Ghrelin 對IBDV感染雛雞法氏囊T 淋巴細(xì)胞浸潤的影響

郭子強(qiáng),崔夢幻,帥文娜,郭子凱,王秋霞,余燕

（河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

雞傳染性法氏嚢病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）是雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease,IBD）的病原,該病是雛雞的一種急性、高度接觸性傳染病,于1957 年首次發(fā)現(xiàn)于美國特拉華州甘布羅鎮(zhèn)的肉雞群中,現(xiàn)已遍及全世界養(yǎng)禽業(yè).IBDV 的主要靶器官是雞特有的中樞免疫器官——法氏囊,當(dāng)雛雞IBDV 感染時(shí),病毒在法氏囊B 淋巴細(xì)胞中復(fù)制,引起大量的B 淋巴細(xì)胞壞死、凋亡,產(chǎn)生免疫抑制,同時(shí)IBDV 還會(huì)造成多器官損傷,進(jìn)而使雞發(fā)病死亡.該病毒極其穩(wěn)定,在環(huán)境中難以徹底清除,對養(yǎng)雞業(yè)的危害除直接導(dǎo)致雛雞死亡外,更重要的是感染該病毒的雛雞能引起嚴(yán)重的免疫抑制,使雞群對其他疾病如肝炎、球蟲病、馬立克、傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、沙門氏菌病和大腸桿菌病等易感性增加[1-7],對其他疫苗接種的免疫應(yīng)答能力降低.我國作為家禽飼養(yǎng)總量位居世界第一的大國,自1979 年首次于廣州出現(xiàn)此病以來,至今仍未全面得以控制,給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失.

IBDV 粒子是非囊膜、二十面體、雙股RNA 病毒,屬于雙RNA 病毒科,禽雙RNA 病毒屬.基因組分為A、B 兩個(gè)節(jié)段,A 節(jié)段編碼VP2、VP3、VP4、VP5 四種蛋白；B 節(jié)段編碼VP1 蛋白.雖然IBDV 的靶細(xì)胞是B 淋巴細(xì)胞,但并不是唯一的靶細(xì)胞,可能還有其他細(xì)胞也能被IBDV 感染.IBDV 通過口、鼻和眼等途徑感染再被巨噬細(xì)胞吞噬,巨噬細(xì)胞隨血液將IBDV 運(yùn)輸?shù)椒ㄊ夏液推渌車M織[8].在IBDV 感染的急性階段,病毒在法氏囊中的復(fù)制會(huì)引起大量的T 細(xì)胞浸潤[9],盡管法氏囊中的T 細(xì)胞在體外受到IBDV 刺激后能夠啟動(dòng)和增殖, 但已有充分的證據(jù)表明T 淋巴細(xì)胞并不是IBDV 的靶細(xì)胞,IBDV 不能在T 細(xì)胞內(nèi)增殖[10].然而,浸潤的T 細(xì)胞卻能在法氏囊病毒感染早期（5 dpi 以前）抑制病毒增殖,但由于法氏囊受T淋巴細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性的影響而促進(jìn)了法氏囊的損傷和延遲組織修復(fù)[9].

Ghrelin 是Kojima 于1999 年從大鼠胃組織中分離提取的具有28 個(gè)氨基酸殘基的腦腸肽,是生長激素促分泌素受體的內(nèi)源性配基[11],也是具有多種生物學(xué)功能的小肽,在人和哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中具有促進(jìn)T、B 淋巴細(xì)胞增殖[12-13]、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)和免疫細(xì)胞的功能[14-15]、抗炎及保護(hù)受損器官等作用[16-17].雞的Ghrelin 由26 個(gè)氨基酸組成,與人和大鼠的Ghrelin 具有較高的同源性[18],然而雞Ghrelin 在其免疫作用方面的研究報(bào)道較少.近年來本研究團(tuán)隊(duì)和其他研究者均發(fā)現(xiàn)家禽Ghrelin 在禽類免疫器官中廣泛分布[19-23],當(dāng)雛雞IBDV 感染時(shí),血漿中的Ghrelin 也異常升高[24],外源性添加Ghrelin 能降低IBDV感染雛雞法氏囊炎性因子的表達(dá),縮短法氏囊修復(fù)的進(jìn)程[25],然而,Ghrelin 對法氏囊內(nèi)T 細(xì)胞浸潤的影響尚未見報(bào)道.本試驗(yàn)經(jīng)過石蠟切片、HE 染色、免疫組化方法探討了Ghrelin 對IBDV 感染雛雞法氏囊指數(shù)、法氏嚢內(nèi)T 淋巴細(xì)胞浸潤和法氏嚢濾泡大小的影響,以期為Ghrelin 在雞免疫系統(tǒng)中的功能提供基礎(chǔ)資料.

