腺相關(guān)病毒Anc80L65轉(zhuǎn)染成年小鼠橢圓囊的實(shí)驗(yàn)研究

王國(guó)鵬 賀璐 郭婧瀅 陳鐘壡 龔樹生

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（100050 北京）

眩暈是臨床上常見疾病。研究表明，前庭感覺上皮損傷是引起外周性眩暈的重要原因之一[1]。哺乳動(dòng)物前庭感覺上皮受到不同程度的損傷可呈現(xiàn)不同的病理變化。輕中度損傷的情況下僅毛細(xì)胞受到損傷，支持細(xì)胞仍然存活，形成“疤痕結(jié)構(gòu)”。重度損傷后，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞均受損，原有感覺上皮替代為扁平上皮[2,3]。哺乳動(dòng)物的前庭毛細(xì)胞受損后無(wú)法完全再生[4]，通過(guò)基因治療誘導(dǎo)前庭毛細(xì)胞再生為修復(fù)前庭感覺上皮損傷帶來(lái)希望[4-6]。

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）由于其抗原性低、轉(zhuǎn)染效率高、能夠長(zhǎng)時(shí)穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)在內(nèi)耳基因治療方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[7]。近年來(lái)，隨著病毒編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，一系列新型AAV病毒被開發(fā)用于提高病毒的轉(zhuǎn)染效率或內(nèi)耳細(xì)胞的選擇性，并進(jìn)一步降低免疫原性[8]。Anc80L65是一種新型的人工合成AAV，能夠高效轉(zhuǎn)染正常的小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞[9,10]，表明Anc80L65是前庭基因治療的理想載體。但是，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)Anc80L65轉(zhuǎn)染損傷后前庭感覺上皮的報(bào)道。利用理想的病毒載體，介導(dǎo)目的基因在損傷后前庭感覺上皮中殘存的支持細(xì)胞和/或其他細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，從而促使其轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞，是誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生的重要途徑。因此，在誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生之前，很有必要研究該病毒載體在損傷后前庭感覺上皮中的轉(zhuǎn)染特性。Anc80L65是否能成功介導(dǎo)目的基因高效表達(dá)于損傷后的前庭感覺上皮，目前尚不明確。

通過(guò)局部給藥的方式能夠使病毒高效的作用于內(nèi)耳組織同時(shí)避免對(duì)外周器官的感染，半規(guī)管注射已被證實(shí)是一種安全有效的內(nèi)耳給藥方式[11,12]，能夠介導(dǎo)多種血清型的AAV在前庭感覺上皮的高效轉(zhuǎn)染[13,14]。在本研究中，我們將通過(guò)半規(guī)管注射介導(dǎo)Anc80L65轉(zhuǎn)染正常以及不同損傷程度的小鼠橢圓囊感覺上皮，為前庭毛細(xì)胞再生基因治療的載體選擇提供線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本研究采用4-5周齡FVB/N小鼠，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，所有實(shí)驗(yàn)步驟均通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組，每組動(dòng)物3-5只，6周齡時(shí)行手術(shù)，均以左耳為手術(shù)耳，實(shí)驗(yàn)流程見圖1。分組為：1）正常對(duì)照組：僅行后半規(guī)管注射導(dǎo)入1μL Anc80L65病毒液；2）中度損傷組：水平半規(guī)管注射手術(shù)導(dǎo)入150μg鏈霉素（150mg/mL，1μL），術(shù)后2周行后半規(guī)管注射手術(shù)導(dǎo)入1μL Anc80L65病毒液；3）重度損傷組：水平半規(guī)管注射手術(shù)導(dǎo)入400μg鏈霉素（400mg/mL，1μL），術(shù)后2周行后半規(guī)管注射手術(shù)導(dǎo)入1μL Anc80L65病毒液。病毒導(dǎo)入后4周取橢圓囊行免疫熒光染色觀察病毒轉(zhuǎn)染情況。

