水蜈蚣對急性肝損傷小鼠的保護作用及機制研究

陳 燕，簡鳳嬌，楊靜紅，林東賢，陳亞萍

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州 350122）

肝臟急慢性炎性是導致肝纖維化，甚至肝硬化、肝癌發(fā)生的重要始動因素［1］。目前現(xiàn)代醫(yī)學還未發(fā)現(xiàn)理想的治療肝損傷藥物，鑒于此人們把目光轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)醫(yī)學，研發(fā)新型的中藥制劑。中醫(yī)學者認為濕熱內(nèi)蘊是慢性肝炎的重要病理環(huán)節(jié)，故肝炎中醫(yī)治療以清熱祛濕、疏肝理氣、祛瘀通絡為原則［2］。水蜈蚣（K yllinga b revifoliaRottb.）為莎草科水蜈蚣屬（K ylli ngaRottb）短葉水蜈蚣，主要分布于安徽、浙江、福建、湖南、廣東等地區(qū)［3］，具有疏風解毒、清熱利濕的作用，臨床可治療肝炎、黃疸、氣管炎、瘧疾等疾?。?-5］。水蜈蚣治療肝病理論上符合中醫(yī)治療肝炎“清熱祛濕”的原則?，F(xiàn)代藥理研究證明，水蜈蚣對小鼠具有鎮(zhèn)靜和抗焦慮［6］、減輕氧化應激、抗脂質(zhì)過氧化［7］、清除自由基等作用［8-9］。水蜈蚣是否有對急性肝損傷有保護作用，未見相關研究。因此，本研究探討水蜈蚣對小鼠急性肝損傷作用，并通過生物化學檢測技術，分析水蜈蚣抗急性肝損傷與脂質(zhì)過氧化及相關標志物水平、免疫細胞因子的關系，以期初步探明水蜈蚣抗急性肝損傷的可能機制，為水蜈蚣的保護肝損傷的臨床用藥提供理論依據(jù)，并為清熱祛濕治療肝病的中醫(yī)傳統(tǒng)療法進行現(xiàn)代科學闡釋。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～20 g，由吳氏實驗動物提供，合格證號：SCXK（閩）2016-0002。

1.2 實驗藥物 水蜈蚣全草購自福建省福州市西洪路草藥店，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為莎草科植物水蜈蚣（K ylli nga br evifoli aRottb）；聯(lián)苯雙酯滴丸（北京協(xié)和藥廠）。

1.3 實驗試劑 分析純CCL4（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20191109）；食用花生油（山東魯花集團有限公司，批號：GB1534）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A003-1、A003-1、C010-2、C009-2）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號P0012）；4%多聚甲醛溶液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：YP184309）。

1.4 實驗儀器 Infinite M200 PRO多功能酶標儀（瑞士TECAN公司）；DMi8倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；HM325石蠟切片機（美國Thermo公司）；YT-7FB生物組織攤烤機、YB-6LF生物組織石蠟包埋機（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術有限公司）；TS-12D生物組織自動脫水機（湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；5418 R低溫高速離心機（美國Eppendorf公司）。

2 實驗方法

2.1 藥液制備

2.1.1 水蜈蚣水煎液制備 稱取69 g水蜈蚣干草，蒸餾水浸泡15 min后，煎煮2次，每次1 h，將2次溶液合并，抽濾，棄去雜質(zhì)。將總?cè)芤簻p壓濃縮至1.44 g/mL，置-20℃冰箱中儲存，臨用前解凍至室溫。

2.1.2 聯(lián)苯雙酯溶液制備 精密稱取聯(lián)苯雙酯滴丸800 mg，置于研缽中，研碎，加入生理鹽水80 mL，混勻后備用。

2.2 水蜈蚣最大耐受量試驗 同“2.1.1”制備水蜈蚣水煎液，濃度0.96 g/mL，10只ICR小鼠每6 h按30 mL/kg予水蜈蚣水煎液灌胃給藥，連續(xù)給藥3次，觀察小鼠的存活狀態(tài)及生理活動，并計算最大耐受量。

