從三七渣和三七廢液中提取的三種成分在不同濃度下的體外細胞抗腫瘤活性篩選＊

顧龍龍 梁璇 黃霞 單妍 范戎

三七為五加科植物三七的干燥根，主產(chǎn)于云南、廣西及四川等地，其味甘、微苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有散瘀止血、消腫止痛的功效[1-2]，是我國珍貴的特產(chǎn)藥材和常用中藥。國內(nèi)外多年來對三七的研究，主要集中在水溶性皂苷成分[3]，三七中的許多其他的成分，如三七多糖類、三七素、黃酮、揮發(fā)油、氨基酸及各種微量元素等[4]，隨著研究手段和分離技術(shù)的不斷發(fā)展也被分離出來，具有重要的藥用價值[5]。為了最大限度地利用和節(jié)約三七資源，本實驗在前期實驗研究的基礎(chǔ)上，進一步將提取皂苷過程中產(chǎn)生的大量三七渣和三七廢液充分利用，分離出3種三七提取物，進行了體外細胞抗腫瘤活性篩選實驗并探討其在抗腫瘤方面的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細胞株

儀器：HFC386STD-V12型超低溫冰箱（德國Hereaus公司），CO2孵育箱（德國Heraeus公司），YJ-1450型紫外超凈工作臺SW-CJ-IF（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），METTLER AE240型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），Biorad MODEL 680型BH-2型酶標儀（美國 Bio-rad公司），1.0R型低溫高速離心機（德國Heraeus公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

試劑：RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司），新生牛血清（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），PBS袋裝預(yù)混合試劑（康為生物有限公司），二甲基四氮唑鹽（MTT）（Sigma公司），生理鹽水（昆明南疆制藥有限公司），無水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠），三七脂溶性成分（云南省云科藥業(yè)有限公司，批號：20181018），三七水溶性成分（云南省云科藥業(yè)有限，批號：20181018），含三七素的提取物（云南省云科藥業(yè)有限公司，批號：20181018）。

細胞株：人肝癌細胞株HepG2，人皮膚黑色素瘤細胞株A375，人結(jié)腸癌細胞株HCT-116，人胃癌細胞株SGC-7901，人肺癌細胞A549。保存于昆明醫(yī)科大學(xué)云南省天然藥物藥理重點實驗室。

1.2 藥物及試劑配制

1.2.1 藥物的配制 三七水溶性提取物：稱取三七水溶性提取物，用含10%牛血清的1640培養(yǎng)基溶解，取得濃度為10 mg/ml的藥液并用0.22 μm無菌濾頭過濾備用。

三七脂溶性提取物：稱取三七脂溶性提取物，用含10%牛血清的1640培養(yǎng)基溶解，取得濃度為10 mg/ml的藥液并用0.22 μm無菌濾頭過濾備用。

含三七素提取物：稱取含三七素的提取物，用含10%牛血清的1640培養(yǎng)基溶解，取得濃度為10 mg/ml的藥液并用0.22 μm無菌濾頭過濾備用。

1.2.2 試劑的配制 （1）MTT 溶液配制：5 mg MTT粉末， 加 入 1 ml PBS 配成 5 mg/ml濃 度 的溶液。（2）三聯(lián)液配制：配置含 0.012 mol/L HCl、10%十二烷基硫酸鈉（SDS）、5%異丁醇的三聯(lián)液，即加 1.2 ml 36%～37% 濃鹽酸、100 g SDS、50 ml異丁醇，用1 L三蒸水溶解后備用。

1.3 改良MTT法

參照文獻[6-8]采用改良MTT（MTS）法對5種腫瘤細胞進行體外抑瘤藥理活性篩選。實驗采用常規(guī)細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞。取對數(shù)生長期的各腫瘤細胞，計數(shù)后調(diào)細胞濃度為6×104個/ml，接種于96孔板。給藥組、空白組各設(shè)10個平行孔，每孔 各 80 μl。 將 母 液 按 1、2、4、10、100、1 000倍稀釋為 10 mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml的藥液。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后給藥組每10孔加入一種濃度藥液20 μl，使作用于細胞的終濃度為 2 mg/ml、1 mg/ml、500 μg/ml、200 μg/ml、20 μg/ml、2 μg/ml，空白組加入每孔20 μl含10%牛血清的1640培養(yǎng)基。加藥后在37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/ml）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，每孔加入100 μl三聯(lián)液充分溶解，8～12 h后，用酶標儀在雙波長（570、630 nm）下測定各孔的OD值并用SPSS 17.0統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三七提取物對人肝癌細胞HepG2實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人肝癌細胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人肝癌細胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物濃度為 2 mg/ml的給藥組對人肝癌細胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能抑制細胞生長，見表1。

