UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS整合網(wǎng)絡藥理學探討樹舌靈芝有效成分及其防治新型冠狀病毒肺炎的可行性

劉 坤，殷九一，程 華，李會宣，李 娜，郭 彤，李 依，王俊麗，王軍朋

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院；2.河北經(jīng)貿(mào)大學數(shù)學與統(tǒng)計學院，河北省 石家莊 050061；3.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081；4.中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京 100081；5.河南大學淮河醫(yī)院轉化醫(yī)學中心和感染免疫研究所，河南 開封 475000)

新型冠狀病毒肺炎-2019(Corona Virus Disease-2019，COVID-19)是人體感染新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)而引起的一種急性呼吸道傳染病[1]。截至2021年1月21日24時，全國累計報告確診病例88 804例，79個國家確診病例超過10萬例，成為目前影響最大的流行性疾病[2]。大量研究已證實，血管緊張素轉化酶Ⅱ(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)、非結構蛋白-15核糖核酸內(nèi)切酶(nonstructural protein-15 endoribonuclease，NSP15)、刺突蛋白受體結合域(the receptor-binding domain of spike protein，RBD of S protein)和主蛋白酶(main protease，Mpro/3CLpro)可以作為防止SARS-CoV-2感染的理想的藥物作用靶點[3]。

樹舌靈芝(Ganodermaapplanatum)有調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，抗病毒抗炎和抗菌等藥理活性[4]。其菌中的部分化合物具有抗病毒、抗纖維化和抗炎等生物活性，如：樹舌靈芝的Applanatumin A具有抗纖維化作用[5]；其中的核酸可以減少雞胚成纖維細胞組織培養(yǎng)中牛痘病毒斑塊的數(shù)量[6]；其多糖具有抗SARS病毒的活性[7]。鑒于COVID-19的主要癥狀(咳嗽、呼吸困難、胸痛等)[8]、病因病機和樹舌靈芝的傳統(tǒng)功效，推測樹舌靈芝在COVID-19的防治中發(fā)揮積極作用。

為了從現(xiàn)代科學角度充分分析樹舌靈芝在COVID-19防治方面的物質(zhì)基礎及其作用機制，本課題組擬通過UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS系統(tǒng)鑒定其中的化學成分，運用網(wǎng)絡藥理學技術研究樹舌靈芝化學成分在防治COVID-19過程中的功效及作用機制，通過分子對接技術進行有效成分與ACE2和3種SARS-CoV-2蛋白(NSP15，RBD of S protein，Mpro/3CLpro)的虛擬對接，預測樹舌靈芝中化學成分抗SARS-CoV-2的活性，為樹舌靈芝防治COVID-19的研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料樹舌靈芝(Ganodermaapplanatum)采自東北阿爾山，經(jīng)河北經(jīng)貿(mào)大學張香美教授鑒定，標本(ZYMZDX121740)保存于中央民族大學生命科學與環(huán)境學院。樹舌靈芝提取物為課題組提前制備。乙腈和甲酸(Thermo Fisher公司)均為色譜純，超凈水自制，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS系統(tǒng)：Thermo fisher U3000超高性能液相色譜儀，美國Thermo Scientific公司；Q Exactive PlusTMOrbitrap質(zhì)譜系統(tǒng)，配有加熱電噴霧電離源，美國Thermo Scientific公司。

2 方法

2.1 分析及鑒定

2.1.1液相條件 UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS液質(zhì)聯(lián)用儀：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(B)-乙腈(A)。梯度洗脫：0～10 min，100% B；10～20 min，100%～70% B；20～25 min，70%～60% B；25～30 min，60%～50% B；30～40 min，50%～30% B；40～45 min，30%～0% B；45～60 min，0% B；60～60.1 min，0%～100% B；體積流量為0.2 mL·min-1；柱溫30 ℃；DAD檢測器，波長范圍為200～400 nm；進樣體積5 μL。

2.1.2質(zhì)譜條件 UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS液質(zhì)聯(lián)用儀：離子源為加熱電噴霧電離源(HESI)，采用正負離子模式檢測；質(zhì)子掃描范圍m/z100～1 500；噴霧電壓為3.2 kV；離子傳輸管溫度為320 ℃，輔氣加熱器溫度為350 ℃；鞘氣體積流量為40 arb，輔助氣體積流量為15 arb；MS分辨率R為70 000，MS/MS分辨率R為17 500。

2.2 網(wǎng)絡藥理學分析

2.2.1藥物成分潛在靶標預測 借助SwissADME(http://www.swissadme.ch/)數(shù)據(jù)平臺對已鑒定的化學成分進行篩選，篩選條件為類藥性(drug-likeness，DL)(5項中至少有3個“yes”)和胃腸道吸收(gastrointestinal absorption，GI)為“high”。再借助Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)平臺，對符合篩選條件的化合物進行靶點預測。利用 UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)規(guī)范與活性成分相關的靶點蛋白，獲得靶點對應的基因名。

