Keap1-Nrf2 信號(hào)通路在機(jī)體氧化應(yīng)激損傷防護(hù)中的研究進(jìn)展

梁新妹 王云平 李 丹 王文婧 穆欣顏 韓清臣 李 博 張立雙

天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300451

Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）-核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2（nuclear transcription factor E2-related factor 2，Nrf2）介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)體系，是機(jī)體內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路重要的組成部分[1]。Keap1-Nrf2 信號(hào)通路的激活可調(diào)控機(jī)體內(nèi)一些抗氧化酶和蛋白質(zhì)的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，并參與炎癥、癌癥、腦缺血性疾病、糖尿病等發(fā)病過程。因此，該通路在多種氧化應(yīng)激導(dǎo)致的疾病中扮演著重要角色[2]。本文從該通路的基本結(jié)構(gòu)與氧化應(yīng)激[Nrf2、Keap1、抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）的結(jié)構(gòu)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)系）]、調(diào)控機(jī)制（Nrf2 與Keap1 的解偶聯(lián)、Nrf2 磷酸化作用、Nrf2 的降解減弱機(jī)制、門閂和樞紐學(xué)說等機(jī)制）及與各種疾病的關(guān)系等方面展開綜述。

1 Kelch-Nrf2 通路與氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激是一種外界刺激導(dǎo)致的機(jī)體內(nèi)氧化/抗氧化動(dòng)態(tài)平衡失衡，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。正常狀態(tài)下，參與活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的系統(tǒng)和清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡。外界環(huán)境的刺激或機(jī)體自身的穩(wěn)態(tài)變化等原因，使機(jī)體內(nèi)的ROS產(chǎn)生增多或機(jī)體對(duì)ROS 的清除能力下降，會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激[3]。長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激這種異常狀態(tài)，會(huì)使機(jī)體處于易損狀態(tài)，致病因素對(duì)集體的毒性作用會(huì)明顯增強(qiáng)，可導(dǎo)致基因突變[3]。

ROS 是一類氧的單電子還原產(chǎn)物，包括超氧自由基和羥基自由基，以及非自由基分子如過氧化氫等。其中一部分物質(zhì)如超氧化物或羥基自由基，極不穩(wěn)定；而另一部分物質(zhì)，如過氧化氫，則可自由擴(kuò)散，壽命相對(duì)較長(zhǎng)。目前認(rèn)為ROS 主要由線粒體內(nèi)的ETC 膜電子傳遞鏈和氧分子之間的非特異性反應(yīng)所生成[4]。

在生物體，有大量含氧分子的氧化電位，ROS是其中的一種，其余還有包括單O2、超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基和活性氮、過氧亞硝基陰離子、二氧化氮和三氧化二氮。其都是強(qiáng)有力的氧化劑，可以由細(xì)胞（吞噬細(xì)胞或上皮細(xì)胞等）的正常代謝產(chǎn)生；也可以由外源因素誘導(dǎo)產(chǎn)生。在細(xì)胞中，ROS 積累和活性氮增加蛋白質(zhì)的氧化修飾，對(duì)蛋白質(zhì)的羰基含量和改性的殘基或硝基發(fā)生氧化均有影響，生成氫過氧化物脂質(zhì)、脂質(zhì)衍生物及嘌呤和嘧啶，誘導(dǎo)DNA 聚合與斷裂，通過對(duì)大分子物質(zhì)的氧化攻擊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜、核酸的功能障礙[5]。ROS 過度積累，并且濃度持續(xù)較高，極易與核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子物質(zhì)產(chǎn)生氧化反應(yīng)，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生損害，引發(fā)疾病[6]。

