響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助酶法提取辣椒紅色素研究

韓世明，方玉梅，吳蓮蓮，陸康寧

(六盤(pán)水師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤(pán)水 553004)

辣椒紅色素是在成熟辣椒中提取的一種天然的紅色素[1]。辣椒紅色素不僅具有色價(jià)較高、著色力強(qiáng)、保色效果好[2]等優(yōu)點(diǎn)，還具有良好的抗輻射、抗腫瘤等功效[3]，因此，辣椒紅色素的使用較為普遍，不僅適用于海鮮、肉類(lèi)、飲料等食物，同時(shí)還可以使仿真食品的貨架期大大延長(zhǎng)。

從紅辣椒中提取辣椒紅色素的方法主要有油溶法[4-5]、有機(jī)溶劑法[6]、超聲波溶劑提取法[7-8]、微波輔助提取法[9]、酶提取法[10]、超臨界CO2流體萃取法等[11]。油溶法提取時(shí)，紅色素與油的分離難度較高，提取速率較低，同時(shí)產(chǎn)品的色價(jià)不高，現(xiàn)在已經(jīng)基本沒(méi)有廠商使用該種方法[12]。用有機(jī)溶劑提取后剩余的殘?jiān)欣苯芳t色素的含量較多，成品中的雜質(zhì)較多，花費(fèi)的成本較高，純化紅色素也較為昂貴，殘留物的可利用性低，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)較為困難[13]。超臨界CO2流體萃取法獲得的成品中色素種類(lèi)較多，操作相較于其他方法較為簡(jiǎn)單，而且成品較純，但由于儀器價(jià)格高昂、成本較高，小的生產(chǎn)廠商一般無(wú)法承擔(dān)，因此該方法使用較少。

由于細(xì)胞壁的阻攔，辣椒紅色素的溶出速率較低，用纖維素酶破壞植物細(xì)胞壁可以加快紅色素的溶出[14]；超聲波的機(jī)械作用也可以使內(nèi)溶物的溶出速度加快[15]。與傳統(tǒng)的油溶法、有機(jī)溶劑法相比，超聲輔酶提取法的提取率高、提取時(shí)間短、產(chǎn)品純度高、操作工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備維護(hù)和保養(yǎng)方便，是一種實(shí)現(xiàn)高效、節(jié)能、環(huán)保式提取的現(xiàn)代高新技術(shù)手段[16]。

本研究對(duì)超聲輔助酶法提取辣椒紅色素的工藝進(jìn)行優(yōu)化，在單因素實(shí)驗(yàn)(酶濃度、超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定最佳的提取工藝，為辣椒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供了參照。

1 材料與方法

1.1 材料

風(fēng)干鐵皮椒：購(gòu)于市場(chǎng)。

1.2 試劑

無(wú)水乙醇、丙酮：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶、果膠酶：南寧龐博生物工程有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；ATY-124電子天平 上海西艾愛(ài)電子有限公司；DFT-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；SB-800DT超聲波清洗機(jī) 浙江寧波新芝生物科技有限公司；SHB-3循環(huán)水式真空泵 鄭州杜甫儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 輔助酶的選擇

稱取1 g樣品，置于25 mL的65%乙醇中，分別加入4 mg纖維素酶、4 mg果膠酶、2 mg纖維素酶+2 mg果膠酶，在超聲功率350 W下超聲處理65 min，然后抽濾得濾液，將濾液定容至50 mL，在514 nm處[17]測(cè)定吸光度。

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以吸光度值為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究酶用量、超聲功率、乙醇濃度、超聲時(shí)間對(duì)辣椒紅色素提取效果的影響，實(shí)驗(yàn)水平分別選取加酶量1，2，3，4，5，6 mg；乙醇濃度45%、55%、65%、75%、85%、95%；超聲功率210，280，350，420，490，560 W；超聲時(shí)間45，55，65，75，85，95 min。對(duì)提取條件進(jìn)行初步優(yōu)化，確定較佳因素實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍，每個(gè)處理重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在辣椒紅色素提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇超聲功率，乙醇濃度、超聲時(shí)間、酶用量的4個(gè)單因素進(jìn)行四因素三水平的Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，然后用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以此得出提取辣椒紅色素的最優(yōu)條件。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface experiment

