質(zhì)性心臟病;②合并心肝腎等重要器官功能不全;③合并惡性腫瘤;④合并糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等消耗性疾病;⑤合并乙肝、艾滋病等傳染性疾病;⑥合并嚴(yán)重感染。

1.4 分組方法

根據(jù)Gensini評(píng)分系統(tǒng)(表1)對(duì)納入患者的冠狀動(dòng)脈狹窄程度進(jìn)行評(píng)分,每處冠狀動(dòng)脈病變的積分為該處狹窄程度評(píng)分乘以病變部位評(píng)分,每位患者的總積分為所有病變積分的總和。根據(jù)病變總積分將所入選39例患者冠狀動(dòng)脈狹窄程度分為輕、中、重3組,積分0～6為輕組,積分6～10為中組,積分11～172為重組。

表1 Gensini評(píng)分系統(tǒng)Table 1 Gensini scoring system

1.5 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

收集納入研究的冠心病患者股動(dòng)脈血,采用高速冷凍離心機(jī)(賽默飛,美國(guó))3000×g離心15 min獲取血漿。ELISA(Elabscience,武漢,中國(guó))測(cè)定血漿中CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,3組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析,組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn),假定方差齊使用LSD法,未假定方差齊性使用Tamhane法。采用相關(guān)性分析探究CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量分別與冠心病Gensini評(píng)分間的關(guān)系,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GO和KEGG富集通路分析

GO和KEGG通路富集分析顯示所選基因CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14與冠心病發(fā)生發(fā)展及相關(guān)炎癥過(guò)程相關(guān)。GO主要富集于淋巴細(xì)胞活化正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞激活正向調(diào)控、細(xì)胞激活正向調(diào)控、質(zhì)膜外側(cè)面、高爾基腔、MHCⅠ類蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體結(jié)合,見(jiàn)圖2和表2。KEGG主要富集于細(xì)胞粘附分子、PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路在癌癥中的作用、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、原發(fā)性免疫缺陷,見(jiàn)表3和圖3。

圖3 KEGG通路富集分析圖Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis

表2 GO富集分析Table 2 GO enrichment analysis

表3 KEGG通路富集分析Table 3 KEGG pathway enrichment analysis

圖2 GO富集分析圖Fig.2 GO enrichment analysis diagram

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14間PPI網(wǎng)絡(luò)顯示各分子間存在一定相互作用關(guān)系,見(jiàn)圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram

2.3 納入病例的分組及一般臨床資料比較

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn),本研究共收集39例冠心病病例,依照Gensini評(píng)分系統(tǒng)分為輕、中、重3組,分組情況見(jiàn)表4。輕組和重組的Gensini評(píng)分與性別、吸煙情況等方面無(wú)明顯相關(guān)(均P＞0.05),中組Gensini評(píng)分與患者性別、吸煙情況方面存在相關(guān)性(P＜0.05),見(jiàn)表5、6。輕、中、重3組在收縮壓、舒張壓、血糖、總膽固醇(TC),三酰甘油(TG),高密度脂蛋白(H-DLC),低密度脂蛋白(L-DLC)方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05),而在年齡、血小板計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比等方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),見(jiàn)表7。

表4 三組病例Gensini評(píng)分結(jié)果Table 4 Gensini scores in the three groups of patients

表5 三組病例Gensini評(píng)分與性別情況Table 5 Gensini scores and gender in the three groups of patients

表6 三組病例Gensini評(píng)分與吸煙情況Table 6 Gensini scores and smoking history in the three groups of patients

表7 三組病例其他一般臨床資料比較(±s)Table 7 Comparison of other general clinical data of the three groups(±s)

表7 三組病例其他一般臨床資料比較(±s)Table 7 Comparison of other general clinical data of the three groups(±s)