1.2 主要材料

硫酸鏈霉素購(gòu)買自美國(guó)Sigma-Aldrich公司（S9137），溶于生理鹽水中，配置成150mg/mL或400mg/mL的鏈霉素注射液。攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基 因 的 AAV/Anc80L65病毒懸液（Anc80L65-GFP）購(gòu)買自山東維真生物科技有限公司（AV200001-AV Anc80），滴度為3.24×1012v.g./mL，啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子；麻醉藥Xylazine和Ketamine分別來(lái)自美國(guó)Sigma公司（X-1251）和福建古田藥業(yè)有限公司（H35020148）；兔Anti-Myosin VIIa抗體來(lái)自美國(guó)Proteus Biosciences（25-6790），小鼠Anti-GFP抗體來(lái)自美國(guó) Santa Cruz Biotechnology（sc-9996），Alexa Fluor 647 Phalloidin（A22287）和熒光標(biāo)記的二抗均來(lái)自美國(guó)Invitrogen。

1.3 半規(guī)管注射術(shù)[11]

小鼠麻醉后，行左耳后弧形切口，充分暴露半規(guī)管。用1mL注射器在半規(guī)管上鉆一小孔，將微導(dǎo)管插入小孔中，采用微量注射泵控制注射速度為0.5μL/min，導(dǎo)入鏈霉素溶液或病毒液。用一小塊肌肉封閉鉆孔處，復(fù)位肌肉和皮下軟組織，縫合切口。經(jīng)水平半規(guī)管注射術(shù)導(dǎo)入鏈霉素，經(jīng)后半規(guī)管注射術(shù)導(dǎo)入Anc80L65病毒液（實(shí)驗(yàn)流程見圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Experimental flowchart

1.4 內(nèi)耳標(biāo)本鋪片制作

小鼠麻醉后斷頭取出聽泡，用1mL注射器針尖分別在蝸尖、前庭窗、圓窗處鉆孔，4%多聚甲醛固定液從蝸尖小孔灌入耳蝸，然后將顳骨浸入固定液中固定2小時(shí)。顯微鏡下取出橢圓囊組織。

1.5 免疫熒光染色

將標(biāo)本置于一抗工作液中，4℃下孵育過(guò)夜，PBS清洗后加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫條件下避光孵育2h，PBS清洗后顯微鏡下修剪和鋪片，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

三組橢圓囊取材后免疫熒光染色，GFP標(biāo)記被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，Myosin VIIa標(biāo)記毛細(xì)胞，Phalloidin標(biāo)記細(xì)胞骨架和纖毛，激光共聚焦顯微鏡下觀察。在正常橢圓囊中（圖2），Anc80L65-GFP轉(zhuǎn)染后，低倍鏡下見GFP廣泛分布于橢圓囊前庭感覺上皮，橢圓囊形態(tài)大致正常，毛細(xì)胞纖毛排列有序；高倍鏡下見前庭毛細(xì)胞（Myosin VIIa陽(yáng)性細(xì)胞）和支持細(xì)胞（Myosin VIIa陰性細(xì)胞）均被高效轉(zhuǎn)染。

圖2 Anc80L65-GFP在正常橢圓囊的轉(zhuǎn)染情況。（A-A’’’）注射Anc80L65-GFP后1月，低倍鏡下見GFP廣泛分布于前庭感覺上皮；（B-B’’’）在前庭毛細(xì)胞胞體層面，高倍鏡下見大量前庭毛細(xì)胞（Myosin VIIa陽(yáng)性細(xì)胞）表達(dá)GFP（箭頭所示）。（A）中標(biāo)尺代表（A-A’’’）：50μm；（B）中標(biāo)尺代表（B-B’’’）：20μm。Fig.2 Transfection of Anc80L65-GFP in normal utricles.(AA''')One month after injection of Anc80L65-GFP,GFP was widely distributed in the vestibular sensory epithelium under low power microscope;(B-B''')At the level of the vestibular hair cell body under high power microscope,a large number of vestibular hair cells(Myosin VIIa positive cells)expressed GFP(indicated by arrows).Scale bars,50μm(A for A-A''')and 20μm(B for B-B’’’).

