瑞香素藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)、生物活性的研究進(jìn)展

樊思越， 王文昊， 羅寧烽， 張?zhí)炫啵?王 珍， 高佩佩， 龍建綱

(西安交通大學(xué)，陜西 西安 710049)

瑞香素屬于苯并吡喃酮類化合物，又名7,8-二羥基香豆素、祖師麻甲素，是從中藥祖師麻中提取得到的一種生物活性單體，同時(shí)也是我國(guó)自主研發(fā)的天然藥物，臨床上具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效果，同時(shí)也廣泛用于治療血栓閉塞性脈管炎、冠心病心絞痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[1]，主要通過抗炎、抗氧化、代謝調(diào)節(jié)、自噬調(diào)節(jié)等分子通路發(fā)揮作用。本文就瑞香素近年在藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)、生物活性方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 理化性質(zhì)

瑞香素分子式為C9H6O4，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，室溫下呈灰白色粉末狀，無色無味，為脂溶性藥物，堿性條件可發(fā)生開環(huán)降解，中性或弱酸性條件下較穩(wěn)定。

圖1 瑞香素化學(xué)結(jié)構(gòu)

瑞香素因具有苯并吡喃酮的結(jié)構(gòu)而被歸為香豆素類化合物，其母核香豆素的結(jié)構(gòu)如圖2所示。由于環(huán)上不同位置常含不同取代基，除簡(jiǎn)單香豆素外，香豆素類化合物還包括呋喃香豆素、吡喃香豆素、其他香豆素，在自然界中分布范圍較廣，常以游離態(tài)或與糖類結(jié)合為苷的形式存在于瑞香科、豆科、傘形科等高等植物體內(nèi)。以往研究及臨床應(yīng)用顯示，香豆素類藥物具有抑菌、抑腫瘤、抗炎、抗氧化、抗水腫、增強(qiáng)免疫、保肝等生物活性[2-3]，其中瑞香素抗炎、抗氧化的生物活性尤為突出。

圖2 香豆素化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 藥動(dòng)學(xué)

2.1 吸收 曲淑巖等[4]通過大鼠尾靜脈給藥(80 mg/kg)發(fā)現(xiàn)，血藥濃度-時(shí)間曲線符合二室開放性模型，t1/2=0.043 h，t1/2=0.347 h；家兔經(jīng)皮給藥后，血藥濃度-時(shí)間曲線符合二室開放性模型，t1/2(ka)=0.462 h，t1/2=0.975 h，t1/2=4.926 h。在中性或酸性條件下瑞香素較為穩(wěn)定，不易受腸道酶影響，但在弱堿性條件下其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)可能發(fā)生開環(huán)降解。大鼠在體單向腸灌流模型進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，在瑞香素質(zhì)量濃度10～40 μg/mL范圍內(nèi),各小腸段的有效滲透系數(shù)Peff有上升趨勢(shì)，但隨藥物濃度升高無飽和現(xiàn)象，而空腸、結(jié)腸Peff有顯著性差異 (P<0.05)；瑞香素在小腸吸收較好, 而且無特殊的吸收窗[5]。瑞香素在大鼠腸道內(nèi)可能主要以被動(dòng)擴(kuò)散的方式被吸收，同時(shí)也可能存在多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein2, MRP2)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein, BCPR)的外排。

2.2 分布 以80 mg/kg劑量對(duì)大鼠進(jìn)行靜脈注射給藥，15 min后發(fā)現(xiàn)瑞香素體內(nèi)分布廣泛，在肝臟、腎臟中濃度最高，肺、脾、血漿、腦中次之，其他器官中也可見少量分布，1 h后不同程度降低，灌胃給藥2 h后的分布與靜脈給藥相似[4]。值得注意的是，瑞香素能穿過血腦屏障，這為中樞神經(jīng)疾病的防治提供了可能。

2.3 代謝 體外溫孵實(shí)驗(yàn)證明，全血、肝臟、腎臟都能程度不同地對(duì)瑞香素進(jìn)行代謝，在小鼠體內(nèi)代謝則主要在肝臟中進(jìn)行[4,6]。體外代謝特征分析顯示，大鼠肝臟中最占優(yōu)勢(shì)的代謝途徑為磺酸化反應(yīng)，其次為甲基化和葡糖醛酸化反應(yīng)，在大鼠肝勻漿上清液中瑞香素7、8位上的羥基易發(fā)生上述代謝反應(yīng)生成相應(yīng)代謝產(chǎn)物，該過程可能受尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-ducuronosyltranskrase, UGT)、兒茶酚轉(zhuǎn)甲基酶(catechol-O-methyltransferase, COMT)、磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase, ST)等催化[6]；在人類肝臟勻漿上清液中，上述3種代謝途徑仍為主要路徑，但其中瑞香素清除率最高的途徑為甲基化反應(yīng)，而非磺酸化反應(yīng)[7]。