TC:總膽固醇,TG:三酰甘油,H-DLC:高密度脂蛋白,L-DLC:低密度脂蛋白;與輕組比較,*P＜0.05

組別 n 年齡(歲) 收縮壓(mm Hg)舒張壓(mm Hg)血糖(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)H-DLC(mmol/L)L-DLC(mmol/L)血小板(109/L)中性粒細(xì)胞百分比(%)輕組 16 54.19±8.93 134.88±19.35 82.75±14.67 5.25±1.85 4.42±1.10 2.21±1.91 1.31±0.24 2.18±0.78 255.56±56.40 57.64±7.09中組 8 63.13±9.16*133.25±19.42 77.88±14.21 5.26±1.53 3.60±0.86 1.22±0.37 1.13±0.27 1.84±0.67 204.75±59.61*59.45±9.72重組 15 64.60±11.36*133.87±21.94 84.93±15.81 6.73±3.02 3.91±1.12 1.46±0.86 1.37±0.68 1.81±0.62 201.73±55.50*65.26±11.58*

2.4 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量比較

輕、中、重3組CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1含量的差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),其中CD8、PD-1、TGF-β1均表現(xiàn)為僅在重組與輕組之間存在顯著差異(均P＜0.05),PD-L1含量在中組與輕組、重組與中組之間均存在顯著差異(均P＜0.05),而MMP-14血漿含量在三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表8和圖5。

圖5 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量Fig.5 The levels of CD8,PD-1,PD-L1,TGF-β1,MMP-14 in plasma

表8 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量比較(±s,pg/m L)Table 8 Comparison of CD8,PD-1,PD-L1,TGF-β1,and MMP-14 in plasma(±s,pg/m L)

表8 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量比較(±s,pg/m L)Table 8 Comparison of CD8,PD-1,PD-L1,TGF-β1,and MMP-14 in plasma(±s,pg/m L)

與輕組比較,*P＜0.05;與中組比較;#P＜0.05

分組 樣本數(shù) CD8 PD-1 PD-L1 TGF-β1 MMP-14輕組 16 0.12±0.05 0.09±0.02 0.75±0.12 1.17±0.41 1.69±0.34中組 8 0.12±0.03 0.12±0.06 0.83±0.36* 1.07±0.33 1.69±0.54重組 15 0.09±0.03* 0.15±0.10* 1.19±0.44*# 0.89±0.23* 1.91±0.25

2.5 CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量與Gensini評(píng)分的相關(guān)性分析

PD-L1含量與Gensini評(píng)分呈線性關(guān)系,為顯著正相關(guān)(P＜0.05)。CD8、PD-1、TGF-β1、MMP-14與Gensini評(píng)分的線性關(guān)系均不顯著(P＞0.05)。但從趨勢(shì)上來(lái)看,CD8、TGF-β1與Gensini評(píng)分存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì),PD-1、MMP-14與Gensini評(píng)分存在正相關(guān)趨勢(shì),見(jiàn)表9。

表9 Gensini評(píng)分與CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量的相關(guān)性分析Table 9 Correlation analysis between Gensini scores and CD8,PD-1,PD-L1,TGF-β1,MMP-14 in plasma

3 討論

冠心病是全球最新十大死亡疾病排名中死亡率最高者,可因冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊阻塞而致心臟發(fā)生缺血缺氧乃至功能障礙[11]。近年來(lái),由于城鎮(zhèn)化進(jìn)程的推進(jìn)及人民生活水平的不斷提高,我國(guó)冠心病發(fā)生呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)且病死率逐年上升。因此,對(duì)冠心病的發(fā)生進(jìn)行早期篩查及預(yù)測(cè)顯得極為重要。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的病理基礎(chǔ),免疫炎癥及炎癥因子在這一過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[6]。文獻(xiàn)報(bào)道,被激活的T細(xì)胞存在于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)時(shí)期,而且在冠脈早期脂質(zhì)條紋中CD8+T細(xì)胞占大多數(shù)[12]。在大鼠粥樣硬化模型心肌壞死組織中聚集有CD8+T細(xì)胞,其可識(shí)別、殺死正常心肌細(xì)胞,并分泌干擾素-γ(IFN-γ)和趨化因子,加重急性炎癥,擴(kuò)大梗死面積[13]。孔祥權(quán)等[14]指出在冠心病患者斑塊進(jìn)展和破裂處可檢測(cè)到激活的CD8+T細(xì)胞比例明顯升高,提示我們CD8+T細(xì)胞水平變化可能與不穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊形成有關(guān)。在冠心病患者外周血中,CD8+T細(xì)胞比例降低,并且病情越重?cái)?shù)值變化則越大,由此得出外周血CD8+T細(xì)胞比例變化可作為病情評(píng)估的指標(biāo)[15]。而CD8+T細(xì)胞及所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)會(huì)受到PD-1/PD-L1途徑及炎癥因子TGF-β1所傳遞的負(fù)性信號(hào)的共同調(diào)控。