2.2.2疾病靶點篩選 在Genecards(https://www.genecards.org)和Drugbank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫中輸入關鍵詞“novel coronavirus pneumonia”，搜索疾病靶點，同時運用Venny平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將樹舌靈芝藥效成分調(diào)控的靶點與疾病的治療靶點取交集，得到樹舌靈芝防治COVID-19的交集靶點。

2.2.3核心靶點及PPI網(wǎng)絡分析 通過String數(shù)據(jù)庫(hops://stringdb.org/)分析樹舌靈芝防治COVID-19的交集靶點，構建靶點蛋白間的互做網(wǎng)絡關系，將構建的PPI網(wǎng)絡分析結果導入Cytoscape 3.8.0，根據(jù)度(degree，DC)、度介中心度(Betweenness Centrality，BC)和接近中心度(Closeness Centrality，CC)3個因素篩選網(wǎng)絡中大于平均數(shù)的節(jié)點，進而確定核心靶點。

2.2.4靶點功能通路富集分析 借助于DAVID數(shù)據(jù)庫(hops://david.ncifcrgov/)對疾病相關的藥物活性成分靶點進行GO與KEGG富集分析，設定閾值P<0.05進行篩選，對相互作用的靶點進行功能富集分析，整理分析數(shù)據(jù)，選取前20個條目，利用R語言繪制柱狀圖與氣泡圖，用Cytoscape 3.8.0對網(wǎng)絡進行可視化。

2.2.5“成分-靶點”的分子對接 從RSCB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中下載ACE2(PDB ID：IR42)、NSP15(PDB ID：6W01)、RBD of S protein(PDB ID：6M0J)及Mpro/3CLpro(PDB ID：6WNP)的蛋白質(zhì)晶體結構[9]，使用Auto Dock Tools1.5.6軟件刪除晶體結構中的水分子，進行加氫處理，并且計算蛋白質(zhì)的電荷，最后保存為pdbqt格式文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取小分子化合物的3D結構的SDF格式文件。利用PyRx軟件(https://pyrx.sourceforge.io/)進行分子對接。

3 結果

3.1 樹舌靈芝化學成分分析在上述色譜及質(zhì)譜條件下，應用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS獲取相應色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用Compound discover 3.1.0.305軟件選取mzVault Best Match大于80的物質(zhì)進行分析，根據(jù)色譜提供的準確相對分子量計算化合物的精確分子式，最終鑒定了化合物62個(Tab 1)，包括酚酸、香豆素、脂肪酸、萜和生物堿等多種成分。

Tab 1 Identification analysis of components of Ganoderma applanatum

Tab 2 Basic information of some chemical constituents in Ganoderma applanatum

3.2 網(wǎng)絡藥理學預測結果

3.2.1活性成分和疾病靶點篩選 通過Swiss ADME數(shù)據(jù)平臺，對已鑒定的62個化學成分進行篩選，依據(jù)DL和GI的篩選條件，共篩選出30個主要活性化合物(Tab 2)。

采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)平臺對30個活性化合物進行靶點預測，去除重復靶點后，共得到樹舌靈芝主要活性化合物潛在靶標593個。通過Genecards和Drugbank數(shù)據(jù)庫，搜索到455個潛在作用靶點。將藥物有效成分的靶點與疾病的靶點交叉，最終得到97個可能與樹舌靈芝防治COVID-19相關的靶點。

3.2.2核心靶點及PPI網(wǎng)絡分析 為了更好地分析樹舌靈芝防治COVID-19的作用機制，運用String數(shù)據(jù)庫構建了97個靶點的PPI網(wǎng)絡，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.0，進行網(wǎng)絡分析，包含97個節(jié)點和1 040條邊。根據(jù)3個拓撲參數(shù)對PPI網(wǎng)絡中所有節(jié)點進行分析，選取DC>23、BC>0.009和CC>0.541的32個靶點作為核心靶點，核心靶點相關信息見Tab 3。

Tab 3 Information on 32 core targets

3.2.3GO分析及KEGG通路富集分析 為了進一步分析候選靶點的可能作用，通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析，得到GO條目217個(P<0.05)，包含生物過程(BP)條目158個、細胞組成(CC)條目19個和分子功能(MF)條目40個。排名前15的BP條目見Fig 1。KEGG通路富集分析篩選得到89條信號通路(P<0.05)，排名前20的通路及分類見Fig 2。

3.2.4樹舌靈芝化合物-關鍵靶點-通路構建 使用 Cytoscape3.8.0軟件對樹舌靈芝30個核心成分及對應的32個核心靶點，核心靶點對應的20條主要通路進行分析，構建樹舌靈芝防治COVID-19對應的核心化合物-核心靶點-通路圖(Fig 3)。

Fig 1 GO biological process analysis of effective targets of compounds from Ganoderma applanatum

Fig 2 KEGG enrichment analysis of effective targets of Ganoderma applanatum

Fig 3 Core compound-core target-pathway diagram

3.2.5分子對接研究 將上述核心化合物及2種臨床治療藥物分別與IR42和6W01、6M0J和6WNP靶標蛋白進行分子對接，從另一層面分析核心化合物防治COVID-19的可行性(Fig 4)。分子對接結合能越小，說明受體和配體之間的親和力越大。