2.4 排泄 在靜脈注射、灌胃給藥2種途徑中，瑞香素均主要通過腎臟排泄[4]。大鼠灌胃給藥后對(duì)其尿液進(jìn)行檢測(cè)，約2 h后可發(fā)現(xiàn)瑞香素分子的存在，然后其排泄量先增后降，至24～48 h尿液中僅有少量，最終尿液中無法再檢測(cè)到，其總排泄量不高于最初給藥量的6%，其原因可能是該成分轉(zhuǎn)化為其代謝產(chǎn)物[8]。由此說明，瑞香素在大鼠體內(nèi)消除迅速，24 h內(nèi)原型藥物可基本代謝完全。

3 毒理學(xué)

采用最大劑量法(100 mg/kg)對(duì)小鼠灌胃給予瑞香素，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察其皮膚、眼睛、黏膜、呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，結(jié)果連續(xù)14 d均未發(fā)生中毒跡象，表明該成分對(duì)小鼠的口服毒性最大劑量超過100 mg/kg，此質(zhì)量濃度約為人體有效劑量的175倍[9]。另對(duì)50只小鼠腹腔注射瑞香素，測(cè)得其LD50為429 mg/kg。

瑞香素溶液對(duì)家兔皮膚或粘膜沒有刺激作用，皮膚無紅斑、浮腫，全身無致敏現(xiàn)象，顯微鏡下也未發(fā)現(xiàn)明顯炎癥或組織損傷，口腔黏膜形態(tài)完好，無其他口腔黏膜刺激反應(yīng)。由此認(rèn)為，該成分無致敏性[9]。

在臨床應(yīng)用中，瑞香素也鮮見不良反應(yīng)發(fā)生。對(duì)35例應(yīng)用瑞香素麻醉患者進(jìn)行身體檢查，發(fā)現(xiàn)谷丙酶、麝香草酚濁度、尿素氮均在正常范圍內(nèi)，隨訪21例均未發(fā)生不良反應(yīng)或后遺癥。因此，該成分在臨床上短期使用是安全的。

4 藥理作用

瑞香素除了在心血管疾病方面的臨床應(yīng)用外，對(duì)脂肪肝、炎癥反應(yīng)、腦缺血再灌注、腦功能[10]等也具有一定的改善效應(yīng)，其主要作用機(jī)制包括擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)炎性因子、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、調(diào)節(jié)線粒體功能等。

4.1 擴(kuò)張血管 多年來的臨床應(yīng)用證實(shí)了瑞香素治療血栓閉塞性脈管炎、冠心病的可靠性，該成分能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，通過舒張主動(dòng)脈和外周動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)收縮壓、舒張壓降低，血管外周阻力減小[11]。用瑞香素處理實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)該成分可明顯加快血流速度，微血管管徑均明顯增大[12]。

大部分香豆素類化合物可通過內(nèi)皮依賴性及非內(nèi)皮依賴性方式舒張血管，其中又以非內(nèi)皮依賴性的機(jī)制為主。作為香豆素類化合物，瑞香素可能也同樣是以劑量依賴性的方式作用于血管平滑肌細(xì)胞，通過抑制其膜上鈣離子通道，包括電壓依賴的鈣離子通道(voltage-dependent calcium channels, VDCC)、受體操縱性鈣離子通道(receptor-operated calcium channels, ROCC)，達(dá)到阻止鈣離子跨膜進(jìn)入細(xì)胞的目的，并可能阻斷鈣離子從肌質(zhì)網(wǎng)中涌出而達(dá)到舒張血管的作用[13]。另外，開放鈣激活鉀離子通道和5-羥色胺受體的競(jìng)爭(zhēng)拮抗作用也有可能是香豆素類藥物發(fā)揮血管舒張作用的部分原因[14]。