有研究發(fā)現(xiàn)在PD-1/PD-L1基因敲除小鼠中,動(dòng)脈血管粥樣硬化病變區(qū)域顯著增大,證實(shí)PD-1/PD-L1途徑可通過(guò)限制T細(xì)胞活化從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[16]。PD-1/PD-L1信號(hào)的下調(diào)可減少負(fù)向刺激信號(hào)的傳遞,促進(jìn)冠心病粥樣斑塊形成。同時(shí)PD-1與PD-L1的結(jié)合也可抑制T細(xì)胞相關(guān)炎癥因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IFN-γ等的分泌,而這些炎癥因子可促進(jìn)粥樣斑塊的形成,最終抑制冠心病的發(fā)生發(fā)展[17]。TGF-β1不僅可以通過(guò)上調(diào)抗原提呈細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)而間接參與冠心病炎癥反應(yīng)途徑,而且可通過(guò)抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1、IFN-2等炎癥因子的表達(dá),使 參與斑塊形成的中性粒細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而穩(wěn)定斑塊[18]。也有學(xué)者提出TGF-β1可促使血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖,從而增強(qiáng)內(nèi)膜增生程度來(lái)加快冠心病的發(fā)展[19]。雖然TGF-β1對(duì)冠心病粥樣斑塊形成發(fā)揮促進(jìn)還是抑制作用仍備受爭(zhēng)議,但是已有學(xué)者證明粥樣斑塊中TGF-β1的含量比正常組織高出3倍,并提出TGF-β1與冠心病嚴(yán)重程度具有相關(guān)性[18]。而TGF-β1的表達(dá)水平與MMP-14密切相關(guān),MMP-14可促進(jìn)潛在TGF-β1釋放,而釋放出來(lái)的TGF-β1又可誘導(dǎo)MMP-14的表達(dá),另外MMP-14也能夠通過(guò)TGF-β1信號(hào)通路促進(jìn)冠脈血管的纖維化及膠原重構(gòu)過(guò)程。因此MMP-14可通過(guò)TGFβ1與PD-1/PD-L1途徑間接參與冠心病粥樣硬化及相關(guān)炎癥反應(yīng)的發(fā)展過(guò)程。

本研究以冠心病粥樣硬化形成過(guò)程中的免疫炎癥反應(yīng)為切入點(diǎn),在文獻(xiàn)查閱基礎(chǔ)上,通過(guò)GO和KEGG通路富集分析及PPI蛋白質(zhì)互作網(wǎng)圖,確定了CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14分子間可發(fā)生相互作用,并參與冠心病及相關(guān)炎癥反應(yīng)途徑。同時(shí)收集39例冠心病臨床樣本及其病例資料,檢測(cè)血漿CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14含量,驗(yàn)證各分子含量與冠心病不同Gensini評(píng)分患者的相關(guān)性。結(jié)果顯示CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14血漿含量的確與冠心病發(fā)病相關(guān),PD-L1含量與Gensini評(píng)分呈顯著正相關(guān),CD8、PD-1、TGF-β1、MMP-14與Gensini評(píng)分的線性相關(guān)關(guān)系均不顯著,但從趨勢(shì)上來(lái)看,CD8、TGF-β1與Gensini評(píng)分存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì),PD-1、MMP-14與Gensini評(píng)分存在正相關(guān)趨勢(shì)。

綜上所述,CD8、PD-1、PD-L1、TGF-β1、MMP-14可參與冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,并且各分子血漿含量與冠狀動(dòng)脈狹窄程度存在相關(guān)趨勢(shì),是潛在的冠狀動(dòng)脈狹窄程度的預(yù)測(cè)指標(biāo),這為冠心病的早期篩查與預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。