2.3 動物分組、給藥與造模 50只ICR小鼠按體質(zhì)量隨機數(shù)表法分為5組，分別為正常組、模型組、水蜈蚣低劑量組、水蜈蚣高劑量組、聯(lián)苯雙酯組。水蜈蚣低、高劑量組分別按1/6最大耐受量和1/3最大耐受量，即14.4、28.8 g/（kg·d）予水蜈蚣水煎液灌胃，聯(lián)苯雙酯組按0.2 g/（kg·d）予聯(lián)苯雙酯溶液灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)灌胃13 d。末次給藥1 h后，正常組按10 mL/kg腹腔注射花生油，其余4組小鼠按10 mL/kg予0.5%CCl4花生油溶液腹腔注射建立急性肝損傷小鼠模型，注射后小鼠禁食不禁水，染毒24 h后摘眼球取血，取小鼠肝組織并稱重。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 小鼠肝臟指數(shù)的檢測 染毒24 h后稱量并記錄小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血后處死小鼠，迅速剪開小鼠腹腔，取下完整肝臟并用預冷的生理鹽水清洗，濾紙吸干，電子天平稱量肝臟重量并記錄，計算肝臟指數(shù)。

2.4.2 HE染色觀察肝組織病理形態(tài) 取5組小鼠肝左葉中間部位，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片。經(jīng)HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況。

2.4.3 小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化水平檢測 取小鼠肝臟100 mg，加入1 mL預冷生理鹽水研磨，制成10%肝勻漿溶液，用臺式冷凍離心機3 500 r/min離心15 min，取上清液于EP管中備用。根據(jù)相應試劑盒操作說明測定蛋白濃度，并計算SOD、MDA含量。

2.4.4 小鼠生化指標及血清炎癥因子的測定 摘眼球取血后，在室溫下靜置2 h，待血液凝固后，將其放于冷凍離心機中，4℃、3 500 r/min的條件下離心15 min，將上清液（即血清）取至另一干凈離心管中，保存于-20℃冰箱中備用。根據(jù)相應試劑盒說明檢測血清中GPT、GOT活性；應用ELISA法檢測血清中的TNF-α、IL-6的含量，根據(jù)MCP-RayBio試劑盒操作說明測定MCP-1的含量。

2.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件包和GraphPad Prism5軟件進行處理。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，當差別有統(tǒng)計學意義時采用LSD-t或Dunnett-t檢驗對多個獨立樣本均數(shù)進行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 水蜈蚣最大耐受量試驗 灌胃給藥后觀察1周，發(fā)現(xiàn)小鼠均存活，狀態(tài)良好，活潑無異常，計算最大耐受量為86.4 g/kg。

3.2 5組小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較 小鼠肝臟指數(shù)結(jié)果顯示，模型組與正常組對比有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明經(jīng)CCL4損傷后，能明顯引起小鼠肝臟重量增加，聯(lián)苯雙酯組、水蜈蚣低、高劑量組較模型組明顯降低（P＜0.05），說明被水蜈蚣和聯(lián)苯雙酯治療后，小鼠肝臟重量增加的情況有所好轉(zhuǎn)，提示小鼠經(jīng)治療后可減輕肝臟的腫大。見表1。

表1 5組小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較（±s）

表1 5組小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05。

肝臟指數(shù)/%4.78±0.24 5.40±0.451）4.82±0.332）4.99±0.552）4.78±0.512）組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組水蜈蚣低劑量組水蜈蚣高劑量組劑量g/（kg·d）——0.2 14.4 28.8體質(zhì)量/g 25.42±3.61 24.38±2.71 24.46±3.73 24.45±2.60 25.20±2.47肝臟質(zhì)量/g 1.22±0.22 1.31±0.14 1.18±0.17 1.22±0.18 1.20±0.18