2 Keap1-Nrf2-ARE 的結(jié)構(gòu)

2.1 Keap1 的基本結(jié)構(gòu)

Keap1 是一種69 kD 的蛋白，負(fù)調(diào)控Nrf2。Keap1包含627 個(gè)氨基酸殘基，共分為5 個(gè)區(qū)域。①NTR 區(qū)，N 端域。②BTB 區(qū)，負(fù)責(zé)同源二聚化Cul3 與Nrf2 泛素化過程，與介導(dǎo)Keap1-Nrf2 結(jié)合有關(guān)，其核心位點(diǎn)Ser-104 突變會(huì)影響Keap1 二聚化，干擾Nrf2 的結(jié)合[6]。③IVR 區(qū)，連接BTB 與DGR 的區(qū)域。該區(qū)富含半胱氨酸，Keap1 與ROS 及親電試劑的反應(yīng)都發(fā)生在IVR區(qū)，兩個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸殘基Cys273 和Cys288 對(duì)調(diào)節(jié)E3 連接酶活性至關(guān)重要，因此與Nrf2 穩(wěn)定性有關(guān)，是Nrf2 降解的關(guān)鍵。④C 末端DGR 區(qū)，Kelch 領(lǐng)域區(qū)擁有多個(gè)蛋白接觸位點(diǎn)，介導(dǎo)Keap1 與Nrf2 和細(xì)胞骨架等蛋白的關(guān)聯(lián)[6]。⑤CTR、DGR 和CTR 一起被稱為Keap1-DC，對(duì)Nrf2 的Neh2 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合至關(guān)重要[7]。

2.2 Nrf2 的基本結(jié)構(gòu)

Nrf2 屬于轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個(gè)小家族，存在于機(jī)體的各個(gè)組織器官中[7]。Nrf2 可誘導(dǎo)一組抗氧化和解毒酶基因，在保護(hù)機(jī)體免受各種環(huán)境刺激等方面起著關(guān)鍵作用。

Nrf2 分為7 個(gè)Nrf2-ECH 同源結(jié)構(gòu)域（Nrf2-ECH homology domains，Neh），這些區(qū)域在不同物種間高度保守。Neh1 區(qū)包含介導(dǎo)DNA 結(jié)合和二聚體形成的CNC 和bZIP 構(gòu)域，有利于Nrf2 與DNA 的結(jié)合，調(diào)控目標(biāo)基因和下游酶的表達(dá)。Neh2 區(qū)包含兩個(gè)綁定基序DLG 和ETGE，能夠與Keap1 的DGR 區(qū)結(jié)合，使Nrf2 被錨定于細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制其活性[8]。Neh3，Neh4 和Neh5 是反式激活區(qū)域，Neh3 區(qū)是Nrf2 基因轉(zhuǎn)錄必不可少的功能區(qū)域[9]。Neh4 和Neh5 是存在于Neh1 和Neh2 之間的兩個(gè)激活區(qū)，可協(xié)同促進(jìn)Nrf2 轉(zhuǎn)錄，結(jié)合RAC3/AIB1/SRC-3，增加Nrf2-ARE 基因表達(dá)[10]。Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核與ARE 結(jié)合后，需要在Neh4、Neh5 與共激活因子cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白相互作用下，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。Neh6 區(qū)是Nrf2 降解調(diào)控區(qū)域，該區(qū)域與Nrf2 的負(fù)性調(diào)節(jié)有關(guān)[11]。Nrf2 的缺失或激活障礙，會(huì)增加細(xì)胞對(duì)外界刺激的敏感性，與多種疾病密切相關(guān)[10]。

2.3 ARE 的基本結(jié)構(gòu)

ARE 是一種重要的抗氧化應(yīng)激損傷順式反應(yīng)元件[12]，位于某些細(xì)胞保護(hù)基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域，編碼許多解毒酶和細(xì)胞保護(hù)蛋白基因，又稱親電反應(yīng)元件。ARE 具有典型的活性功能，其核心序列為5’-（G/A）TGA（G/C）nnnGC（G/A）-3’（n 為任意核苷酸）。氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2 與Maf 形成異二聚體，識(shí)別并結(jié)合到ARE上，從而激活Nrf2-ARE 信號(hào)通路[13]。

3 Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制

Keap1 是氧化還原損傷的傳感器，富含半胱氨酸硫醇；而Nrf2 是調(diào)節(jié)細(xì)胞保護(hù)基因。Keap1-Nrf2 系統(tǒng)廣泛參與細(xì)胞的增殖和分化，在細(xì)胞保護(hù)等方面起到至關(guān)重要的作用[12-13]。

3.1 Nrf2 與Keap1 解偶聯(lián)

生理狀態(tài)下，Keap1 與Nrf2 相結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成Keap1-Nrf2 異二聚體。應(yīng)激狀態(tài)下，其是Keap1的IVR 結(jié)構(gòu)與親電試劑或ROS 起反應(yīng)的傳感蛋白，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)氧化還原的感應(yīng)器。ROS 親電子物質(zhì)通過影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)導(dǎo)致Keap1 的IVR結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基（Cys273、Cys288）被修飾，從而使Keap1 構(gòu)象改變[14]，失去對(duì)Nrf2 負(fù)性調(diào)節(jié)功能，Nrf2 與Keap1 發(fā)生解偶聯(lián)后，Nrf2 不再被泛素蛋白酶體降解[15]，激活的Nrf2 調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄[16]。

