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      PTEN/mTOR通路在高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡中的作用機(jī)制探討

      2022-02-25 08:03:44彭青溫彥靜李茜李曼常美英
      天津醫(yī)藥 2022年2期
      關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層高糖絨毛

      彭青,溫彥靜,李茜,李曼,常美英

      糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝綜合征,作為妊娠期常見并發(fā)癥,其臨床發(fā)病率較高,占妊娠婦女的2%~8%,且在我國呈逐年上升趨勢,如果未得到及時診斷及治療則發(fā)生流產(chǎn)、胎兒畸形、并發(fā)子癇前期等不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險明顯增加[1]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力受損及螺旋動脈血管重構(gòu)異常是子癇前期發(fā)展的基本特征[2]。研究顯示,高糖可誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是一種抑癌基因,能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞等凋亡,抑制細(xì)胞侵襲[4]。賈真等[5]研究顯示,PTEN在子癇前期胎盤中過表達(dá),其過表達(dá)可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和血管生成能力。邱瑞瑩等[6]研究發(fā)現(xiàn),妊娠期糖代謝異常是子癇前期發(fā)病的危險因素,顯著增加子癇前期發(fā)生率。目前有關(guān)PTEN在高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在探討PTEN在高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡中的作用機(jī)制,以期為深入研究人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常相關(guān)的病理性妊娠提供參考依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1.1 細(xì)胞 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo(批號MCM-0599)購自寧波明舟生物科技有限公司。

      1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基(批號NBG1236)購自美國Hyclone公司;胎牛血清(批號36G5782)購自美國Gibco公司;青霉素(批號FH673J)、二甲基亞砜(批號N6582J)、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(批號SI70019)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,批號1120-02-1)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑(GDC-0349,批號T6510)均購自美國Sigma公司;PTEN-siRNA的陰性對照(批號SJ6009R)、PTEN-siRNA(批號SJ5002R)購自上海恒斐生物科技有限公司;胰蛋白酶(批號BD735N)、蛋白提取試劑盒(批號ME861R)、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(批號HUDY03)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)抗體(批號XIN-56)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)抗體(批號XMN-68)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、PTEN抗體(批號BYCM-10005059)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抗體(批號PL0402037)、磷酸化PI3K(p-PI3K)抗體(批號JCSW2521)、蛋白激酶B(AKT)抗體(批號FNab00273)、磷酸化AKT(p-AKT)抗體(批號F48643)、mTOR抗體(批號ATA33361)、磷酸化mTOR(p-mTOR)抗體(批號IC194464)、GAPDH抗體(批號AL00167)、山羊抗兔二抗(批號674GN6)均購自美國Proteintech公司。CO2培養(yǎng)箱(型號NHD DYE1738)購自日本sanyo公司;Elx800酶標(biāo)儀(型號HSG9832)購自美國Thermo公司;流式細(xì)胞儀(型號BeamCyte)購自常州必達(dá)科生物科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)(型號BioDoc-It220)購自美國UVP公司。

      1.2 方法

      1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,放置于37℃飽和濕度、5%CO2及20%O2培養(yǎng)箱中,穩(wěn)定傳代后收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

      1.2.2 細(xì)胞分組 取1.2.1對數(shù)生長期的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo,重懸后接種于6孔板(1×106個/孔),待細(xì)胞融合度至80%時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用含10%滅活胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后分組。(1)空白對照組:僅加無血清培養(yǎng)基。(2)高糖組:加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液[7]處理48 h。(3)NC組(陰性對照組):加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h后,加入5μL Lipofectamine 3000和PTEN-siRNA的陰性對照。(4)PTEN-siRNA組(抑制PTEN表達(dá)組):加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h后,轉(zhuǎn)染PTEN-siRNA序列。(5)GDC-0349組(mTOR通路抑制劑組):加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h,轉(zhuǎn)染PTEN-siRNA序列后,加入50μmol/L GDC-0349溶液[8]。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作,轉(zhuǎn)染后用無血清新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