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物處理及取材

將80 只1 d 齡SPF 雛雞隨機(jī)分為四組,每組20 只,其中一組為對照組（C 組）.在飼養(yǎng)19 d（D19）時(shí),其余三組分別通過點(diǎn)眼（50 μL）、滴鼻（50 μL）和肛門吸收（100 μL）接種實(shí)驗(yàn)室保存的IBDV（編號：19951128）,所接種病毒的劑量為106.23EID50/0.1 mL.其中兩組在雛雞接種IBDV 前一天、接種當(dāng)天和接種后兩天,每100 g 雛雞分別腹腔注射0.5 nmol（LG 組）和1.0 nmol 的Ghrelin（HG 組）,剩下一組為I 組.在IBDV 感染后的第2 天（2 dpi）、第3 天（3 dpi）、第4 天（4 dpi）,每天從各組分別隨機(jī)挑選6 只雛雞,稱質(zhì)量后腹腔注射戊巴比妥鈉（1μg/g）麻醉,采用頸椎脫臼法處死,取法氏囊,生理鹽水洗去血污后稱質(zhì)量,固定在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛中,HE 染色和免疫組織化學(xué)染色備用.

1.2 石蠟切片、HE 染色和免疫組織化學(xué)染色

將固定組織制作成石蠟切片,常規(guī)HE 染色.免疫組織化學(xué)染色按如下步驟：脫蠟復(fù)水后經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)為的3%H2O2- 甲醇封閉、濃度為0.1 mol/L 檸檬酸鈉修復(fù)、體積分?jǐn)?shù)為5%的山羊血清封閉,然后鼠源CD3+一抗（體積比為1:200）4℃孵育過夜,HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠I gG 室溫孵育2 h,DAB 顯色,鏡檢,觀察.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

IPP（6.0）統(tǒng)計(jì)法氏嚢濾泡的大小和單位面積內(nèi)CD3+陽性細(xì)胞的平均光密度值,數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.所有數(shù)據(jù)采用SAS 軟件進(jìn)行多重比較,P≤0.05 為差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 Ghrelin 對IBDV 感染雛雞法氏囊指數(shù)的影響

法氏囊指數(shù)是法氏囊發(fā)育和功能的重要指標(biāo)結(jié)果如圖1 所示.

圖1 Ghrelin 對雛雞法氏囊指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Ghrelin on Bursa of Fabricius index in chicks

由圖1 可知,雛雞IBDV 感染后法氏嚢指數(shù)普遍下調(diào).2dpi 時(shí),I 組法氏囊指數(shù)下降,為2.28±0.46,顯著低于對照組（P <0.05）,LG 和HG 組法氏囊指數(shù)與對照組相比差異不顯著（P <0.05）;3 dpi 時(shí),不同處理組之間法氏囊指數(shù)沒有顯著差異（P<0.05）;到了4 dpi 時(shí),C 組法氏囊指數(shù)隨著發(fā)育顯著提高,然而I 組、LG組和HG 組法氏囊指數(shù)仍然下降,顯著低于C 組（P<0.05）,而感染組和添加Ghrelin 組之間法氏囊指數(shù)差異不顯著（P <0.05）.可見,雛雞IBDV 感染時(shí)添加Ghrelin 對IBDV 感染雛雞法氏嚢指數(shù)影響不顯著.