3.3 肝臟組織病理形態(tài)觀察 正常組小鼠肝小葉結(jié)構完整，肝索正常呈放射狀，核仁明顯，核膜清晰，未見肝細胞變性、壞死等。模型組可見肝細胞大量片狀壞死，伴有炎性細胞浸潤。聯(lián)苯雙酯組與模型組相比稍有好轉(zhuǎn)，但仍可見部分肝細胞點狀壞死；水蜈蚣低劑量組中肝臟病變程度較模型組減輕，局部可見肝細胞壞死；水蜈蚣高劑量組肝細胞結(jié)構完整，排列整齊，無明顯肝細胞變性，仍可見少量炎性細胞浸潤。結(jié)果說明水蜈蚣能改善肝損傷小鼠病理病變及壞死程度。見圖1、圖2。

圖1 5組小鼠肝臟組織HE染色圖（×200）

圖2 5組小鼠肝臟病理損傷評分比較

3.4 5組小鼠肝組織SOD和MDA活力比較 與正常組比較，模型組小鼠肝組織SOD活力顯著降低，MDA含量顯著提高（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和水蜈蚣低劑量組小鼠肝組織SOD活力明顯提高，MDA含量明顯降低（P＜0.05）；水蜈蚣高劑量組小鼠肝組織SOD活力顯著提高，MDA含量顯著降低（P＜0.01）。該結(jié)果表明，水蜈蚣可能通過抗氧化應激作用起到保肝效果。見表2。

表2 5組小鼠肝組織SOD和MDA活力比較（±s）

表2 5組小鼠肝組織SOD和MDA活力比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組水蜈蚣低劑量組水蜈蚣高劑量組MDA/（nmol/mg）1.41±0.74 5.05±1.111）3.22±0.932）3.44±2.262）2.67±0.963）劑量/［g/（kg·d）］——0.2 14.4 28.8 SOD/（IU/mg）36.23±8.61 15.90±4.091）27.18±8.822）27.70±8.992）30.17±10.133）

3.5 5組小鼠血清GPT和GOT含量比較 與正常組比較，模型組血清GPT、GOT活力均顯著升高（P＜0.01），表明CCL4致小鼠急性肝損傷模型建立成功。與模型組比較，水蜈蚣低劑量組和聯(lián)苯雙酯組小鼠血清GPT活力顯著降低（P＜0.01），GOT活力明顯降低（P＜0.05）；水蜈蚣高劑量組小鼠血清GPT、GOT活力均顯著降低（P＜0.01），提示水蜈蚣對CCL4所致的急性肝損傷小鼠有降酶作用。見表3。

表3 5組小鼠血清GPT和GOT含量比較（±s） U/L

表3 5組小鼠血清GPT和GOT含量比較（±s） U/L

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

GOT 21.49±9.00 163.98±24.571）98.99±38.832）101.40±44.682）90.70±54.783）組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組水蜈蚣低劑量組水蜈蚣高劑量組劑量/［g/（kg·d）］——0.2 14.4 28.8 GPT 23.80±13.94 384.39±148.851）173.84±181.483）132.24±69.353）103.72±105.643）

3.6 5組小鼠血清炎癥因子指標比較 與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1含量均顯著提高（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和水蜈蚣低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1含量明顯降低（P＜0.05）；水蜈蚣高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1含量顯著降低（P＜0.01）。該結(jié)果表明，炎癥反應可能是肝損傷的重要發(fā)病機制，而水蜈蚣可能通過抑制該發(fā)病機制起到保肝作用。見表4。

表4 5組小鼠血清炎癥因子指標比較（±s） pg/mL

表4 5組小鼠血清炎癥因子指標比較（±s） pg/mL

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

MCP-1 116.29±88.27 880.64±197.701）643.60±214.362）652.80±157.192）565.56±136.193）組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組水蜈蚣低劑量組水蜈蚣高劑量組劑量/［g/（kg·d）］——0.2 14.4 28.8 TNF-α 87.96±43.05 219.56±77.361）147.17±43.592）151.32±69.252）128.11±41.593）IL-6 41.89±28.74 139.79±65.001）71.76±16.562）75.22±60.622）80.95±25.113）