      1.2.3 MTT法檢測HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖能力 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo,經(jīng)胰酶消化后接種至96孔板(5×104個/孔)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,向各孔加入MTT(5 g/L)20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,再分別加入150μL二甲基亞砜振蕩15 min,使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀中490 nm處測定各孔細(xì)胞光密度(OD),每組設(shè)置6個復(fù)孔,取平均值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白對照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/空白對照組OD×100%。

      1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo,PBS溶液洗滌2次,棄上清,并調(diào)節(jié)濃度至1×106個/mL的細(xì)胞懸液,取100μL細(xì)胞懸液加入5μL的AnnexinV/PITC及10μL質(zhì)量濃度為20 mg/L的PI混勻,室溫避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。每組重復(fù)6次。

      1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白及PTEN/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo,每組重復(fù)6次,PBS洗滌2次,冰上加裂解液,裂解30 min,離心取上清,Lowry法進(jìn)行蛋白定量。取50μg蛋白樣品進(jìn)行電泳分離,電泳結(jié)束后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(95 mA電流)3 h。脫脂牛奶(5%)封閉3 h,加入cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、GAPDH抗體作為一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,次日加入山羊抗兔二抗(1∶5 000)及TBST,室溫孵育2 h,TBST洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光法顯色,采用Quantity One凝膠成像系統(tǒng)抓拍圖像并檢測各條帶灰度值,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值比值作為蛋白相對表達(dá)量。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖及凋亡情況比較 與空白對照組比較,高糖組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高(P<0.05);與高糖組、NC組比較,PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均顯著降低(P<0.05);與PTENsiRNA組比較,GDC-0349組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖1、表1。

      2.2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組比較,高糖組HTR-8/SVneo細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與高糖組、NC組比較,PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與PTEN-siRNA組比較,GDC-0349組HTR-8/SVneo細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見圖2、表2。

      Fig.1 Flow cytometry of HTR-8/SVneo cell apoptosis in each group圖1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡流式圖

      Tab.1 Comparison of the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HTR-8/SVneo cells between the five groups表1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率的比較(n=6,%,±s)

      Tab.1 Comparison of the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HTR-8/SVneo cells between the five groups表1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率的比較(n=6,%,±s)

      **P<0.01;a與空白對照組比較,b與高糖組比較,c與NC組比較,d與PTEN-siRNA組比較,P<0.05;表2、3同。

      組別空白對照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F細(xì)胞增殖抑制率0 29.32±5.82a 29.36±5.85a 12.56±2.92abc 21.53±3.58abcd 17.120**凋亡率8.51±1.59 30.87±4.93a 30.00±4.95a 15.33±3.05abc 22.82±4.37abcd 34.671**

      2.3 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN/mTOR通路蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組比較,高糖組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著降低(P<0.05);與高糖組、NC組比較,PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著升高(P<0.05);與PTEN-siRNA組比較,GDC-0349組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著降低(P<0.05),見圖3、表3。

      Fig.2 Western blot detection of HTR-8/SVneo cell apoptosis-related proteins in each group圖2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白印跡圖

      Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in HTR-8/SVneo cells between the five groups表2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較(n=6,±s)

      Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in HTR-8/SVneo cells between the five groups表2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較(n=6,±s)

      組別空白對照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F Bcl-2 1.17±0.18 0.36±0.05a 0.35±0.04a 0.87±0.09abc 0.55±0.06abcd 78.174**Bax 0.19±0.04 1.25±0.18a 1.26±0.19a 0.63±0.13abc 0.97±0.15abcd 56.575**cleaved caspase-3 0.23±0.04 1.18±0.18a 1.19±0.19a 0.61±0.11abc 0.87±0.13abcd 50.034**

      Fig.3 Western blot detection of PTEN/mTOR pathway-related proteins in HTR-8/SVneo cells圖3 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN/mTOR通路蛋白印跡圖

      Tab.3 Comparison of PTEN/mTOR pathway protein expression levels between five groups of HTR-8/SVneo cells表3各組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN/mTOR通路蛋白表達(dá)水平比較 (n=6,±s)

      Tab.3 Comparison of PTEN/mTOR pathway protein expression levels between five groups of HTR-8/SVneo cells表3各組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN/mTOR通路蛋白表達(dá)水平比較 (n=6,±s)