表1 不同濃度三七提取物對人肝癌細胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表1 不同濃度三七提取物對人肝癌細胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.004 0±0.002 1* 0.266 2±0.027 8 0.227 8±0.015 2 1 mg/ml 0.265 7±0.055 1 0.287 2±0.010 6 0.231 0±0.010 1 500 μg/ml 0.264 7±0.021 9 0.283 4±0.008 5 0.248 5±0.016 1 200 μg/ml 0.280 8±0.009 5 0.257 6±0.006 4 0.229 3±0.019 2 20 μg/ml 0.259 8±0.006 6 0.261 5±0.013 3 0.234 4±0.010 2 2 μg/ml 0.246 4±0.012 0 0.263 9±0.063 4 0.233 5±0.017 5空白組（n=10） 0.262 2±0.011 8 0.268 9±0.015 1 0.245 4±0.006 8

2.2 三七提取物對人結(jié)腸癌細胞HCT-116實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人結(jié)腸癌細胞株HCT-116的藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人結(jié)腸癌細胞株HCT-116的藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物對人結(jié)腸癌細胞株HCT-116在不同的濃度具有不同的藥理作用：濃度為 2 mg/ml、1 mg/ml的給藥組 OD 值均低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能抑制細胞生長，2 mg/ml抑制作用最明顯，其次是 1 mg/ml；濃度為500 μg/ml、200 μg/ml的給藥組OD值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可促進細胞生長，500 μg/ml促進作用最明顯，其次是200 μg/ml，見表2。

表2 三七提取物對人結(jié)腸癌HCT-116的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表2 三七提取物對人結(jié)腸癌HCT-116的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.001 1±0.000 3* 0.304 9±0.021 6 0.266 2±0.027 8 1 mg/ml 0.061 7±0.014 8* 0.318 4±0.013 4 0.287 3±0.010 6 500 μg/ml 0.313 2±0.011 5* 0.317 5±0.011 7 0.283 4±0.008 7 200 μg/ml 0.285 7±0.024 6* 0.301 0±0.005 7 0.257 6±0.006 6 20 μg/ml 0.255 0±0.015 0 0.301 1±0.005 8 0.261 5±0.013 3 2 μg/ml 0.253 0±0.014 2 0.299 6±0.013 9 0.263 9±0.006 4空白組（n=10） 0.266 2±0.007 5 0.307 0±0.005 3 0.268 9±0.151 1

2.3 三七提取物對人胃癌細胞SGC-7901實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人胃癌細胞株SGC-7901藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人胃癌細胞株SGC-7901藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物對人胃癌細胞株SGC-7901在不同的濃度具有不同的藥理作用：濃度為2 mg/ml、1 mg/ml的給藥組OD值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能抑制細胞生長，2 mg/ml抑制作用最明顯，其次是 1 mg/ml；而在為 500 μg/ml、200 μg/ml的給藥組OD值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能促進細胞生長，500 μg/ml促進作用最明顯，其次是200 μg/ml，見表3。

表3 三七提取物對人胃癌細胞株SGC-7901的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表3 三七提取物對人胃癌細胞株SGC-7901的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.006 5±0.002 2* 0.251 3±0.012 6 0.228 2±0.035 9 1 mg/ml 0.106 0±0.042 8* 0.250 1±0.016 7 0.210 2±0.022 7 500 μg/ml 0.288 7±0.019 7* 0.250 6±0.010 0 0.230 7±0.007 1 200 μg/ml 0.252 7±0.013 1* 0.262 8±0.013 7 0.252 7±0.012 7 20 μg/ml 0.246 1±0.007 1 0.235 7±0.007 7 0.217 2±0.005 5 2 μg/ml 0.243 8±0.013 1 0.224 5±0.006 5 0.225 8±0.009 0空白組（n=10） 0.239 2±0.010 5 0.228 7±0.009 6 0.239 2±0.007 4