4.2 免疫調(diào)節(jié) 瑞香素可在諸多模型中降低白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)等多種炎癥因子表達(dá)，涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(nuclear factorkappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)等信號(hào)通路的調(diào)控，從而起到減輕炎癥反應(yīng)的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者報(bào)道用瑞香素處理TNF-α誘導(dǎo)人永生角質(zhì)形成細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該成分能顯著減弱該細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、白細(xì)胞介素-8(interleukin 8, IL-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)等炎癥因子表達(dá)上調(diào)，表明它可有效減輕TNF-α誘導(dǎo)該模型產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，而該過程可能涉及到NF-κB信號(hào)途徑[15]。Zhang等[16]研究瑞香素對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用，發(fā)現(xiàn)該成分可抑制IL-1β誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞中IL-6、白細(xì)胞介素-12(interleukin 12, IL-12)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloprotein 3, MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein 9, MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloprotein 13, MMP-13)表達(dá)，并能刺激白細(xì)胞介素-10(interleukin 10, IL-10)產(chǎn)生，它對(duì)MMP的抑制作用部分受到磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidyl-inositol 3-kinase/serine-threonine kinase, PI3K/Akt)信號(hào)通路、MAPK和NF-κB信號(hào)通路抑制性調(diào)節(jié)。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，瑞香素對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠也具有炎癥抑制作用，可通過上調(diào)A20蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)NF-κB通路下調(diào)，提高動(dòng)物存活率，從而起到良好的抗炎效果。

Shen等[18]報(bào)道，瑞香素可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥小鼠的促炎因子產(chǎn)生，并能通過抑制脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)誘導(dǎo)激活的Janus激酶(janus kinase, JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子(signal transducer and activator of transcription, STAT)信號(hào)通路及活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生而表現(xiàn)出抗炎特性。Liu等[19]發(fā)現(xiàn)，瑞香素可降低大腦動(dòng)脈阻塞和再灌注模型小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6過表達(dá)并抗細(xì)胞凋亡，降低Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)表達(dá)、核因子κB抑制蛋白α(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha, IκB-α)降解及NF-κB的核轉(zhuǎn)位，顯示了該成分在模型中良好的神經(jīng)保護(hù)作用及抗炎效果，其潛在分子機(jī)制可能涉及對(duì)TLR4/NF-κB介導(dǎo)炎性信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制。

除了對(duì)炎性因子的調(diào)節(jié)外，瑞香素也可以通過其他方式改善實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ兔庖郀顟B(tài)。Wang等[20]報(bào)道，瑞香素能減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎臨床癥狀，顯著抑制Th1、Th17細(xì)胞反應(yīng)，抑制DCs活化、成熟、抗原呈遞能力；促進(jìn)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的T淋巴細(xì)胞增殖，并能提高腫瘤殺傷力，促進(jìn)大鼠免疫功能[21]。

4.3 抗氧化 瑞香素抗氧化效應(yīng)與丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)及多種氧化相關(guān)酶類如髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性相關(guān)。在LPS、D-半乳糖苷誘導(dǎo)的急性肝衰竭過程中，瑞香素可通過抑制MDA形成來降低MPO水平，改善急性肝衰竭導(dǎo)致的SOD、GSH活性下降，緩解氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損害[22]。劉志勇等[23]以瑞香素處理重癥急胰腺炎小鼠，發(fā)現(xiàn)MDA水平和MPO活性降低。在高葡萄糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞中，瑞香素預(yù)處理后能降低ROS、MDA水平，提高細(xì)胞中SOD活性，進(jìn)而抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[24]。

在氧化應(yīng)激情況下，瑞香素作用機(jī)制可能與NF-E2相關(guān)因子2(nuclear erythroid 2-related factor 2, Nrf2)-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)系統(tǒng)關(guān)系緊密。Lv等[25]研究瑞香素對(duì)砷誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞毒性的保護(hù)效果及其分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)該成分以劑量依賴性方式誘促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，降低Keap1蛋白表達(dá)，Nrf2與抗氧化元件結(jié)合，從而上調(diào)抗氧化酶表達(dá)；誘導(dǎo)AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)活化，c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)磷酸化，并能阻礙砷誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降和ROS產(chǎn)生，推測(cè)其對(duì)砷作用產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡可能與Nrf2依賴的抗氧化反應(yīng)的誘導(dǎo)以及抗凋亡因子(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)在人肺上皮細(xì)胞中的穩(wěn)定有關(guān)。Zhi等[26]發(fā)現(xiàn)，瑞香素能通過誘導(dǎo)Nrf2的核易位來誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase, HO-1)的表達(dá)和活性，減輕海馬神經(jīng)元缺血再灌注模型中的氧化應(yīng)激及細(xì)胞損傷。

