毛菊苣中活性物質(zhì)體外抗腫瘤活性篩選的實(shí)驗(yàn)研究

葉銀松,雷 毅，馬曉麗,2，康金森,2，陳錦錦，楊 建,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2新疆天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

毛菊苣（Cichorum glandulosumBoiss.et Huet)為菊科菊苣屬植物，主要生長于我國新疆，所含的倍半萜內(nèi)酯類成分是該植物的特征成分，主要存在于毛菊苣的根、莖、種子中，具有很高的藥用價值[1-4]。在醫(yī)學(xué)上毛菊苣常被用作膽堿藥和利尿劑，以改善肝功能，同時在抗腫瘤方面顯示了良好的療效，存在多成分多靶點(diǎn)起效的特點(diǎn)[5-9]。腫瘤以對機(jī)體的危害性程度和細(xì)胞的特性，將其分為良性腫瘤和惡性腫瘤，惡性腫瘤包括癌和肉瘤，其中源于上皮組織的惡性腫瘤即為癌。研究表明，乳腺癌的發(fā)病率在2020 年全球惡性腫瘤新發(fā)病例中居于首位，是女性最致命的惡性腫瘤之一，占女性診斷癌癥的22%[10]。近年來，盡管在針對乳腺癌的治療策略上取得了重大進(jìn)展，但在女性群體中仍是癌癥相關(guān)死亡的第二大因素。根據(jù)GLOBOCAN 2020 年癌癥發(fā)病率及死亡率的估計值,乳腺癌新增病例230 萬，占癌癥新增病例的11.7%[11-15]。目前針對乳腺癌治療的化療、藥物靶向治療等，取得了一定的治愈和緩解效果，但多數(shù)患者在不同程度上存在對化療藥物的耐藥及不良反應(yīng)。本研究以多種腫瘤細(xì)胞為模型，篩查毛菊苣的抗腫瘤活性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器HF 240 型CO2孵箱（上海力申公司）；KS 18 型超凈臺（美國Thermo 公司）；CKX41 型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；Spectra Max? M5 型酶標(biāo)儀（美國MD 公司）；88500V 型-80℃超低冰箱（美國Thermo 公司）；YDS-80-200F 型液氮凍存罐（中國東亞機(jī)電公司）；Fresco 17 型低溫離心機(jī)（美國Thermo公司）；DK-80 型恒溫水浴箱（上海一恒科技公司）；BCD-539WT 型普通冰箱（海爾公司）；Milli-QA10Ac?ademic 型純水儀（美國Millipore 公司）；MLS-3750 型壓力蒸汽滅菌器（日本SANYO公司）。

1.2 試藥毛菊苣藥材購買于新疆和田地區(qū)墨玉縣，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天藥教研室胡君萍教授鑒定為菊科菊苣屬植物毛菊苣的全草。山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸和綠原酸單體化合物由中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所提供。順鉑（Cisplatin，美國Med Chem Express 公司）；Cell Titer-Glo 化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測試劑盒（美國Promega 公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；雙抗（美國Sigma公司）；胰酶、100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國Hyclone公司）；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞無菌凍存管、15 mL 離心管（美國Corning 公司）；0.22 μm 無菌濾器（美國Millipore 公司）；移液槍（美國Ep?pendorf 公司）。

1.3 細(xì)胞株NCI-H358 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株、BXPC-3 人原位胰腺癌細(xì)胞株、NCI-N87 人胃癌細(xì)胞株、COLO-205 人結(jié)腸癌細(xì)胞株、MDA-MB-453 人乳腺癌細(xì)胞株、MDA-MB-468 人乳腺癌細(xì)胞株、SKBR-3 人乳腺癌細(xì)胞株、HCC1954 人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株均購買于美國ATCC細(xì)胞庫公司。

1.4 方法

1.4.1 受試單體化合物母液配制 取山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸和綠原酸單體化合物溶解于DMSO，配制成濃度為50 μmol/L的母液，備用。

1.4.2 細(xì)胞株的培養(yǎng) 取NCI-H358 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、BXPC-3 人原位胰腺癌細(xì)胞、NCI-N87 人胃癌細(xì)胞、COLO-205 人結(jié)腸癌細(xì)胞、MDA-MB-453 人乳腺癌細(xì)胞、MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞、SK-BR-3人乳腺癌細(xì)胞、HCC1954 人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞，按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.4.3 細(xì)胞活力的檢測 將細(xì)胞以5×104個/mL 的密度，接種于96 孔板（100 μL/孔），待細(xì)胞完全貼壁且生長狀態(tài)良好，將培養(yǎng)的細(xì)胞加入含藥培養(yǎng)基100 μL 混勻，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時分別用培養(yǎng)基按照3.16 倍稀釋成9 份，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，標(biāo)注好給藥時間和濃度，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育至給藥終點(diǎn)。按照CellTiter-Glo 化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測試劑盒的操作手冊進(jìn)行，各組細(xì)胞用胰酶消化后使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，然后在96孔板的每孔中加入100 μL 細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度從50 000 個/孔稀釋到24 個/孔?？瞻卓字屑尤氩缓?xì)胞的培養(yǎng)基，用于檢測背景光值。每孔中加入100 μL CellTiter-Glo 試劑，將微孔板放在振蕩器上溫和振蕩混勻2 min，室溫孵育10 min，使其產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號，用SpectraMax? M5 酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)，采用GraphPad Prism8.0 軟件通過非線性S 曲線回歸擬合數(shù)據(jù)得出劑量-效應(yīng)曲線,并計算IC50值。細(xì)胞存活率%=（Lum 待測藥-Lum 培養(yǎng)液對照）/(Lum 細(xì)胞對照-Lum培養(yǎng)液對照)×100%。