1.4.4 辣椒紅色素色價(jià)的計(jì)算

將在最優(yōu)條件下提取的辣椒紅色素的粗提物在60 ℃烘干至恒重，用丙酮溶解后并測(cè)定吸光度值，按照以下公式計(jì)算辣椒紅色素色價(jià)：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒紅色素提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 輔助酶的選擇

圖1 不同酶提取辣椒紅色素Fig.1 Extraction of red pigment from Capsicum annuum by different enzymes

由圖1可知，添加4 mg果膠酶的吸光度值和不加任何輔助酶辣椒紅色素的吸光度值相差不大，添加4 mg纖維素酶與添加2 mg纖維素酶+2 mg果膠酶的混合酶辣椒紅色素的吸光度值差值不大，在本次單因素實(shí)驗(yàn)中，果膠酶的作用相當(dāng)于沒(méi)有，所以，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中只添加纖維素酶。

2.1.2 纖維素酶用量對(duì)辣椒紅色素提取的影響

圖2 不同酶用量提取辣椒紅色素Fig.2 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different enzyme additive amount

由于細(xì)胞壁的阻攔，辣椒紅色素的溶出速率較低，用纖維素酶破壞植物細(xì)胞壁，改變了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高了辣椒紅色素向乙醇擴(kuò)散的速率，加快了紅色素的提取。由圖2可知，在控制其他條件不變的情況下，根據(jù)酶用量不同提取出的辣椒紅色素的吸光度值呈先上升后略微下降的趨勢(shì)。其原因是：加酶量低于4 mg時(shí)，隨著酶用量的增加，酶與酶的作用物接觸面積在不斷增加，辣椒紅色素的吸光度值也在增加；在酶用量超過(guò)4 mg時(shí)，吸光度值下降，有可能是因?yàn)榈孜餄舛蕊柡?，再繼續(xù)添加酶有可能抑制酶的作用。在纖維素酶用量為1～4 mg的范圍內(nèi)，辣椒紅色素的吸光度值不斷增大，當(dāng)纖維素酶用量超過(guò)4 mg時(shí)，其數(shù)值開(kāi)始降低，故選擇纖維素酶用量4 mg為本次實(shí)驗(yàn)的最佳用量。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)辣椒紅色素提取的影響

圖3 不同濃度的乙醇提取辣椒紅色素Fig.3 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different concentration of ethanol

由圖3可知，當(dāng)乙醇濃度在45%～75%時(shí)，辣椒紅色素的吸光度值隨著乙醇濃度的增加而增加，但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)75%時(shí)，辣椒紅色素的吸光度值隨著乙醇濃度的增加而略有降低。其原因可能是過(guò)高濃度的乙醇大大抑制了酶的作用，導(dǎo)致細(xì)胞被破壞的程度降低，減少了辣椒紅色素的滲出量，導(dǎo)致辣椒紅色素的吸光度值降低。由此可見(jiàn)，本次實(shí)驗(yàn)乙醇的最佳提取濃度為75%。

2.1.4 超聲功率對(duì)辣椒紅色素提取的影響

圖4 不同超聲功率提取辣椒紅色素Fig.4 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different ultrasonic power

由圖4可知，起初辣椒紅色素的吸光度值與超聲功率成正比，在功率為420 W時(shí)，辣椒紅色素的吸光度值達(dá)到峰值，之后辣椒紅色素的吸光度值與超聲功率成反比。在峰值之后，辣椒紅色素的吸光度值開(kāi)始下降，原因可能是辣椒紅色素的組成被超聲波的空化效應(yīng)破壞。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)辣椒紅色素提取的影響

圖5 不同超聲時(shí)間提取辣椒紅色素Fig.5 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different ultrasonic time

由圖5可知，起初辣椒紅色素的吸光度值與超聲時(shí)間成正比，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到75 min時(shí)，辣椒紅色素的吸光度值升到頂峰，之后辣椒紅色素的吸光度值與超聲時(shí)間成反比，辣椒紅色素的吸光度值開(kāi)始下降。辣椒紅色素在超聲波的空化效應(yīng)等作用下，可以加快其提取速率，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，辣椒紅色素的組成被破壞，使其變成其他物質(zhì)，這便使得辣椒紅色素的吸光度值不斷降低。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