3.2 Nrf2 磷酸化作用

Nrf2 的磷酸化使Nrf2 的degron 結(jié)構(gòu)區(qū)域的構(gòu)象發(fā)生改變，阻礙了E3 泛素化連接酶識(shí)別degron 結(jié)構(gòu)，激活Nrf2 固有的轉(zhuǎn)錄活性[17]。研究發(fā)現(xiàn)，PKC 可引起Nrf2 的Ser-40 位點(diǎn)磷酸化[18]，同時(shí)該種磷酸化修飾還能夠進(jìn)一步降低Nrf2 與Keap1 的親和力[19]。

3.3 Keap1 介導(dǎo)的泛素化與蛋白酶對(duì)Nrf2 的降解減弱機(jī)制

研究證實(shí)，Keap1 能促進(jìn)Nrf2 泛素化，而Nrf2 穩(wěn)定性和活性受蛋白酶調(diào)節(jié)[20]。Nrf2 通過Neh2 區(qū)中的兩個(gè)基序：高親和力ETGE 和低親和力DLG 基序與Keap1 直接相互作用。在非脅迫條件下，ETGE 和DLG 基序之間的7 個(gè)泛素化靶點(diǎn)賴氨酸殘基被含有Keap1 的E3 泛素連接酶泛素化，隨后通過蛋白酶體途徑降解。Nrf2 的降解減弱還受到亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄后修飾等調(diào)控[21-22]。

3.4 門閂和樞紐學(xué)說

Keap1 二聚體的兩個(gè)DGR 區(qū)分別與Nrf2 的DLG、ETGE 兩個(gè)基序通過疏水作用和氫鍵相結(jié)合，介導(dǎo)降解Nrf2 的泛素化。ROS 刺激后，會(huì)從DGR 區(qū)解離低親和力的DLG 區(qū)，泛素化降解Nrf2。Keap1 的位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)，在ARE 介導(dǎo)下，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)[15]。

4 Keap1-Nrf2 信號(hào)通路與疾病的關(guān)系

Nrf2 活性及其調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)維持健康至關(guān)重要，Keap1-Nrf2 參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[3,23-24]，該通路已成為預(yù)防和治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

4.1 Keap1-Nrf2 信號(hào)通路與炎癥的關(guān)系

當(dāng)內(nèi)源性應(yīng)激防御機(jī)制失衡時(shí)，Keap1-Nef2 的信號(hào)通路可保護(hù)細(xì)胞面對(duì)氧化損傷。Nrf2 基因經(jīng)腺病毒傳遞至大鼠心室心肌細(xì)胞后，Nrf2 在胞質(zhì)和核內(nèi)均有高水平的表達(dá)。Nrf2 的過表達(dá)增加了幾種依賴于ARE 的抗氧化和細(xì)胞保護(hù)酶的表達(dá)[25]。在炎癥損傷早期，Nrf2-ARE 可能抑制促炎介質(zhì)的表達(dá)[23,26]。芍藥湯通過對(duì)Keap1-Nrf2 通路的調(diào)控作用，減弱了腸炎癌變小鼠模型[27]。同時(shí)，土茯苓對(duì)肝纖維化動(dòng)物的炎癥消減作用也與Keap1-Nrf2 通路相關(guān)[28]。因此，通過激活Nrf2-ARE 系統(tǒng)對(duì)機(jī)體保護(hù)炎癥組織損傷起到至關(guān)重要的作用[26]。

4.2 Keap1-Nrf2 信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系

Nrf2 在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1 結(jié)合，處于穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)受到氧化應(yīng)激或親電試劑刺激時(shí)，Nrf2 與Keap1 解偶聯(lián)，與ARE 結(jié)合并激活下游抗氧化基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，提高細(xì)胞氧化應(yīng)激及修復(fù)功能[29]。通過促進(jìn)Nrf2 核異位，誘導(dǎo)相關(guān)保護(hù)蛋白抵抗正常細(xì)胞發(fā)生惡變的能力[30]。Nrf2 可通過激活抗氧化應(yīng)激通路保護(hù)細(xì)胞免受DNA 破壞性侵害，從而抑制腫瘤的發(fā)生。一旦通過獲得一個(gè)或幾個(gè)致癌突變來轉(zhuǎn)化細(xì)胞，則會(huì)促進(jìn)腫瘤的形成。Keap1、Nrf2 和CUL3 基因的突變可破壞Nrf2和Keap1 之間的相互作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中Nrf2 信號(hào)的本構(gòu)性激活，具有高水平Nrf2 活性的腫瘤細(xì)胞會(huì)通過新陳代謝重新編程來促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲性增殖[31]，以及對(duì)抗癌治療的抵抗[32-33]。

