馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥對(duì)糖尿病小鼠骨代謝的影響

戴 璇，葉紫夢(mèng)瑋，劉亞鴿 ，陳貝貝，朱如愿，夏兵可，張 浩，王新祥，王麗麗，張東偉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)1.中醫(yī)學(xué)院糖尿病研究中心，北京 100029，2.東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100078，3.中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 100029)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人類(lèi)生活方式的轉(zhuǎn)變，肥胖和超重人群逐漸增加，肥胖相關(guān)疾病已成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。研究顯示，肥胖會(huì)影響胰島素敏感性，從而導(dǎo)致2型糖尿病等疾病，是全球慢性疾病的主要危險(xiǎn)因素之一[1]。肥胖可能會(huì)誘發(fā)糖尿病，而嚴(yán)重的糖尿病會(huì)增加骨質(zhì)疏松和脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，其原因可能是機(jī)體血糖升高，引起抗氧化酶的糖基化，使機(jī)體抗氧化能力下降，活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增多，引起氧化應(yīng)激水平的增加[2]，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)流失。

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)及其受體(RAGE)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路是與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的經(jīng)典通路之一。AGEs是葡萄糖對(duì)蛋白質(zhì)的自發(fā)性非酶糖化和糖代謝的產(chǎn)物，過(guò)度積累會(huì)引起許多病理變化[3]。骨組織中，AGEs一方面可以通過(guò)與其受體RAGE結(jié)合，促進(jìn)組織細(xì)胞生成ROS，激活NF-κB參與的炎癥等反應(yīng)，從而刺激骨吸收并抑制骨形成；另一方面，AGEs可影響骨材料構(gòu)成誘發(fā)骨質(zhì)量下降[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，馬錢(qián)苷主要來(lái)源于藥材山茱萸，具有降血糖和調(diào)節(jié)骨代謝等多種藥理作用[5-6]，馬錢(qián)苷通過(guò)抑制AGEs通路，可減輕氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡引起的代謝異常[7]。含黃連素的主要藥材黃連具有抗糖尿病和抗骨質(zhì)疏松等作用。Xie等[8]提出黃連素可以促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，恢復(fù)糖尿病大鼠的骨代謝穩(wěn)態(tài)。本課題組前期研究表明，含有馬錢(qián)苷和黃連素的降糖消渴顆粒能抑制KKAy小鼠的骨丟失[9]。但馬錢(qián)苷和黃連素聯(lián)合用藥能否通過(guò)調(diào)控AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路抑制糖尿病誘發(fā)的骨丟失作用，目前還未知。因此，本研究以高脂飲食誘發(fā)的糖尿病小鼠模型為研究對(duì)象，探討骨組織中AGEs/RAGE/NF-κB通路的變化及降糖消渴顆粒的主要成分馬錢(qián)苷與黃連素對(duì)其的影響，以闡釋其治療糖尿病并發(fā)的骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，為中藥防治糖尿病性骨質(zhì)疏松提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性ICR小鼠,(20±2)g，購(gòu)自北京斯貝福動(dòng)物科技有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合格證號(hào)SYXK(京)2016-0038，恒定室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，12 h/12 h光暗周期。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有小鼠可自由飲用水及食物，籠具、墊料、飲用水等定期更換、清潔。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器拜安康血糖儀及配套血糖檢測(cè)試紙(德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；EchoMRI-100H身體成分分析儀(美國(guó)EchoMRI國(guó)際醫(yī)療設(shè)備公司)；RM 2255輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica Biosystems有限公司)；Olympus BX53倒置熒光顯微鏡(日本Olympus有限公司)；FLUO star Omega多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG Labtech公司)；Azure c500凝膠成像儀(美國(guó)Azure Biosystems股份有限公司)；小動(dòng)物活體micro-CT影像系統(tǒng)(美國(guó)PerkinElmer公司)；CT3質(zhì)構(gòu)儀(美國(guó)brookfield公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)。