結(jié)合單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲功率、乙醇濃度、超聲時(shí)間和酶用量等因素，以辣椒紅色素的吸光度值為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)四因素三水平的實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

續(xù) 表

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，以辣椒紅色素的吸光度值為指標(biāo)，利用軟件Design-Expert 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到回歸方程為：Y=1.12+0.0353A+0.0048B+0.0098C+0.0008D-0.0058AB+0.0023AC+0.0022AD-0.0060BC+0.0027BD+0.0022CD-0.1620A2-0.0801B2-0.0756C2-0.0665D2。

由表3可知，模型的P值<0.0001，表明回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)的P=0.0621>0.05，模型的失擬項(xiàng)不顯著，表明本次實(shí)驗(yàn)的模型合適，本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有意義。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)軟件得到的響應(yīng)面曲線圖及等高線圖見(jiàn)圖6～圖11，分析超聲功率、乙醇濃度、超聲時(shí)間、酶用量4個(gè)因素對(duì)辣椒紅色素提取的交互作用。

圖6 超聲功率和乙醇濃度對(duì)辣椒紅色素提取影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and ethanol concentration on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖6可知，等高線接近圓形，表明超聲功率和乙醇濃度的交互作用不強(qiáng)，超聲功率和乙醇濃度的影響不顯著。

圖7 超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)辣椒紅色素提取影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖7可知，等高線接近圓形，表明超聲功率和超聲時(shí)間的交互作用不強(qiáng)，超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)辣椒紅色素提取的影響不顯著。

圖8 超聲功率和酶用量對(duì)辣椒紅色素提取影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖8可知，等高線為橢圓形，表明超聲功率和酶用量的交互作用較強(qiáng)，超聲功率對(duì)辣椒紅色素提取的影響較顯著。

圖9 乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)辣椒紅色素提取影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour diagram of the effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖9可知，等高線為橢圓形，表明乙醇濃度和超聲時(shí)間的交互作用較強(qiáng)，超聲時(shí)間的影響較顯著。

圖10 乙醇濃度和酶用量對(duì)辣椒紅色素提取影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.10 Response surface and contour diagram of the effect of ethanol concentration and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖10可知，等高線為橢圓形，表明乙醇濃度和酶用量的交互作用較強(qiáng)，酶用量的影響較顯著。

圖11 超聲時(shí)間和酶用量對(duì)辣椒紅色素提取影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.11 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic time and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖11可知，等高線為橢圓形，表明超聲時(shí)間和酶用量的交互作用較強(qiáng)，超聲時(shí)間對(duì)辣椒紅色素提取的影響較為顯著。

2.2.3 響應(yīng)面因素水平優(yōu)化結(jié)果及模型驗(yàn)證

用響應(yīng)面分析回歸模型，辣椒紅色素的吸光度值預(yù)測(cè)最大值時(shí)各因素水平為超聲功率435.250 W、乙醇濃度75.470%、超聲時(shí)間76.303 min、酶用量4.018 mg，理論上吸光度值為1.125。

為驗(yàn)證響應(yīng)面法得到的結(jié)果的準(zhǔn)確性，將最佳提取條件更改為：超聲功率434 W、乙醇濃度75.5%、超聲時(shí)間76.3 min、酶用量4 mg，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得其吸光度值為1.116，可見(jiàn)實(shí)際值與理論值相差較小，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)所建模型與實(shí)際情況擬合良好，此次實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)精準(zhǔn)可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.3 辣椒色價(jià)的計(jì)算結(jié)果

測(cè)得的吸光度值為1.237，根據(jù)公式計(jì)算出辣椒紅色素的色價(jià)為103.08。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)超聲波輔助酶法提取辣椒紅色素的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，得到超聲波輔助酶法提取辣椒紅色素的最佳條件為超聲功率434 W、超聲時(shí)間76.3 min、乙醇濃度75.5%、酶用量4 mg，此條件下，提取出來(lái)的辣椒紅色素的吸光度最高。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)建立的回歸模型是有效可行的，可以用來(lái)預(yù)測(cè)設(shè)定實(shí)驗(yàn)因素條件下辣椒紅色素提取工藝參數(shù)的響應(yīng)值。該研究結(jié)果可為辣椒紅色素提取工藝的工業(yè)化應(yīng)用提供參數(shù)借鑒。