2.2 Ghrelin 對IBDV 感染雛雞法氏囊內(nèi)T 淋巴細(xì)胞浸潤的影響

不同處理組的法氏囊組織內(nèi)T 淋巴細(xì)胞浸潤情況如圖2 所示,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3 所示.整個(gè)試驗(yàn)期間,三個(gè)處理組法氏囊中T 淋巴細(xì)胞都不同程度的增加.2 dpi 時(shí),HG 組法氏囊T 淋巴細(xì)胞的平均光密度值顯著高于I 組與LG 組（P<0.05）,但I(xiàn) 組和LG 組之間差異并不顯著（P >0.05）；3 dpi 時(shí),HG、LG 和I 組的T 細(xì)胞的平均光密度值均低于2 dpi,但HG 組仍然顯著高于LG 組和I 組（P <0.05）,LG 組顯著高于I組（P> 0.05）；4 dpi 時(shí),HG、LG 和I 組浸潤性T 淋巴數(shù)量迅速下降,而且三者之間的差異不顯著（P>0.05）.因此,Ghrelin 在雛雞IBDV 感染早期能促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的浸潤.

圖2 不同處理組雛雞法氏囊組織內(nèi)T 淋巴細(xì)胞的浸潤Fig.2 Infiltration of T lymphocytes in bursa of Fabry-Farsi of chicks in different treatment groups

圖3 不同處理組雛雞法氏囊組織內(nèi)浸潤性T 淋巴細(xì)胞的平均光密度值Fig.3 Average optical density of infiltrating T lymphocytes in bursa of Fabricius of chicks in different treatment groups

2.3 Ghrelin 對IBDV 感染雛雞法氏囊濾泡大小的影響

研究發(fā)現(xiàn)法氏囊濾泡大小與機(jī)體免疫活性密切相關(guān)[26],為此,通過HE 染色對不同處理組法氏囊濾泡進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)并進(jìn)行了差異顯著性分析,分析結(jié)果如圖4 和圖5 所示.結(jié)果表明：2 dpi 時(shí),I 組法氏囊濾泡面積為38705.6±1466.7 μm2,與C 組相比顯著下降（P<0.05）,LG 組和HG 組法氏囊濾泡面積分別為45198.6±1305.3 μm2和42935.0±1909.7 μm2,顯著高于I 組雛雞法氏嚢濾泡（P<0.05）；3 dpi 時(shí),C 組法氏囊濾泡面積為61628.6±1330.6 μm2,顯著高于其他三個(gè)處理組（P < 0.05）,但HG組法氏囊濾泡面積顯著高于I 組（P <0.05）,而LG 組與I 組差異不顯著（P>0.05）;4 dpi 時(shí),I 組法氏囊濾泡面積與其他三組相比仍然最小,為21440.7±1700.3 μm2,但LG 和HG 法氏囊濾泡面積顯著低于C 組（P<0.05）.可見,Ghrelin 添加能減輕雛雞IBDV 感染導(dǎo)致的法氏嚢濾泡的損傷.

圖4 不同處理組雛雞法氏囊組織結(jié)構(gòu)圖示濾泡大小Fig.4 Follicular size of bursa of Fabricius of chicks in different treatment groups

圖5 不同處理組雛雞法氏囊濾泡大小比較Fig.5 Comparison of the size of Fabricius of chicks in different treatment groups

3 結(jié)論與討論

炎性細(xì)胞浸潤是指組織細(xì)胞間質(zhì)中出現(xiàn)炎性細(xì)胞如T 淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的積聚現(xiàn)象,一般是宿主免疫反應(yīng)的表現(xiàn)[27].本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),三個(gè)處理組雛雞IBDV 感染后,大量的T 細(xì)胞浸潤到法氏嚢組織,其中2 dpi 時(shí)浸潤的T 細(xì)胞數(shù)量最多,3 dpi 次之,4 dpi 全面減少.不同處理組之間比較結(jié)果顯示,HG 組雛雞在2 dpi 和3 dpi 時(shí)法氏囊內(nèi)T 淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著高于I 組和LG 組,LG 組雛雞在3 dpi 時(shí)法氏囊內(nèi)T 淋巴細(xì)胞數(shù)量也顯著高于I 組,在4 dpi 時(shí),三個(gè)處理組雛雞法氏囊內(nèi)T 淋巴細(xì)胞數(shù)量均迅速下降,且三者之間無顯著差異.Rautenschlein 等[9]的研究認(rèn)為雛雞IBDV 感染時(shí)法氏囊內(nèi)浸潤的T 淋巴細(xì)胞在感染早期有利于病毒的清除,但由于T 細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性的影響,浸潤的T細(xì)胞在IBDV 感染晚期則具有損傷組織和延遲法氏囊修復(fù)的作用.本研究結(jié)果顯示添加Ghrelin 組在IBDV感染的早期能趨化更多的T 細(xì)胞浸潤,說明免疫反應(yīng)強(qiáng)烈,這有利于IBDV 病毒的清除.Ghrelin 的半衰期為1 d,在雛雞感染的3 dpi 時(shí),Ghrelin 不再添加,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4 dpi 時(shí),Ghrelin 添加組和IBDV 感染組一樣,T淋巴細(xì)胞的數(shù)量迅速下降,這對減少法氏囊損傷更有利,也利于法氏囊組織的修復(fù),因而合適的Ghrelin添加時(shí)間對法氏嚢組織的修復(fù)至關(guān)重要.