1.4.4 有效單體化合物初篩 采用不同濃度的山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸和綠原酸分別處理NCIH358 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和MDA-MB-453 人乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞72 h 后，采用CTG 化學(xué)發(fā)光法測定NCIH358 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和MDA-MB-453 人乳腺癌細(xì)胞的IC50。

1.4.5 有效單體化合物復(fù)篩 將初篩對腫瘤細(xì)胞活力surviving cells 大于50%的單體化合物舍去，此單體化合物對癌細(xì)胞活力無明顯影響，用不同濃度單體化合物分別處理BXPC-3 人原位胰腺癌腫瘤細(xì)胞、NCI-N87 人胃癌細(xì)胞、COLO-205 人結(jié)腸癌細(xì)胞、MDA-MB-468 人乳腺癌細(xì)胞、SK-BR-3 人乳腺癌細(xì)胞和HCC1954 人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞72 h 后，采用CTG化學(xué)發(fā)光法測試細(xì)胞的IC50。

2 結(jié)果

2.1 毛菊苣中單體化合物初篩菊苣酸和綠原酸對NCI-H358 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和MDA-MB-453 人乳腺癌細(xì)胞活力無明顯影響。山萵苣素和山萵苣苦素對NCI-H358 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和MDAMB-453 腫瘤細(xì)胞活力隨濃度的升高有明顯抑制作用。經(jīng)計算得出，山萵苣素對NCI-H358 腫瘤細(xì)胞的IC50為28.3 μmol/L，山萵苣苦素對NCIH358 腫 瘤 細(xì) 胞的IC50為5.9 μmol/L；山萵 苣 素對MDA-MB-453 人乳腺癌細(xì)胞的IC50為6.237 μmol/L，山萵苣苦素對MDA-MB-453 人乳腺癌細(xì)胞的IC50為1.082 μmol/L，Cisplatin 組IC50為15.94 μmol/L。結(jié)果提示，山萵苣苦素在體外具有較強(qiáng)的抗肺癌效果；山萵苣素和山萵苣苦素在體外對人乳腺癌細(xì)胞活力具有較強(qiáng)的抑制效果且優(yōu)于陽性對照藥Cisplatin,見圖1。

圖1 毛菊苣中單體化合物抗腫瘤初篩結(jié)果

2.2 毛菊苣中單體化合物復(fù)篩山萵苣素對BXPC-3腫瘤細(xì)胞的IC50為36.1 μmol/L，山萵苣苦素對BXPC-3腫瘤細(xì)胞的IC50為8.7 μmol/L；山萵苣素對NCI-N87人胃癌細(xì)胞的IC50為14.8 μmol/L，山萵苣苦素對NCI-N87 人胃癌細(xì)胞的IC50為5.4 μmol/L；山萵苣素對COLO-205 人結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50為8.3 μmol/L，山萵苣苦素對COLO-205 人結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50為2.9 μmol/L；山萵苣素對MDA-MB-468 人乳腺癌細(xì)胞的IC50為5.5 μmol/L，山萵苣苦素對MDA-MB-468 人乳腺癌細(xì)胞的IC50為3.3 μmol/L；山萵苣素對SKBR-3 人乳腺癌細(xì)胞活力的IC50為10.0 μmol/L，山萵苣苦素對SK-BR-3 人乳腺癌細(xì)胞活力的IC50為1.5 μmol/L；山萵苣素對HCC1954 人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞活力的IC50為12.8 μmol/L；山萵苣苦素對HCC1954 人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞活力的IC50為5.6 μmol/L，見表1、圖2。

圖2 毛菊苣中單體化合物抗腫瘤復(fù)篩結(jié)果

表1 毛菊苣中山萵苣素和山萵苣苦素抗腫瘤活性比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究采用CellTiter-Glo 發(fā)光法，CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 是 基 于ATP 檢 測的快速細(xì)胞活力檢測法[16]。在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用，是公認(rèn)的高靈敏度發(fā)光檢測法，細(xì)胞活力檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[17-20]?；诔Ｒ姷娜朔切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH358、人原位胰腺癌細(xì)胞BXPC-3、人胃癌細(xì)胞NCIN87，人結(jié)腸癌細(xì)胞COLO-205、人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-453、MDA-MB-468、SK-BR-3、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞HCC1954 這8 種腫瘤細(xì)胞，考察毛菊苣中山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸和綠原酸的抗腫瘤活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛菊苣的提取物山萵苣素和山萵苣苦素具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用，其中對乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，特別是山萵苣苦素對乳腺癌細(xì)胞增殖具有更強(qiáng)的抑制作用。