1.3 藥物與試劑馬錢(qián)苷(馬錢(qián)素)、黃連素(鹽酸小檗堿)(成都瑞芬思生物科技有限公司，MD10B、Y035)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，H20023370)；總膽固醇(total cholesterol，TC，A111-1-1)、三酰甘油(triacylglycerol，TG，A110-1-1)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C，A112-1-1)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C，A113-1-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，A003-1-2)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC，A015-3-1)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；NF-κB-p65、p-NF-κB-p65(ser536)抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，WL01980、WL02169)；AGEs、RAGE、Cathepsin K抗體(上海艾博抗貿(mào)易有限公司，ab23722、ab37647、ab19027)；ECL超敏發(fā)光液(北京索萊寶生物科技有限公司，P0018FS)；骨組織抗原修復(fù)液(上海舜百生物科技有限公司，SBT10013)；高脂飼料，包括45%脂肪、20%蛋白質(zhì)和35%碳水化合物(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，MD12032)；普通飼料采用AIN-96G全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料(北京斯貝福生物技術(shù)有限公司)。

1.4 動(dòng)物模型構(gòu)建用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)ICR小鼠12周[10]，選取體質(zhì)量增加≥20%、空腹血糖>7.8 mmol·L-1的小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將符合條件的小鼠隨機(jī)分為高脂飲食誘導(dǎo)糖尿病模型組(HFD，n=10)、二甲雙胍陽(yáng)藥組(Met，n=10)和馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合治療組(L+B，n=10)，3組小鼠均用高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。陽(yáng)藥組小鼠灌服二甲雙胍(100 mg·kg-1)，治療組小鼠灌服馬錢(qián)苷與黃連素(馬錢(qián)苷20 mg·kg-1，黃連素50 mg·kg-1)，模型組小鼠灌服等量的水，另外再取10只正常小鼠灌服等量水作為對(duì)照(正常飼料飼養(yǎng))，連續(xù)給藥10周。

1.5 取材及樣品制備摘眼球取血，收集血液樣本用于血清學(xué)檢測(cè)。同時(shí)，迅速剝離小鼠股骨和脛骨，部分骨組織用4%多聚甲醛固定做組織學(xué)分析，剩余在液氮中冷凍后置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1體質(zhì)量及空腹血糖 實(shí)驗(yàn)期間每周記錄一次小鼠體質(zhì)量及空腹血糖，取材前用身體成分分析儀檢測(cè)小鼠體脂并記錄。

1.6.2口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT) 小鼠空腹12 h后進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)。每只小鼠灌胃給予葡萄糖溶液(2 g·kg-1)，分別檢測(cè)灌胃后0、30、60、90、120 min的血糖，繪制血糖變化折線圖，并計(jì)算曲線下面積(area under the curve,AUC)。

1.6.3Micro-CT 將脛骨固定于micro-CT影像系統(tǒng)成像床上，設(shè)置電壓為70 kV，電流為60 μA，成像視野36 mm × 36 mm，掃描模式為14 min高分辨率，使用相應(yīng)X射線劑量進(jìn)行掃描。成像結(jié)果使用Analyze 2.0軟件進(jìn)行分析。分別選取骨骺端生長(zhǎng)板以下75層[11]以及骨干中段[12]作為特定興趣區(qū)域，分析以下參數(shù)：(1)骨小梁：節(jié)段骨表面與節(jié)段骨體積之比(bone surface/bone volume，BS/BV)、骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)；(2)皮質(zhì)骨：皮質(zhì)骨骨密度(bone mineral density，BMD)、骨膜包膜內(nèi)的總橫截面積(total cross-sectional area，Tt.Ar)和骨膜周長(zhǎng)(periosteal perimeter，Ps.Pm)。

1.6.4三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn) 利用CT3質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定脛骨的生物力學(xué)性能，將模具的間距設(shè)置為12 mm，固定好脛骨，保持脛骨中心、兩支點(diǎn)中心和加載點(diǎn)在同一位置，然后以0.5 mm·s-1的下降速度設(shè)置加載負(fù)荷，得到最大載荷參數(shù)值。

