基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討理氣通便方治療慢傳輸型便秘的作用機(jī)制

劉啟鴻，柯 曉*，胡露楠，陳 盈，方文怡，趙培琳，許燕城

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，福建福州 350003；3.福建省中醫(yī)脾胃醫(yī)學(xué)中心，福建福州 350003）

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是一種臨床常見的功能性腸病，以結(jié)腸傳輸時(shí)間延長(zhǎng)、進(jìn)食后結(jié)腸高振幅推進(jìn)收縮減少為特征［1］，臨床上表現(xiàn)為大便次數(shù)減少（每周＜3次）、糞質(zhì)干硬、排便困難等。STC在中醫(yī)學(xué)歸屬“便秘”的范疇，病位在大腸，大腸傳導(dǎo)不利為其發(fā)病機(jī)理，氣機(jī)的升降出入失常，影響腸道的傳輸，大腸傳導(dǎo)功能失職，導(dǎo)致糟粕內(nèi)停，發(fā)為便秘。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，STC的患病人數(shù)在便秘人群中占15%～42%［2］。長(zhǎng)期的便秘不僅會(huì)影響患者的工作與生活，頻繁就醫(yī)服藥還會(huì)加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與精神壓力，此外還可誘發(fā)心腦血管、肛周疾病、腸道腫瘤等并發(fā)癥。雖然目前西醫(yī)治療在不斷完善和規(guī)范，但臨床療效尚不理想。然而，中醫(yī)藥在治療便秘方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，具有藥物依賴性少、遠(yuǎn)期療效滿意等優(yōu)點(diǎn)。

理氣通便方是根據(jù)前期文獻(xiàn)、證候?qū)W調(diào)查研究、中醫(yī)臨床診療經(jīng)驗(yàn)與國(guó)醫(yī)大師楊春波教授學(xué)術(shù)思想的指導(dǎo)下擬定的驗(yàn)方，方藥組成包括厚樸、枳實(shí)、火麻仁、郁李仁、瓜蔞、萊菔子、北柴胡、白芍、陳皮、芒硝10味藥。我們前期通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，理氣通便方治療STC具有一定的療效，可改善氣滯證STC患者臨床癥狀，增加每周自發(fā)排便次數(shù)［3］，但是其療效機(jī)制尚未完全明確，還需要進(jìn)一步深入探索。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興的學(xué)科，主要是描述藥物之間相互作用的特點(diǎn)，與中醫(yī)學(xué)的方劑配伍治療相似，通過形成“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)對(duì)藥物與疾病的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，為中藥復(fù)方現(xiàn)代藥理學(xué)研究與機(jī)制探討提高了精準(zhǔn)度，同時(shí)也促進(jìn)了中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展［4］。對(duì)此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討理氣通便方治療STC的分子機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以北柴胡、白芍、厚樸、枳實(shí)、火麻仁、郁李仁、瓜蔞、萊菔子、陳皮為關(guān)鍵詞，查找這9味藥的化學(xué)成分。利用TCMID（http：//www.ehbio.com/TCMIP/index.php/Home/Index/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)查找TCMSP未收錄的芒硝的化學(xué)成分。選擇口服生物利用度（OB≥30%）與類藥性（DL≥0.18）作為參考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所檢索到的活性成分進(jìn)行篩選［5］，建立理氣通便方的成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。利用TCMSP查找理氣通便方化合物對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，并在Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.Unitprot.org/）查詢靶標(biāo)蛋白相對(duì)應(yīng)的基因名稱與ID。

1.2 STC相關(guān)靶點(diǎn)檢索 運(yùn)用Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org/）收集STC疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并將二者收集的結(jié)果進(jìn)行合并與整理，剔除重復(fù)的靶點(diǎn)，即為STC疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)庫(kù)。