4.4 調(diào)節(jié)糖脂代謝 Liu等[27]在油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，瑞香素干預(yù)后可降低固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein-1, SREBP-1)、馬鈴薯糖蛋白樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域蛋白(patatin-like phospholipase domain-containing protein 3，PNPLA3)的蛋白和mRNA表達(dá)，上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor-α,PPARα)基因、AMPK磷酸化水平，從而抑制脂質(zhì)在肝細(xì)胞中的積累；增強(qiáng)磷脂酰肌醇激酶PI3K蛋白表達(dá)，促進(jìn)Akt磷酸化，從而促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和利用。在糖尿病的研究中，PPARs一直被認(rèn)為是治療靶點(diǎn)，但已有靶向藥物具有肝毒性、體質(zhì)量增加等嚴(yán)重不良反應(yīng)，目前開發(fā)PPARs雙重激動(dòng)劑，旨在改善代謝同時(shí)能盡量減小副作用。有研究表明，瑞香素質(zhì)量濃度在40、80 μmol/L下可雙重激活PPAR-α/γ, 80 μmol/L下可使PPAR-α/β/γ表達(dá)得到激活[28-29]。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)瑞香素對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的大鼠胰島素瘤胰腺β細(xì)胞損傷具有抑制脂質(zhì)過氧化的效果，并可改善該細(xì)胞胰島素分泌障礙，顯示出瑞香素具有抵抗糖尿病的潛力[30]。由此表明，瑞香素在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面有重要臨床應(yīng)用前景。

4.5 自噬調(diào)節(jié) Lv等[22]構(gòu)建急性肝衰竭模型，發(fā)現(xiàn)由LPS及D-半乳糖苷誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭會(huì)導(dǎo)致肝臟自噬因子Beclin-1、Agt16、Agt12、Agt7、Agt5、Agt3蛋白表達(dá)下降，并會(huì)降低LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比率，而瑞香素干預(yù)則能明顯地抑制上述自噬因子表達(dá)的下調(diào)，從而起到保護(hù)肝臟的作用。Zhang等[31]報(bào)道，瑞香素可促進(jìn)金黃色葡萄球菌處理的巨噬細(xì)胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化和LC3顆粒的形成，同時(shí)瑞香素抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)及下游信號(hào)通路的激活，抑制轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)，從而觸發(fā)溶酶體基因的表達(dá)。

除此之外，瑞香素也可在自噬激活模型中發(fā)揮抑制作用。Deng等[32]以TNF-α誘導(dǎo)膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的成纖維樣滑膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)瑞香素可減弱TNF-α誘導(dǎo)所致Atg5、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，并通過抑制Akt和mTOR活化、下調(diào)PKB信號(hào)通路激活，從而抑制關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞自噬，減少細(xì)胞中受TNF-α刺激增加自噬體。

4.6 線粒體相關(guān)調(diào)節(jié) 瑞香素通過促進(jìn)JNK、ERK的磷酸化激活來使得Nrf2與Keap1之間實(shí)現(xiàn)有效分離，然后Nrf2蛋白進(jìn)一步啟動(dòng)下游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)包含谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit, GCLM)、HO-1在內(nèi)的一系列抗氧化酶表達(dá)，有效改善線粒體功能障礙，表現(xiàn)為抑制ROS對(duì)線粒體的氧化損害，從而抑制炎癥應(yīng)答及細(xì)胞凋亡[33]。由此表明，瑞香素可能有助于線粒體損傷相關(guān)疾病的防治。

5 展望

目前，瑞香素已作為臨床治療脈管炎、冠心病等疾病的藥物，可通過免疫調(diào)節(jié)、糖脂代謝調(diào)節(jié)、自噬調(diào)節(jié)等多種分子通路發(fā)揮生物學(xué)活性。進(jìn)一步探索該成分作用機(jī)制對(duì)相關(guān)疾病防治具有重要意義。例如，阿爾茲海默癥不僅是中樞神經(jīng)病理變化系統(tǒng)疾病，其早期還會(huì)伴隨中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥、氧化應(yīng)激，表現(xiàn)出線粒體功能障礙、代謝紊亂等病理癥狀，而瑞香素的多重藥理效應(yīng)和分子通路有望為該疾病防治提供新的研究思路及解決方案。