前庭感覺上皮中度損傷后（圖3），前庭毛細(xì)胞大量缺失，周圍的支持細(xì)胞肥大以填充原有毛細(xì)胞的位置，但前庭感覺上皮仍基本保存原有的細(xì)胞框架；GFP廣泛分布表達(dá)于殘存的前庭毛細(xì)胞和支持細(xì)胞。

圖3 Anc80L65-GFP在中度損傷橢圓囊的轉(zhuǎn)染情況。（AA’’’）注射Anc80L65-GFP后1月，低倍鏡下見中度損傷橢圓囊中GFP陽(yáng)性細(xì)胞分布范圍與正常橢圓囊相似；（BB’’’）高倍鏡下見毛細(xì)胞（Myosin VIIa陽(yáng)性細(xì)胞）和支持細(xì)胞（Myosin VIIa陰性細(xì)胞）均被高效轉(zhuǎn)染。（A）中標(biāo)尺代表（A-A’’’）：50μm；（B）中標(biāo)尺代表（B-B’’’）：20μm。Fig.3 Transfection of Anc80L65-GFP in the moderately dam‐aged utricle.(A-A''')One month after injection of Anc80L65-GFP,the distribution of GFP-positive cells in the moderately damaged utricle was similar to that of normal utricle under low power microscope;(B-B''')Both hair cells(Myosin VIIa positive cells)and supporting cells(Myosin VIIa negative cells)were efficiently transfected under high power micro‐scope.Scale bars,50μm(A for A-A''')and 20μm(B for BB’’’).

前庭感覺上皮重度損傷后（圖4），前庭毛細(xì)胞幾乎完全缺失，支持細(xì)胞也受損，前庭感覺上皮失去原有的細(xì)胞框架，被大小不一、形態(tài)不規(guī)則的扁平上皮細(xì)胞取代；Anc80L65-GFP轉(zhuǎn)染效率明顯降低，僅有少數(shù)扁平上皮細(xì)胞表達(dá)GFP。

圖4 Anc80L65-GFP在重度損傷橢圓囊的轉(zhuǎn)染情況。（AA’’’）注射Anc80L65-GFP后一月，低倍鏡下見扁平上皮中GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與正常、中度損傷橢圓囊相比明顯減少；（B-B’’’）高倍鏡下見少量扁平上皮細(xì)胞表達(dá)GFP。（A）中標(biāo)尺代表（A-A’’’）：50μm；（B）中標(biāo)尺代表（B-B’’’）：20μm。Fig.4 Transfection of Anc80L65-GFP in the severely dam‐aged utricle.(A-A''')One month after injection of Anc80L65-GFP,the number of GFP-positive cells in the flat epithelium was significantly reduced compared with those in normal and moderately damaged utricles under low power microscope;(B-B''')A small number of flat epithelial cells expressed GFP under high power microscope.Scale bars,50μm(A for A-A''')and 20μm(B for B-B’’’).

3 討論

近年來(lái)隨著病毒編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，AAV病毒衣殼蛋白基因可以被編輯用于提高病毒的轉(zhuǎn)染效率或內(nèi)耳細(xì)胞的選擇性，以及降低在體條件下注射的免疫原性[8]，目前已有多種新型AAV載體用于內(nèi)耳轉(zhuǎn)染并取得了良好的效果[9,15-17]。Anc80L65是一種人工合成的新型AAV，其病毒衣殼蛋白接近AAV的祖先狀態(tài)。由于其抗原性與傳統(tǒng)的AAV不同，可以有效避免傳統(tǒng)AAV可能引起的潛在免疫反應(yīng)[18]。Anc80L65在成年小鼠內(nèi)耳中可以高效轉(zhuǎn)染耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞、前庭毛細(xì)胞和支持細(xì)胞[10]，通過(guò)攜帶目的基因可以糾正Usher綜合癥I型的小鼠的聽力和前庭功能[19]。