1.3 藥物與疾病交集靶點(diǎn)的獲取 利用Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線工具繪制理氣通便方藥物靶標(biāo)蛋白與STC疾病靶點(diǎn)的韋恩圖，并獲得二者交集靶點(diǎn)的蛋白名稱，即為理氣通便方在治療STC的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4“藥物-潛在作用靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對(duì)交互靶點(diǎn)運(yùn)用Excel表格進(jìn)行整理，分別標(biāo)出疾病、藥物、靶點(diǎn)等對(duì)應(yīng)屬性后，將所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中，可視化地構(gòu)建“藥物-潛在作用靶點(diǎn)-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將交互靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），物種選擇為“人源”進(jìn)行操作，最小相互作用閾值“＞0.9”，構(gòu)建蛋白互作的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO生物學(xué)功能與KEGG通路富集分析 采用Metascape平臺(tái)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG富集分析。GO生物學(xué)功能分析主要從細(xì)胞成分、分子功能和生物過程三個(gè)方面描述基因靶點(diǎn)的作用。KEGG富集分析主要是得到理氣通便方與STC共同靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。GO和KEGG分析皆以P值＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 理氣通便方成分與疾病靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果 從TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索理氣通便方各味藥的有效化合物成分，得到最終選定的結(jié)果為75個(gè)化合物，枳實(shí)22個(gè)、白芍13個(gè)、瓜蔞11個(gè)、柴胡10個(gè)、火麻仁6個(gè)、陳皮5個(gè)、萊菔子3個(gè)、厚樸2個(gè)、郁李仁2個(gè)、芒硝1個(gè)，具體見表1。75個(gè)有效成分進(jìn)一步檢索潛在有效靶點(diǎn)有275個(gè)。通過Gene Card、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到3 887個(gè)STC相關(guān)靶點(diǎn)基因。通過繪制韋恩圖，結(jié)果得到藥物-疾病交互靶點(diǎn)186個(gè)。具體見圖1。

表1 理氣通便方治療慢傳輸型便秘的主要活性化學(xué)成分

圖1 藥物-疾病交互靶點(diǎn)韋恩圖

2.2“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖 利用Cytoscape 3.8.2軟件，導(dǎo)入相應(yīng)文件后構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)。如圖2所示，網(wǎng)絡(luò)中有186個(gè)疾病靶點(diǎn)（圖2藍(lán)色節(jié)點(diǎn)），每條連線則表示理氣通便方與藥物、藥物與作用靶點(diǎn)、作用靶點(diǎn)與STC之間的相互作用關(guān)系。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及其關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取 將186個(gè)交互靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析后，得到蛋白間的相互作用信息，代表相互作用的邊有694條，詳見圖3。另外，繪制出前30位核心靶蛋白相互作用頻次的柱狀圖，橫坐標(biāo)表示此蛋白互作的頻次，數(shù)值越大則表示越重要，這些靶點(diǎn)很可能是理氣通便方治療STC的核心靶點(diǎn)，詳見圖4，結(jié)果提示TP53、MAPK1、AKT1、RELA、JUN、MAPK3、TNF等靶點(diǎn)可能起到了關(guān)鍵作用。

圖3 PPI蛋白互作圖

圖4 核心靶蛋白相互作用頻次的柱狀圖

2.4 GO功能富集分析 GO分析包括分子功能、生物過程、和細(xì)胞組分三個(gè)層次，分別取前10條目錄進(jìn)行條形圖展示，具體見圖5。在分子功能方面主要包括氧化還原酶活性、蛋白激酶結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等；生物過程方面主要包括細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)物、有毒物質(zhì)和脂多糖以及化學(xué)刺激的反應(yīng)、對(duì)活性氧代謝、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分主要包括體元投射、細(xì)胞外間隙、全膜、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔等。

圖5 理氣通便方GO基因功能富集分析圖

2.5 KEGG富集結(jié)果分析 篩選前20條通路進(jìn)行部分展示，根據(jù)結(jié)果可以看出主要涉及與腫瘤相關(guān)通路、細(xì)胞衰老、NF-κB信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路，具體見圖6。

圖6 理氣通便方KEGG通路分析圖

3 討論

理氣通便方是在國(guó)醫(yī)大師楊春波“理氣通降法”學(xué)術(shù)思想的指導(dǎo)下擬定的驗(yàn)方，對(duì)于STC患者具有較好的臨床療效。該方的配伍遵循以通祛疾的治療原則，強(qiáng)調(diào)順應(yīng)大腸通降下行的生理特性，針對(duì)因滯而病的病理特點(diǎn)，方中以理氣藥與潤(rùn)腸通便藥物為主，起到氣機(jī)通暢、腑氣得順的狀態(tài)，最終恢復(fù)大腸的正常傳導(dǎo)功能。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，理氣通便方治療STC的活性化學(xué)成分主要集中在枳實(shí)、瓜蔞、柴胡、白芍四味草藥中。理氣通便方治療作用的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、毛地黃黃酮、花生四烯酸、β-谷甾醇等。槲皮素、山柰酚、毛地黃黃酮屬于黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠活化乳酸菌，減少腸球菌，減少IL-6對(duì)腸道的損傷，保護(hù)腸黏膜，同時(shí)具有潤(rùn)腸通便的作用，緩解慢性傳輸性便秘［6］。槲皮素有強(qiáng)大的活性氧（ROS）清洗功能，能抑制DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠血清MPO、MDA和NO的濃度，減少細(xì)胞氧化損傷，調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)［7］。山柰酚能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減輕Caco-2細(xì)胞IL-8分泌［8］。毛地黃黃酮具有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用［9］?；ㄉ南┧崾且环N不飽和脂肪酸，在肝臟、肌肉等組織中作為磷脂結(jié)合的結(jié)構(gòu)脂類起重要作用，也是前列腺環(huán)素、血栓烷素A2等生物活性物質(zhì)的直接前體，對(duì)脂質(zhì)蛋白的代謝、血液流變學(xué)、白細(xì)胞功能和血小板激活等具有重要的調(diào)節(jié)作用［10］。β-谷甾醇是一類曾被譽(yù)為“生命鑰匙”，含有多種功效的天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗抑郁等生物活性。［11］