      組別空白對照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F PTEN 0.20±0.03 1.07±0.16a 1.08±0.16a 0.70±0.10abc 0.69±0.09abc 55.543**p-PI3K/PI3K 1.06±0.16 0.25±0.03a 0.26±0.04a 0.87±0.13abc 0.52±0.09abcd 74.672**p-AKT/AKT 1.13±0.17 0.32±0.05a 0.33±0.05a 0.90±0.14abc 0.60±0.09abcd 61.671**p-mTOR/mTORimages/BZ_16_377_2680_379_2682.png1.26±0.18 0.27±0.04a 0.28±0.05a 0.97±0.15abc 0.59±0.09abcd 84.559**

      3 討論

      3.1 高糖抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖 研究顯示,妊娠合并糖尿病患者胎兒生長受限、胎兒畸形及先兆子癇等發(fā)生率高達(dá)6%~10%[9]。人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞來源于胚胎外胚層,具有類似腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤等生物學(xué)特性,能夠侵入母體蛻膜組織,為胚胎的發(fā)育提供充足的氧氣與營養(yǎng)[10]。目前有關(guān)高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖抑制的機(jī)制尚未明晰。本研究通過采用含50 mmol/L葡萄糖RPMI-1640培養(yǎng)基模擬高糖環(huán)境,觀察高糖對HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,高糖可抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖。

      3.2 高糖促進(jìn)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞過度凋亡、細(xì)胞浸潤能力減弱是子癇前期、胎兒畸形等發(fā)生的原因之一[11]。韓云等[12]研究發(fā)現(xiàn),妊娠糖尿病合并胎兒宮內(nèi)生長受限可能與人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞過度凋亡關(guān)系密切。Bcl-2是一種原癌基因,能抑制細(xì)胞凋亡[13]。Bax是人體最主要的促凋亡基因之一,當(dāng)受到誘導(dǎo)凋亡刺激時,兩者結(jié)合在線粒體膜上形成異二聚體,使線粒體膜通透性增加[14]。caspase-3是凋亡途徑的關(guān)鍵因素[15]。本研究結(jié)果顯示,與空白對照組相比,高糖組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡率升高,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高,且Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,與韓云等[12]研究結(jié)果一致,提示高糖可誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡。

      3.3 高糖通過PTEN/mTOR通路影響人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和凋亡 PTEN是一種雙重脂質(zhì)磷酸酶,是一種抑癌因子。方曉珊等[16]研究顯示,子癇前期胎盤中PTEN高表達(dá)能夠加重母體內(nèi)皮損傷以及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞損傷。且有研究證實(shí),PTEN負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路[17]。PI3K是PI3K/AKT/mTOR信號通路的起始因子,其活化產(chǎn)生第二信使膜磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3),PIP3進(jìn)一步磷酸化AKT蛋白的Thr308位點(diǎn),促使AKT活化,而活化的AKT磷酸化并激活其下游靶蛋白mTOR,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長,抑制細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示,下調(diào)PTEN表達(dá)后HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率,Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低,且Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示抑制PTEN表達(dá)可以促進(jìn)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖,抑制其凋亡,可能與促進(jìn)PI3K/AKT/mTOR信號通路活化有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),加入mTOR通路抑制劑可在一定程度上逆轉(zhuǎn)抑制PTEN表達(dá)對HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖、凋亡的影響,進(jìn)一步提示下調(diào)PTEN表達(dá)可能通過激活PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮促HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的作用。

      綜上所述,高糖可誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡,可能與上調(diào)PTEN表達(dá)、抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活化有關(guān),可為人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常相關(guān)的病理妊娠提供一定參考。本研究尚存在一定不足:首先,本研究未通過上、下游阻斷和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTEN調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路對表型變化的影響;其次,僅測定了mTOR總蛋白的表達(dá)變化,未單獨(dú)檢測mTOR1和mTOR2的蛋白水平;另外,未能明確PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路在高糖誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡中的具體作用機(jī)制。后期仍需進(jìn)一步研究。

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