4 討論

肝臟是體內(nèi)代謝過程中重要的器官，同時也是各種致病因子或疾病攻擊的對象，如藥物、病毒、免疫性疾病等誘導因素致其受損，并繼發(fā)瞬時的炎癥反應，損傷的反復發(fā)生則引起肝臟的慢性炎癥及過度的組織修復，最終發(fā)展為肝炎［10］。本次實驗采用CCL4腹腔注射造成小鼠急性肝損傷，并用水蜈蚣水煎液進行干預，以此探究水蜈蚣對急性肝損傷的作用機制。聯(lián)苯雙酯滴丸是用于治療肝炎的降酶藥物，它對肝臟具有明顯的保護作用［11］。動物實驗表明，小鼠口服聯(lián)苯雙酯滴丸150～200 mg/kg就可減輕因CCl4所致的肝臟損害和GPT異常，該藥對肝臟細胞中微粒體的過氧化脂質(zhì)及CCl4組化生成CO有比較大的阻止作用，并且該藥又可降低機體對CCl4分解解毒中還原輔酶及O2的消耗，從而達到保護肝細胞生物膜的藥理作用［12］。因此在評價藥物對小鼠CCL4所致肝損傷模型的保護作用時選其作為陽性藥物。

CCL4是誘導小鼠急性肝損傷模型的經(jīng)典誘導劑。當CCL4進入體內(nèi)后經(jīng)細胞色素P450激活會產(chǎn)生三氯甲基自由基和過氧化三氯甲基自由基，破壞細胞膜，使GPT、GOT大量流出［13］，造成血清中這兩種酶的活性大大增高。因此檢測小鼠血清中GPT、GOT的含量，可以判斷小鼠肝細胞的損壞程度。CCL4被細胞色素P450酶氧化分解會產(chǎn)生較多可以調(diào)節(jié)各種免疫和炎癥分子的表達，導致炎癥反應加劇和組織損傷的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）［14］。而SOD是機體重要的抗氧化酶，具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化的作用，從而保護細胞結(jié)構，可以反映機體的抗氧化能力［15］。MDA是脂質(zhì)過氧化反應生成的終產(chǎn)物，它的產(chǎn)生與脂質(zhì)過氧化平行，測定其含量不僅可反映脂質(zhì)過氧化的程度，同時也間接反映了機體細胞損傷的程度及氧自由基水平［16］。本研究結(jié)果表明，水蜈蚣組和聯(lián)苯雙酯組GOT、GPT、MDA含量較模型組明顯降低，SOD活性明顯提高，提示水蜈蚣水煎液具有直接的肝損傷保護和抗炎活性，并且可能通過減輕脂質(zhì)過氧化和氧化應激而改善CCl4所致肝損傷。

脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生的MDA等脂質(zhì)過氧化物可趨化中性粒細胞，作用于核因子-κB（NF-κB），使致炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α等的基因表達、釋放增加，這些細胞因子可介導炎癥反應，加重肝細胞損傷［17］。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）是單核細胞家族活性最強的趨化因子，在IL-8、TNF-α、LPS等致炎因子的刺激下，由單核細胞、Kupffer細胞等分泌，是誘導免疫細胞參與炎癥反應的關鍵，持續(xù)炎癥反應，加速病情發(fā)展［18-22］?；罨蟮腗1型巨噬細胞會高表達MCP-1，通過NF-κB對M1型巨噬細胞炎癥因子表達的調(diào)控，從而控制炎癥進展［23］。MCP-1含量的測定對進一步探究巨噬細胞的極化表達及水蜈蚣抗肝炎的機制有一定的提示作用。本實驗中模型組血清IL-6、TNF-α、MCP-1水平較正常組明顯升高，水蜈蚣組和聯(lián)苯雙酯組血清IL-6、TNF-α和MCP-1水平較模型組明顯降低，提示水蜈蚣可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子水平，減輕炎癥反應而改善CCl4所致肝損傷。

本研究表明水蜈蚣水煎液有保肝的作用，現(xiàn)代化學研究表明，水蜈蚣全草中含有黃酮苷、揮發(fā)油、有機酸、酚性成分等［7］。已有研究表明中藥的黃酮類化合物具有抗炎，提高肝臟組織抗氧化水平，消除自由基的作用，從而達到改善肝組織病理變化，保護肝臟的目的［24］。而水蜈蚣中黃酮類成分是不是保肝作用的物質(zhì)基礎，還需進一步的研究。