2.4 三七提取物對人皮膚黑色素瘤細胞A375實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人皮膚黑色素瘤細胞株A375藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人皮膚黑色素瘤細胞株A375藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物對人皮膚黑色素瘤細胞株A375具有抑制生長的藥理作用：濃度為2 mg/ml、1 mg/ml的給藥組OD值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能抑制細胞生長，見表4。

表4 三七提取物對人皮膚黑色素瘤細胞株A375的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表4 三七提取物對人皮膚黑色素瘤細胞株A375的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.007 8±0.002 6* 0.300 7±0.004 3 0.283 0±0.008 7 1 mg/ml 0.129 5±0.019 3* 0.291 1±0.013 8 0.277 4±0.005 8 500 μg/ml 0.256 2±0.008 5 0.291 2±0.007 8 0.273 4±0.011 9 200 μg/ml 0.273 9±0.010 3 0.289 1±0.013 2 0.274 2±0.010 1 20 μg/ml 0.261 0±0.005 6 0.283 8±0.009 1 0.274 0±0.006 6 2 μg/ml 0.260 2±0.005 8 0.286 3±0.004 5 0.277 1±0.007 5空白組（n=10） 0.265 1±0.003 7 0.295 2±0.011 0 0.277 7±0.003 5

2.5 三七提取物人肺癌細胞A549實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人肺癌細胞株A549藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人肺癌細胞株A549藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物對人肺癌細胞株A549在不同的濃度具有不同的藥理作用：濃度為2 mg/ml的給藥組OD值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可抑制細胞生長；而濃度為 1 mg/ml、500 μg/ml、200 μg/ml的給藥組OD值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可促進細胞生長，1 mg/ml促進作用最明顯，見表5。

表5 三七提取物對人肺癌細胞株A549的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表5 三七提取物對人肺癌細胞株A549的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.050 4±0.012 2* 0.291 7±0.008 5 0.287 3±0.010 6 1 mg/ml 0.458 3±0.033 8* 0.299 8±0.015 8 0.283 1±0.005 6 500 μg/ml 0.381 6±0.031 9* 0.293 6±0.004 5 0.272 7±0.016 5 200 μg/ml 0.310 2±0.012 9* 0.287 6±0.008 5 0.274 2±0.009 8 20 μg/ml 0.287 4±0.010 7 0.288 0±0.004 7 0.270 3±0.004 4 2 μg/ml 0.282 0±0.007 5 0.295 2±0.008 5 0.269 0±0.005 2空白組（n=10） 0.283 1±0.008 9 0.294 3±0.007 3 0.278 0±0.010 6

3 討論

三七資源的綜合利用，能最大限度地提高三七資源的利用率，變廢為寶，更能增加企業(yè)經(jīng)濟效益。國內(nèi)學(xué)者在篩選植物抗腫瘤活性成分時發(fā)現(xiàn)，三七醇提物的石油醚部位對結(jié)腸癌細胞株及部分革蘭陽性菌有強烈的抑制活性[9]，對線蟲具有降脂作用[10]，對潰瘍性結(jié)腸炎具有改善作用[9]，通過對分離得到的化合物光譜分析分別鑒定為人參炔醇（panax ynol，Ⅰ）、人參環(huán)氧炔醇（panax ydol，Ⅱ）和B-谷甾醇（B-sitosterol，Ⅲ）。而關(guān)于三七素的研究主要集中在止血作用和抗脂解與促進脂肪合成作用[11-13]。近年來三七多糖的研究也日益受到人們的關(guān)注，有研究表明，三七多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用[14]，國內(nèi)外近期研究也主要集中于三七多糖對機體免疫功能方面上的影響。陳新霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)三七多糖能改善小鼠免疫功能調(diào)節(jié)；張朝貴等[16]發(fā)現(xiàn)三七多糖能影響創(chuàng)傷大鼠CD4+/CD8+和白細胞介素-2水平。

對本實驗結(jié)果統(tǒng)計分析可發(fā)現(xiàn)一定的規(guī)律，對于貼壁細胞（HepG2、A375、A549、SGC-7901、HCT-116），三七脂溶性成分在高濃度時具有明顯的抑制細胞增殖作用，這與脂溶性成分對結(jié)腸癌細胞株及部分革蘭陽性菌有強烈的抑制活性的報道相一致；三七脂溶性成分在中濃度一般具有明顯的促進細胞增殖的作用。而富含三七素的三七提取物與水溶性的三七提取物對腫瘤細胞活性的影響不大，這對三七資源的進一步研究和利用將具有重要的指導(dǎo)意義。