在正常的橢圓囊感覺上皮中，本研究顯示Anc80L65可以廣泛轉(zhuǎn)染正常前庭毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，但轉(zhuǎn)染效率低于既往文獻(xiàn)[9]。造成差異的可能原因包括取材的時(shí)間點(diǎn)不同、病毒滴度不同以及病毒生產(chǎn)工藝的差異。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)Anc80L65轉(zhuǎn)染損傷后前庭感覺上皮的報(bào)道，我們的研究發(fā)現(xiàn)在中度損傷的情況下，Anc80L65能夠廣泛轉(zhuǎn)染橢圓囊中毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，與正常橢圓囊的情況相似，但在重度損傷的情況下轉(zhuǎn)染效率明顯降低。這與8型AAV（AAV8）載體在橢圓囊前庭感覺上皮中的轉(zhuǎn)染特點(diǎn)類似：AAV8能夠高效轉(zhuǎn)染正?；蛑卸葥p傷后的前庭感覺上皮，但對(duì)于重度損傷后形成的扁平上皮，AAV8轉(zhuǎn)染效率較低[11,13,20]。這可能是由于在扁平上皮的形成過(guò)程中，細(xì)胞屬性已經(jīng)發(fā)生了顯著變化，不同于原有的支持細(xì)胞[2,20,21]。細(xì)胞屬性的改變其一可能影響細(xì)胞表面受體的表達(dá)，進(jìn)而影響病毒進(jìn)入細(xì)胞的效率[8]。其二可能影響啟動(dòng)子發(fā)揮作用。目前用于內(nèi)耳基因治療的AAV病毒載體通常采用CMV或CBA(chicken beta actin)啟動(dòng)子。這兩種啟動(dòng)子可以在多數(shù)類型的細(xì)胞中介導(dǎo)病毒基因組的表達(dá)，但在特殊類型的細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞中往往無(wú)法介導(dǎo)外源基因高效表達(dá)[22]。本研究中Anc80L65病毒采用CMV啟動(dòng)子，扁平上皮細(xì)胞性質(zhì)的變化可能導(dǎo)致其缺乏維持CMV啟動(dòng)子發(fā)揮作用的輔因子，進(jìn)而影響GFP的表達(dá)水平。目前已有一些研究采用特異性的啟動(dòng)子來(lái)轉(zhuǎn)染內(nèi)耳組織中特定類型的細(xì)胞，如采用以SYN1為啟動(dòng)子的AAV9PHP.B病毒轉(zhuǎn)染螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[23]。在未來(lái)的研究中可以探索在扁平上皮中采用特殊類型啟動(dòng)子的病毒以提高扁平上皮的轉(zhuǎn)染效率和特異性。

除了Anc80L65，一些新的病毒載體也可嘗試用于前庭感覺上皮損傷后的基因治療研究。通過(guò)插入肽段合成的新型內(nèi)耳AAV（AAV-inner ear,AAV-ie）能夠幫助病毒通過(guò)膜樣結(jié)構(gòu)從而提高轉(zhuǎn)染效率，研究發(fā)現(xiàn)AAV-ie在耳蝸中的轉(zhuǎn)染效率高于現(xiàn)有各種血清型的AAV，并且能夠在人類前庭終器中實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染[15]。毛細(xì)胞的再生需要多基因協(xié)同作用，尤其對(duì)于扁平上皮[24,25]。在未來(lái)扁平上皮的基因治療研究中，須探索新型AAV載體對(duì)其的轉(zhuǎn)染特性，或嘗試高裝載量且低免疫原性和毒性的載體，如輔助病毒依賴性腺病毒載體，來(lái)實(shí)現(xiàn)多基因協(xié)同調(diào)控[26]。

4 結(jié)論

Anc80L65能高效轉(zhuǎn)染正常和中度損傷情況下小鼠橢圓囊感覺上皮，但對(duì)重度損傷后形成的前庭扁平上皮轉(zhuǎn)染效率較低，這可能與前庭扁平上皮中細(xì)胞屬性發(fā)生改變有關(guān)。在未來(lái)的前庭基因治療研究中，須根據(jù)前庭感覺上皮的不同損傷程度來(lái)選擇合適的病毒載體。