1.6.5ATR傅里葉變換紅外光譜檢測(cè) 脛骨去骨髓后研磨成細(xì)粉并干燥。取微量細(xì)粉置于晶體表面，開(kāi)始檢測(cè)。對(duì)每個(gè)樣品采集紅外光譜，利用origin軟件處理光譜，對(duì)以下參數(shù)進(jìn)行分析：(1)膠原成熟度(collagen maturity/collagen cross-link ratio，XLR)反映成熟和不成熟類(lèi)型交聯(lián)的相對(duì)數(shù)量，即氨基化合物 Ⅰ 在1 660 cm-1和1 690 cm-1的峰高比值；(2)礦物 ∶基質(zhì)(mineral ∶matrix ratio)表示膠原基質(zhì)的礦化程度，即ν1-ν3PO4和酰胺Ⅰ的峰面積比；(3)碳酸鹽 ∶磷酸鹽(carbonate ∶phosphate ratio)表示碳酸鹽取代礦物晶格的程度，即ν1-ν3PO4與ν2CO3的峰面積比；(4)礦物結(jié)晶度(mineral maturity/crystallinity，MMC)反映晶體大小和化學(xué)組成，即化合物在1 030 cm-1和1 020 cm-1的峰高比值[13]。

1.6.6血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) TG、TC、HDL、LDL以及MDA、SOD、T-AOC的測(cè)定采用商品化試劑盒，并按照生產(chǎn)說(shuō)明書(shū)操作。

1.6.7HE染色 取小鼠股骨制作石蠟切片，按照陳貝貝等[14]提供的方法進(jìn)行HE染色，骨組織切片于60 ℃烘箱中烤3 h，然后按常規(guī)程序進(jìn)行HE染色，封片后顯微鏡下觀察骨小梁的病理特征并拍照記錄。

1.6.8TRAP染色 取無(wú)水乙酸鈉、酒石酸、冰醋酸配置成基礎(chǔ)溶液，預(yù)熱至37 ℃。骨組織石蠟切片，在含萘酚AS-BI磷酸鹽溶液和基礎(chǔ)溶液的染色缸中37 ℃孵育45 min。然后將亞硝酸鈉與副品紅配成的棕色染料倒入另一個(gè)含基礎(chǔ)溶液的染色缸中并放入未清洗的切片，室溫孵育6 min，蘇木精復(fù)染，再用氨水返藍(lán)，清洗后封片。

1.6.9免疫組化測(cè)定(IHC) 取股骨石蠟切片，按照王麗麗等[15]提供方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)述如下：10%山羊血清封閉，分別孵育AGEs(1 ∶200)、RAGE(1 ∶100)、p-NF-κB-p65(1 ∶100)、NF-κB-p65(1 ∶100)、Cathepsin K(1 ∶50)抗體，4 ℃過(guò)夜。次日滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB溶液避光顯色，蘇木精復(fù)染，封片后置于顯微鏡下觀察、拍照，利用Image-Pro Plus軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥能抑制糖尿病小鼠體質(zhì)量、體脂率和空腹血糖的增加如Fig 1A-C所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的體質(zhì)量、體脂率和空腹血糖均增加明顯(P<0.05)。與模型組相比，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合給藥2周后體質(zhì)量開(kāi)始明顯降低(P<0.05)，給藥10周后小鼠體脂率及空腹血糖明顯下降(P<0.05)。這說(shuō)明，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥可有效降低糖尿病小鼠的血糖和體脂率，抑制體質(zhì)量增加。