Fig 4 Heatmap based on binding energy among proteins and phytochemicals

4 討論

本研究利用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS系統(tǒng)，快速鑒定到62個化合物，30個化合物GI和DL較好，其中含7個酚酸和4個香豆素。采用網(wǎng)絡藥理學方法構建藥物活性成分-靶點-通路等網(wǎng)絡，探討樹舌靈芝防治COVID-19的藥用成分、潛在靶點和作用機制。在30個化學成分中，咖啡酸、七葉亭和瑞香素等在網(wǎng)絡中具有重要作用。據(jù)報道，咖啡酸具有抗單純皰疹病毒、甲型流感和犬瘟熱病毒等活性。Mani等[10]對有望抑制人類冠狀病毒的化合物進行了綜述，其中包含咖啡酸。七葉亭可抑制HBV轉染人肝癌細胞系(HepG2.2.15)中HBV抗原和HBV DNA的表達，亦可抑制體內(nèi)HBV復制[11]。瑞香素具有一定的抗腸道病毒71的作用[12]。Maurya等[13]發(fā)現(xiàn)多個香豆素類物質(zhì)與SARS CoV-2的甲基轉移酶、核糖核酸內(nèi)切酶和主要蛋白酶等受體蛋白可以很好的對接，可能會成為COVID-19感染有效的抑制劑。因此，樹舌靈芝的這些酚酸和香豆素類成分可能會在防治COVID-19中發(fā)揮重要作用。

經(jīng)網(wǎng)絡藥理學預測，IL-6、PTGS2和MAPK1等靶點具有重要地位。大量的數(shù)據(jù)顯示細胞因子風暴是COVID-19患者一個重要的死亡原因。IL-6在細胞因子釋放綜合征中起重要作用，阻斷IL-6信號轉導通路有望成為治療重癥COVID-19患者的新方法[14]。MAPK1屬于MAPK家族，MAPK信號通路可通過調(diào)節(jié)炎性反應、促進細胞凋亡和參與血管新生等多種途徑在肺纖維化方面發(fā)揮著重要作用[15]。PTGS2(COX2)是主要的前列腺素合成酶，前列腺素E作用于下丘腦，可引發(fā)發(fā)熱，亦具有血管擴張劑和抑制血小板聚集的作用；而凝血是COVID-19嚴重并發(fā)癥，抑制PTGS2，可能會減少COVID-19相關的并發(fā)癥[16]。因此，樹舌靈芝的核心成分可能通過作用于IL-6、PTGS2和MAPK1等靶點對COVID-19起到防治作用。

通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)前20條通路中，病毒傳染性病占了7條，且PI3K-Akt、FoxO、TNF等多條信號通路與肺癌、肺部損傷以及氣道炎癥等肺部疾病密切相關[17]。其中PI3K-Akt通路最為顯著，該通路參與病毒進入細胞的各個方面和免疫應答的發(fā)展。已有研究表明，SARS-CoV-2的內(nèi)吞作用是通過網(wǎng)格蛋白介導的通路發(fā)生的，抑制PI3K/AKT途徑可以抑制利用網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用的病毒的進入，并且抑制PI3K/AKT信號通路可抑制NF-κB和AP-1，最終降低IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達。因此，可以推測樹舌靈芝可能可以通過抑制PI3K/AKT信號通路，來抑制病毒進入細胞和抑制炎癥，進而起到COVID-19的防治作用。

ACE2是SARS-CoV-2進入細胞的主要受體，一旦病毒與ACE2結合，它的內(nèi)吞作用與血腦屏障病毒一起發(fā)生[18]。3種SARS-CoV-2蛋白，即NSP15、RBD of S protein和Mpro/3CLpro，是SARS-CoV-2感染宿主細胞或自我復制的關鍵蛋白。故將樹舌靈芝中核心化學成分及西藥與4個靶點進行分子對接比較，結果顯瑞香素和1,4-二羥基-2-萘甲酸與NSP15和RBD of S protein的結合能分別為：-8.1 kJ·mol-1、-8.4 kJ·mol-1，均低于臨床藥物洛匹那韋和利巴韋林；小白菊內(nèi)酯和1,4-二羥基-2-萘甲酸與Mpro/3CLpro和ACE2結合能分別為：-6.6 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1，略高于洛匹那韋，但低于利巴韋林。其他核心化合物如七葉亭和咖啡酸等的結合能與化學藥相比，也有不同程度的降低。通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術結果表明樹舌靈芝對于治療COVID-19應該有較好的療效。

綜上所述，基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS技術，本實驗準確快速地對樹舌靈芝中的化學成分進行了識別，較全面的揭示了樹舌靈芝中的主要活性成分。同時基于網(wǎng)絡分析與分子對接技術，以樹舌靈芝為研究對象，對其主要化學成分、作用靶標及其關鍵藥效成分與ACE2和3種SARS-CoV-2蛋白的結合能力進行分析，初步闡述了樹舌靈芝防治COVID-19可能的物質(zhì)基礎與作用機制，為樹舌靈芝抗COVID-19的進一步藥效和臨床療效試驗研究奠定基礎。