圖2“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

通過PPI網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，理氣通便方治療STC的核心靶點(diǎn)有TP53、MAPK、AKT、RELA、JUN、TNF等。TP53基因又稱為P53，作為抑癌基因能夠抑制細(xì)胞分裂和增殖過快，同時(shí)也是預(yù)防癌癥的重要基因［12］。一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌危險(xiǎn)因素的Meta分析結(jié)果顯示［13］，長(zhǎng)期便秘會(huì)增加腸道內(nèi)致癌物質(zhì)對(duì)腸上皮的作用時(shí)間，是誘發(fā)結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素。MAPK是一種絲裂原活化蛋白激酶，可促使肌動(dòng)蛋白細(xì)肌絲相關(guān)蛋白的磷酸化，引起平滑肌收縮［14］。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK表達(dá)與水通道蛋白3、4變化趨勢(shì)呈正相關(guān)，抑制MAPK可增加腸道水分，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)［15］。AKT是PI3K/Akt信號(hào)通路下游的主要作用靶點(diǎn)，位于其上游的PI3K能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活、生長(zhǎng)等，其下游的eNOS是NO的調(diào)節(jié)酶，具有抑制胃腸道平滑肌收縮和抑制胃腸蠕動(dòng)的作用［16］。JUN是MAPK信號(hào)通路的下游效應(yīng)因子，是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)髦良?xì)胞內(nèi)部的核心傳遞者，可促使c-jun、c-fos的表達(dá)，與情緒、疼痛等有密切關(guān)系［17］。TNF分為TNF-α、TNF-β兩種，TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，TNF-β主要由活化的T淋巴細(xì)胞分泌，可引起粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞趨化聚集，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。RELA基因可能對(duì)腸道動(dòng)力學(xué)發(fā)揮作用，但目前研究較少，機(jī)制不明確。

GO分析發(fā)現(xiàn)，理氣通便方治療STC的潛在作用機(jī)制可能是通過對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、含氧化合物、脂質(zhì)等生物過程，參與蛋白質(zhì)或酶結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、調(diào)節(jié)受體配體活性等分子功能，涉及細(xì)胞外的空間區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔細(xì)胞等組分發(fā)揮作用。KEGG分析結(jié)果顯示，主要參與腫瘤、細(xì)胞衰老、NF-κB信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路用。研究表明，腫瘤因子會(huì)造成Cajal間質(zhì)細(xì)胞損傷，Cajal間質(zhì)細(xì)胞是胃腸動(dòng)力的起搏細(xì)胞，參與胃腸起搏介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)的傳播［18］。關(guān)于細(xì)胞衰老的研究，比較有影響力的有自由基、神經(jīng)可塑性下降等學(xué)說(shuō)，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)STC患者存在腸神經(jīng)元細(xì)胞衰老的表現(xiàn)［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥湯劑能夠降低炎癥因子IL-1b和腫瘤壞死因子-α的血清水平，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的磷酸化，并下調(diào)炎癥因子IL-1b和IL-6在便秘大鼠結(jié)腸中的表達(dá)［20］。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路意義作用重大，該通路集中了質(zhì)膜上可以與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體與配體，尤其是5-羥色胺能神經(jīng)突觸和神經(jīng)活性配體受體相互作用，5-羥色胺主要是由結(jié)腸黏膜中腸嗜鉻細(xì)胞的合成而來(lái)，調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)，5-羥色胺異常是引起STC發(fā)病的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT對(duì)腸道功能的調(diào)節(jié)依賴于不同的受體?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在STC患者結(jié)腸壁中五羥色胺受體-3表達(dá)降低，同時(shí)五羥色胺受體-4在黏膜層、黏膜下神經(jīng)叢、肌間神經(jīng)叢及肌層中的表達(dá)下降［21］。

基于前期臨床研究的基礎(chǔ)，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)理氣通便方治療慢傳輸型便秘的作用靶點(diǎn)和通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)篩選和分析，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了新的思路方向和理論基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)理氣通便方有不同的活性成分，能參與到不同的生物學(xué)進(jìn)程，初步揭示了理氣通便方作用于慢傳輸型便秘的多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制提供參考方向。