2.2 馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥能改善糖尿病小鼠的血脂水平及糖耐量如Fig 2A-D，與正常組相比，模型組小鼠血清TG、TC、LDL水平明顯增加，HDL水平明顯降低(P<0.05)。聯(lián)合給藥干預(yù)10周后明顯逆轉(zhuǎn)了糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL和HDL水平(P<0.05)。如Fig 2E所示，第10周各組小鼠的糖耐量測(cè)試結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠的血糖值在0、30、60、90、120 min均處于較高水平，而聯(lián)合治療組小鼠各時(shí)間點(diǎn)的血糖水平較模型組明顯降低(P<0.05)。Fig 2F所示，計(jì)算第10周OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的AUC，模型組小鼠AUC相較正常組升高了60.9%(P<0.05)，而陽(yáng)藥組和馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合治療組小鼠相較模型組AUC分別降低了26.5%和32.6%(P<0.05)。以上結(jié)果表明，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠血脂水平紊亂，葡萄糖耐量受損，而馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥可以改善糖尿病小鼠的血脂水平和修復(fù)受損的糖耐量。

Fig 1 Effects of combined administration of loganin and berberine on body weight (A),body fat content (B)and fasting blood-glucose,FBG (C)in diabetic mice *P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

Fig 2 Effects of combined administration of loganin and berberine on glucose and serum lipid parameters in diabetic n=10)A:Serum TG;B:serum TC;C:Serum LDL;D:Serum HDL;E:OGTT at 10th week;F:AUC of OGTT at 10th week.*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

2.3 馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥能改善糖尿病小鼠的骨微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)性能如Fig 3A所示，正常組小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)完整，模型組結(jié)構(gòu)稀疏，陽(yáng)藥組和馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合治療組小鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)得到改善。CT分析結(jié)果(Fig 3B-G)也與此一致：與正常組比較，模型組小鼠脛骨的Tb.Sp明顯升高(P<0.05)，BS/BV、Ps.Pm、BMD降低(P<0.05)，Tt.Ar、Tb.N亦有降低趨勢(shì)；與模型組比較，聯(lián)合治療10周后小鼠的Tb.Sp明顯下降(P<0.05)，BS/BV、Ps.Pm、BMD、Tt.Ar、Tb.N明顯升高(P<0.05)。小鼠脛骨生物力學(xué)的測(cè)定結(jié)果如Fig 3H所示，相較于正常組，模型組小鼠最大載荷明顯降低(P<0.05)；給藥干預(yù)10周后，與模型組小鼠比較，聯(lián)合治療組小鼠的最大載荷明顯升高(P<0.05)。以上結(jié)果提示，糖尿病小鼠骨微結(jié)構(gòu)受損，骨生物力學(xué)下降；馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合給藥后，其骨微結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度得到明顯改善。

2.4 馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥能改善糖尿病小鼠的骨材料構(gòu)成骨材料構(gòu)成也是評(píng)價(jià)骨質(zhì)量的重要因素，F(xiàn)ig 4A是各組小鼠骨質(zhì)的紅外光譜圖，其分析結(jié)果如Fig 4B-E。與正常組比較，模型組小鼠的膠原礦化程度、碳酸鹽替代程度、礦物成熟度以及膠原蛋白成熟度都明顯升高(P<0.05)，給藥干預(yù)10周后各項(xiàng)指標(biāo)均下降(P<0.05)。這些結(jié)果表明，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合治療能改善糖尿病小鼠的骨材料構(gòu)成。

2.5 馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥能改善糖尿病小鼠骨組織病理改變HE染色顯示(Fig 5A)，正常組小鼠股骨中骨小梁致密，厚度較大，未出現(xiàn)脂滴樣空泡，而模型組小鼠骨小梁稀疏，厚度降低，存在大量脂滴樣空泡。陽(yáng)藥組及聯(lián)合治療組小鼠股骨的整體病變程度低于模型組，提示馬錢(qián)苷與黃連素能夠改善糖尿病小鼠骨微結(jié)構(gòu)。TRAP染色結(jié)果表明(Fig 5B)，與正常組小鼠比較，模型組小鼠股骨中破骨細(xì)胞數(shù)目明顯增加，藥物聯(lián)合干預(yù)后數(shù)目降低(P<0.05)。這說(shuō)明，糖尿病小鼠破骨細(xì)胞的骨吸收活性增加，骨微結(jié)構(gòu)被破壞，而馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥可以改善糖尿病小鼠骨組織病理變化，可能與其抑制破骨細(xì)胞的骨吸收有關(guān)。