Ghrelin 是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)由外周器官分泌的肽激素,對哺乳動(dòng)物具有促進(jìn)攝食、調(diào)節(jié)能量代謝平衡、促進(jìn)生長激素分泌與細(xì)胞增殖、參與脂類代謝和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能[28].雞的Ghrelin和哺乳動(dòng)物一樣也能夠促進(jìn)生長激素的分泌,但在攝食和脂肪代謝方面與哺乳動(dòng)物截然不同[29-30],尤其對Ghrelin 在雛雞病原感染中的功能研究報(bào)道較少.本試驗(yàn)中Ghrelin 促進(jìn)IBDV 感染雛雞法氏嚢T 淋巴細(xì)胞浸潤,這與前人在大鼠胰腺炎疾病模型上研究的Ghrelin 能夠抑制炎性細(xì)胞的浸潤[31]并不一致,是否與Ghrelin 在雞體內(nèi)的功能與哺乳動(dòng)物不同有關(guān),還是與不同的病原有關(guān)需進(jìn)一步研究.

IBDV 主要的靶細(xì)胞為法氏囊內(nèi)IgM B 淋巴細(xì)胞,病毒在其內(nèi)復(fù)制造成大量的IgM B 淋巴細(xì)胞壞死、凋亡,產(chǎn)生抗體的能力下降[6,32].無論是法氏囊中凋亡的B 淋巴細(xì)胞還是浸潤的T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子均能引起法氏囊嚴(yán)重?fù)p傷及萎縮,說明IBDV 引起的法氏囊損傷和免疫抑制是密切相關(guān)的.然而,研究表明IBDV 造成的免疫抑制是可以減輕或逆轉(zhuǎn)的,如通過食物添加精氨酸、共軛亞油酸及外源性注射B 細(xì)胞活化因子等調(diào)節(jié)和活化T、B 淋巴細(xì)胞,進(jìn)而改善IBDV 誘導(dǎo)的免疫抑制[33-35].研究還表明免疫抑制減輕或逆轉(zhuǎn)的程度與法氏囊濾泡損傷和修復(fù)程度有關(guān),如Sharma 等[9]發(fā)現(xiàn)IBDV 感染后12-17 周接種破傷風(fēng)類毒素產(chǎn)生的抗體滴度和法氏囊形態(tài)學(xué)恢復(fù)密切相關(guān)；Aihara 等[26]研究雛雞法氏囊形態(tài)和免疫活性時(shí)發(fā)現(xiàn),感染雛雞法氏囊損傷越小,保留的原始濾泡越多,感染雞的免疫活性越強(qiáng).本研究發(fā)現(xiàn),Ghrelin 添加組（LG 和HG 組）雛雞法氏囊濾泡的面積在整個(gè)試驗(yàn)期間均大于IBDV 感染組（I 組）,表明雛雞IBDV 感染時(shí)添加Ghrelin 能減輕法氏嚢濾泡損傷,有助于減輕雛雞IBDV 感染時(shí)導(dǎo)致的免疫抑制,提高其免疫活性.

因此,本研究通過在雛雞IBDV 感染前后適時(shí)添加Ghrelin 能夠瞬時(shí)趨化T 淋巴細(xì)胞的浸潤,適時(shí)終止添加還能減輕法氏囊濾泡的損傷,這有利于原始濾泡的維持、提高雛雞的免疫活性.