4.3 Keap1-Nrf2 信號(hào)通路與腦缺血的關(guān)系

腦是代謝率最高的器官，腦內(nèi)正常存在抗氧化酶可清除ROS[34]。在腦缺血過程中，腦內(nèi)生成乳酸，可大量生成ROS，原因如下：①游離Fe2+濃度升高；②O2·-轉(zhuǎn)化生成過氧化氫的速率提高。再灌注時(shí)，線粒體膜電位超極化可增加電子漏發(fā)生率，促使ROS 增長(zhǎng)[35-37]。另外，再灌注時(shí)次黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤，釋放大量電子，生成大量ROS。在CIRI 過程中，由于消耗抗氧化物，腦內(nèi)清除ROS 的能力下降，引起氧化應(yīng)激[38]?；罨疜eap1-Nrf2 通路可以清除ROS，保護(hù)神經(jīng)元。

4.4 Keap1-Nrf2 信號(hào)通路與糖尿病的關(guān)系

糖尿病是一種常見的代謝性疾病。氧化應(yīng)激的增加可能激活多種應(yīng)激激酶，如c-Jun 氨基末端激酶通過胰島素受體底物1 的絲氨酸磷酸化，破壞胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致胰島素抵抗。Nrf2 介導(dǎo)的內(nèi)源性抗氧劑的表達(dá)已被認(rèn)為是機(jī)體防御高血糖誘導(dǎo)的糖尿病氧化損傷的重要適應(yīng)性防御機(jī)制[39-40]。

一方面，高糖可誘導(dǎo)線粒體內(nèi)的電子傳遞呼吸鏈產(chǎn)生大量的超氧化物，造成機(jī)體和細(xì)胞氧化應(yīng)激；另一方面，氧化應(yīng)激損傷可通過活化其敏感性信號(hào)通路引起胰島素抵抗[41]。?；撬崮軌蛲ㄟ^誘導(dǎo)Nrf2 核異位，使ROS 生成減少，從而減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗[42]。Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路通過促進(jìn)Nrf2核異位并與ARE 結(jié)合，改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞胰島素抵抗。

Nrf2 可保護(hù)胰島β 細(xì)胞免受各種類型的損傷，包括與氧化劑、有毒化學(xué)物質(zhì)和炎癥相關(guān)的損傷。Nrf2信號(hào)的激活通過促進(jìn)AMPK 磷酸化、耗氧量和葡萄糖攝取、抑制糖異生和體重增加來抑制胰島素抵抗的發(fā)生。Keap1、Nrf2 因子及Keap1-Nrf2 信號(hào)通路在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中可對(duì)抗氧化應(yīng)激，從而保護(hù)胰島β 細(xì)胞[43]。

5 結(jié)語

綜上所述，氧化應(yīng)激不僅可以引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，同時(shí)與臨床上許多疾病有一定的相關(guān)性。Keap1-Nrf2信號(hào)通路能夠激活細(xì)胞對(duì)各種氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，使細(xì)胞通過誘導(dǎo)多種編碼調(diào)節(jié)下游抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)來抵御有害刺激，平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，降低氧化應(yīng)激損傷。多種疾病的發(fā)生均與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，Keap1-Nrf2 信號(hào)通路在許多疾病中的調(diào)控十分精細(xì)、復(fù)雜。臨床上，替拉格司他通過靶向該通路已經(jīng)成為治療非小細(xì)胞肺癌的新靶向藥；抑制劑Sapanisertib 已獲得FDA 的批注，開展臨床研究。同時(shí)也應(yīng)當(dāng)注意到，針對(duì)該通路的研究主要是基于細(xì)胞層面和動(dòng)物模型層面上，臨床上針對(duì)該通路靶點(diǎn)的藥物多數(shù)還在臨床試驗(yàn)委托合同研究驗(yàn)證階段，走向臨床還需要一段距離。但是我們相信，在不斷發(fā)展的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)面前，以Keap1-Nrf2 信號(hào)通路作為靶點(diǎn)的新一代生物醫(yī)藥會(huì)為人類的健康帶來福音。