2.6 馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥能降低糖尿病小鼠血清氧化應(yīng)激水平MDA、SOD、T-AOC用于評(píng)估機(jī)體氧化損傷的程度。如Fig 6A-C所示，與正常組相比，模型組小鼠血清MDA水平明顯升高(P<0.05)，血清SOD和T-AOC水平明顯降低(P<0.05)；而與模型組相比，聯(lián)合治療組小鼠血清MDA和SOD水平明顯改善(P<0.05)，T-AOC水平亦有升高趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明，糖尿病小鼠血清氧化應(yīng)激水平升高，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥能減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Fig 3 Effects of combined administration of loganin and berberine on bone microstructure and biomechanics in diabetic n=10)A:Micro-CT scanning stereogram of tibial metaphysis in mice;B:Trabecular bone separation,Tb.Sp;C:Ratio of segmental bone surface to segmental bone volume,BS/BV;D:Periosteal perimeter,Ps.Pm;E:Bone mineral density,BMD;F:Number of bone trabeculae,Tb.N;G:Total cross-sectional area in the periosteum,Tt.Ar;H:Maximum load/bone volume.*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

Fig 4 Effects of combined administration of loganin and berberine on bone material properties in diabetic n=10)A:The infrared spectra;B:Mineral:matrix ratio;C:Carbonate:phosphate ratio;D:Mineral maturity (1 030 cm-1:1 020 cm-1);E:Collagen maturity/Collagen cross-link ratio (1 660 cm-1:1 690 cm-1).*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

Fig 5 Effects of combined administration of loganin and berberine on bone histopathological changes in diabetic miceA:HE staining,pink -bone trabeculae,purple -bone marrow;B:TRAP staining,red -osteoclasts (arrow),dark blue -bone marrow,light blue -bone.

Fig 6 Effects of combined administration of loganin and berberine on serum oxidative stress markers in diabetic n=10)A:MDA;B:SOD;C:T-AOC.*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

2.7 馬錢(qián)苷與黃連素可能通過(guò)調(diào)節(jié)AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝如Fig 7A、B所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠股骨中AGEs和RAGE表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而與模型組小鼠相比，藥物干預(yù)10周后其水平明顯降低(P<0.05)。NF-κB的活化是指p65亞基被磷酸化激活后向核內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)揮生理作用。如Fig 7C和7D所示，模型組小鼠股骨中NF-κB-p65與p-NF-κB-p65較正常組小鼠明顯升高(P<0.05)，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合治療的小鼠其水平明顯降低(P<0.05)。這些結(jié)果提示，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合用藥能明顯抑制糖尿病小鼠體內(nèi)AGEs的積累，從而抑制ROS誘發(fā)的NF-κB活化。

免疫組化染色測(cè)定各組小鼠組織蛋白酶K(Cathepsin K)的表達(dá)量如Fig 7E所示，與正常組相比，模型組小鼠股骨中Cathepsin K表達(dá)明顯增多(P<0.05)，聯(lián)合治療組小鼠Cathepsin K的表達(dá)較模型組小鼠明顯降低(P<0.05)。這說(shuō)明，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合能降低Cathepsin K的表達(dá)。以上免疫組化染色結(jié)果表明，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合可以調(diào)節(jié)Cathepsin K的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，從而改善糖尿病小鼠的骨質(zhì)量。

Fig 7 Expressions of AGEs,RAGE,NF-κB-p65,p-NF-κB-p65 and Cathepsin K in femurs of diabetic mice determined by n=10)A:Immunohistochemical staining and analysis of AGEs;B:Immunohistochemical staining and analysis of RAGE;C:Immunohistochemical staining and analysis of NF-κB-p65;D:Immunohistochemical staining and analysis of p-NF-κB-p65;E:Immunohistochemical staining and analysis of Cathepsin K.*P<0.05 vs model group;#P<0.05 vs control group.

3 討論

本研究利用經(jīng)典的高脂飲食誘導(dǎo)法復(fù)制糖尿病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠成模后體質(zhì)量增加，體脂率升高，小鼠血糖水平升高，糖耐量降低，血脂紊亂，血清氧化應(yīng)激水平升高；同時(shí)，其骨微結(jié)構(gòu)被破壞，骨強(qiáng)度降低，骨材料構(gòu)成改變；破骨細(xì)胞數(shù)目明顯增加；AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及Cathepsin K表達(dá)增加，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合治療小鼠10周后，可明顯逆轉(zhuǎn)上述改變，從而調(diào)節(jié)小鼠的骨代謝。

本研究通過(guò)分析小鼠骨微結(jié)構(gòu)、骨強(qiáng)度等一般情況，發(fā)現(xiàn)糖尿病骨質(zhì)疏松小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏，硬度下降，呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。馬錢(qián)苷與黃連素干預(yù)后能明顯升高BS/BV、Ps.Pm、BMD、Tt.Ar、Tb.N，降低Tb.Sp，提示馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合干預(yù)具有調(diào)節(jié)骨代謝紊亂，改善骨結(jié)構(gòu)的作用。Doucette等[17]提出高脂喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠12周后皮質(zhì)骨無(wú)明顯變化。而本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠22周后皮質(zhì)骨BMD及Ps.Pm有明顯改變，可能是因?yàn)榍捌诟咧嬍硨?duì)骨小梁的影響更明顯，而本實(shí)驗(yàn)中小鼠高血糖癥狀進(jìn)一步加重骨代謝紊亂。有研究報(bào)道，隨著骨組織年齡增加，礦物基質(zhì)比、碳酸鹽取代礦物晶格的程度、MMC以及XLR都會(huì)升高[13]。本實(shí)驗(yàn)顯示高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠脛骨骨質(zhì)在22周后也得出一致的結(jié)果，聯(lián)合給藥后礦物基質(zhì)比、碳酸鹽取代礦物晶格的程度、MMC以及XLR都明顯下降，治療作用明顯，提示馬錢(qián)苷與黃連素具有調(diào)控骨材料構(gòu)成的作用。

AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路在氧化應(yīng)激和骨代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，可以調(diào)控ROS的產(chǎn)生及骨吸收活性。研究發(fā)現(xiàn)，馬錢(qián)苷可抑制AGEs通路，減少ROS的產(chǎn)生[7]。此外，馬錢(qián)苷具有較強(qiáng)的抑制NF-κB信號(hào)通路的作用[18]。體外研究也證實(shí)黃連素具有抗氧化作用，在一定程度上可抑制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[8]。在本研究中，通過(guò)檢測(cè)血清MDA、SOD和T-OAC，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠氧化應(yīng)激水平較高，骨組織也發(fā)生明顯病變。而馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)合干預(yù)糖尿病小鼠10周后，血清MDA降低，SOD、T-AOC升高；HE染色、TRAP染色、IHC結(jié)果均表明馬錢(qián)苷與黃連素能夠改善骨質(zhì)量，減輕骨組織空泡化等病變，明顯降低AGEs、RAGE、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65和破骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物TRAP及Cathepsin K的表達(dá)水平，具有減輕機(jī)體氧化應(yīng)激、恢復(fù)骨代謝平衡的作用。以上研究結(jié)果表明，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)用可通過(guò)調(diào)節(jié)AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路，降低糖尿病小鼠機(jī)體氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而改善骨結(jié)構(gòu)與骨強(qiáng)度，發(fā)揮骨保護(hù)作用。

綜上所述，馬錢(qián)苷與黃連素聯(lián)用可以抑制骨吸收活性，進(jìn)而改善骨質(zhì)量，其作用機(jī)制與AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究為馬錢(qián)苷與黃連素及其復(fù)方抗糖尿病性骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，也為其他降糖藥影響骨代謝的研究提供了思路。